עיבוד רגלי חרקים למיקרוסקופ פלואורסצנטי: שיטה לשימור מבנים עצביים-שריריים לדימות

- כדי להתחיל, לטבול חרקים מורדמים בתמיסת אתנול 70% כדי להפחית את ההידרופוביות של הקוטיקולה. לאחר מכן, שטפו וחדרו את הרקמה במי מלח חוצצים פוספט המכיל חומר ניקוי למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר חדירת רקמות במהלך הקיבוע.

לאחר מכן, להסיר את הראש והבטן מבית החזה. השתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ עדין על צומת קוקסה-בית החזה, ולנתק את הרגל. הניחו בזהירות את הרגליים בתמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח למשך הלילה כדי לאפשר לה לחדור לרקמה. Paraformaldehyde מתקן רקמות על ידי cross-linking חלבונים.

לאחר מכן, להסיר את פתרון הקיבוע ולשטוף את הרקמה מספר פעמים עם מלוחים חוצץ פוספט המכיל דטרגנט. לפני ההרכבה, הניחו את הרגליים במאגר הרכבה טהור או מדולל מעט למשך יום אחד לפחות כדי לספק מספיק זמן למאגר להיכנס לרקמה.

לבסוף, הר את הרגליים בטיפה של מדיום הרכבה. השתמשו במרווח בין מגלשת המיקרוסקופ לבין הכיסוי כדי למנוע נזק לדגימה, ואבטחו את התושבת באמצעות לק.

בדוגמה הבאה, נראה את הדיסקציה, הקיבוע וההרכבה של רגלי Drosophila melanogaster.

- התחל על ידי מילוי המספר המתאים של בארות בצלחת זכוכית multiwell עם 70% אתנול. השתמשו במברשת כדי להוסיף 15 עד 20 זבובים מורדמים של פחמן דו חמצני מכל גיל או מין לכל באר, וטפחו בעדינות את הזבובים לתוך האתנול עד שהם שקועים לחלוטין.

לאחר לא יותר מדקה, שטפו את הזבובים שלוש פעמים בתמיסת חומר פעיל שטח נויונית 0.3% במי מלח חוצצים פוספט למשך 10 דקות לפחות בכל כביסה. לאחר השטיפה האחרונה, השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הראש והבטן של כל זבוב מבלי לפגוע בקטע בית החזה או ברגליים, והשתמשו בקצה של זוג מלקחיים עדינים כדי להפעיל לחץ עדין אך חזק על צומת קוקסה-בית החזה כדי לנתק רגל אחת ממקטע בית החזה.

הניחו את הרגליים בבאר אחת של צלחת רב-באר חדשה, המכילה 4% פרפורמלדהיד טרי על קרח, לדגירת לילה ב-4 מעלות צלזיוס.

- חשוב לדחוף את הרגליים בעדינות לתוך חיץ הקיבוע מבלי לתת להן לצוף כדי להשיג רגליים קבועות היטב.

- למחרת, שטפו את הרגליים חמש פעמים בתמיסת חומר ניקוי פעיל שטח לא יוני 0.3% במשך 20 דקות בכל כביסה. לאחר השטיפה האחרונה, החלף את חומר הניקוי באמצעי הרכבה ושמור את הרגליים במדיום ההרכבה למשך 24 שעות לפחות.

למחרת, הוסיפו כ-20 מיקרוליטר של 70% גליצרול ליד הקצה המצופה של מגלשת מיקרוסקופ הזכוכית וכסו את הגליצרול בכיסוי של 22 על 22 מילימטר. לאחר מכן, הוסף קו של כ -10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה מימין לתלוש הכיסוי והחל קו שני של 30 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה מימין לקו 10 מיקרוליטר.

בעזרת מלקחיים עדינים, מעבירים רגל אחת מהצלחת הרב-באר בטיפת מדיום לרצועה של 10 מיקרוליטר של תווך הרכבה בכיוון חיצוני למעלה או למטה. חזרו על הפעולה עד ששש עד שמונה רגליים הותקנו ויישרו, והניחו את הכיסוי השני מעל הרגליים כך שהכיסוי השני יישען מעט על הכיסוי הראשון. לאחר מכן, השתמשי בלק בכל פינה של הכיסויים כדי לאבטח אותם במקומם.