הסרה מכנית של קרום כוריון וויטלין: שיטה להכנת ביציות דרוזופילה להשגחה ישירה

- להתחיל עם ביציות בשלות משחלות קבועות בתמיסת מלח. ביציות בוגרות נושאות קליפות ביצים המורכבות מכוריון חיצוני וקרום ויטלין פנימי.

כדי להסיר באופן מכני את קרום הכוריון והויטלין, הניחו את הביציות בין החלקים החלביים של שתי שקופיות שטופלו מראש. הזיזו את השקופית העליונה בתנועות ישרות קדימה ואחורה כדי ליצור חיכוך שמגלגל את הביציות.

כעת, הזיזו את המגלשה העליונה בזווית קלה כדי לגלגל את הביציות לכיוון אחר. הימנעות מתנועה מעגלית, הגדל זווית זו בדרגות קצרות עד שהשקופית העליונה תזוז בניצב לשקופית התחתונה. תנועה זו מסירה באופן מכני את הכוריון ואת קרומי הוויטליין, ומאפשרת גישה לבדיקות או כתמים לתוך הביצית.

ביציות ללא כוריון ייראו ארוכות ודקות, ואלו ללא קרומי ויטלין יהיו בעלי קצוות מחודדים. כדי להפריד את הביציות שפונקו מהפסולת שמסביב, העבירו את תערובת הדגימות לצינור, ואפשרו לביציות לשקוע לתחתית בזמן שהפסולת צפה בחלק העליון וניתן להסיר אותה.

בפרוטוקול זה נסיר קרומי כוריון וויטלין מביציות דרוזופילה בוגרות.

- כדי להפריד את הביציות בשלב מאוחר, ראשית, יש להוסיף מיליליטר אחד של PBSBTx לצלחת ניתוח רדודה. לאחר מכן, השתמשו ב-P200 עם קצה מצופה BSA כדי להעביר שחלות קבועות לתוך הכלים הרדודים. פיפטה השחלות מעלה ומטה עם קצה פיפטה מצופה BSA כדי לעקור את הביציות הבשלות מהביציות הפחות בשלות.

כאשר הביציות בשלב מאוחר מופרדות מספיק, העבירו את כל הרקמה לצינור מיקרופוגה של 500 מיקרוליטר. הסר נוזל עודף עם פיפטה פסטר משוך, משאיר על 150 עד 200 מיקרוליטר בצינור.

כדי להתכונן לגלגול ביציות, הרטיבו מראש צלחת עמוקה עם 200 מיקרוליטר PBSBTx. כסו את הכלי והניחו אותו בצד.

השג שלוש שקופיות זכוכית חלבית והנח שלוש שקופיות בצד. לאחר מכן, שפשפו בעדינות את אזורי הזכוכית החלבית של שקופיות אחת ושתיים יחד. שטפו אותם במים נטולי יונים, כדי להסיר שברי זכוכית וייבשו עם מגבון חד פעמי. צפה את האזורים החלביים של שקופיות אחת ושתיים עם PBSBTx על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של PBSBTx לשקופית אחת ושפשוף אזור זה עם השקופית השנייה. מוציאים את הנוזל עם מגבון חד פעמי ומניחים את המגלשות מתחת למיקרוסקופ מנתח. שמור את האזורים החלביים של שקופיות אחת ושתיים במגע עם שקופית שלוש התומכת בשקופית השנייה.

כדי לגלגל את הביציות, ראשית, הרטיבו מראש קצה פיפטה P200 ב-PBSBTx ופזרו את הביציות בצינור המיקרופוגה על ידי פיטום למעלה ולמטה. מעבירים 50 מיקרוליטר נוזל המכיל את הביציות למרכז חלק הזכוכית החלבית בשקופית הראשונה. הרם שקופית שתיים כדי לעשות זאת.

הורידו באיטיות את החלק השני עד שמתח הפנים של הנוזל יוצר אטימה בין שני אזורי הזכוכית החלבית. צריך להיות מספיק נוזל כדי לכסות את האזור החלבי, אבל אף אחד לא צריך לחלחל החוצה. לאחר מכן, החזק את השקופית התחתונה במקומה ביד אחת והשתמש ביד השנייה כדי להזיז את ההחלקה העליונה שתיים קדימה ואחורה בכיוון אופקי, תוך שמירה על החלקה שתיים ברמה ותמיכה בשקופית השלישית.

בצע תחת מיקרוסקופ להדמיה קלה של תנועות הביצית והתקדמותה. לאחר מספר תנועות בכיוון האופקי, שנה מעט את זווית התנועה. במרווחים מרובים, הגדל בהדרגה זווית זו עד 90 מעלות עד שהתנועה של השקופית העליונה שתיים תהיה בניצב לכיוון ההתחלה. שימו לב שכוריון ריק ייראה בנוזל, וביציות חסרות כוריון ייראו ארוכות ודקיקות יותר.

- בעת גלגול הביציות, יש לוודא שכיוון הגלגול הוא תמיד בקו ישר ולעולם לא בתנועה מעגלית.

- חזרו על הגלגול כ-7 עד 10 פעמים עד שהתמיסה הופכת לעכורה מעט. הפסיקו להתגלגל כאשר נראה שרוב הביציות איבדו את קרומי הוויטלין שלהן.

הרימו בעדינות את המגלשה העליונה השנייה, גררו את אחת מפינותיו למרכז האזור החלבי במגלשה התחתונה כך שהביציות המגולגלות יצטברו במרכז האזור החלבי. שטפו את הביציות משתי המגלשות עם PBSBTx לתוך צלחת הבאר העמוקה המכילה PBSBTx.

נקו מגלשות אחת ושתיים עם מים טהורים במיוחד. מייבשים עם מגבון חד פעמי ומאפסים. חזור על שלבים אלה עד שכל הביציות של אותו גנוטיפ התגלגלו. זה בדרך כלל דורש שלושה עד ארבעה סבבים של גלגול לכל גנוטיפ.

כדי להסיר לכלוך לאחר הגלגול, הוסף PBSBTx של 1 מיליליטר לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. מערבלים את הנוזל כדי לצפות את דפנות הצינור. באמצעות קצה פיפטה P1000 מצופה PBSBTx, מעבירים את הביציות המגולגלות מצלחת הבאר העמוקה לצינור החרוטי המכיל מיליליטר אחד של PBSBTx. הוסף 2 מיליליטר נוספים של PBSBTx לצינור החרוטי המכיל את הביציות.

החזיקו את הצינור החרוטי על רקע כהה כדי לראות את הביציות האטומות בזמן שהן שוקעות. לאחר מתן הביציות לשקוע למטה, השתמש P1000 כדי להסיר את 2 מיליליטר העליון של תמיסה המכילה פסולת ולהשליך.

לאחר חזרה על השלב עבור סך של שלושה סבבים של הסרת פסולת, השתמש בקצה פיפטה P1000 מצופה PBSBTx כדי להעביר את הביציות בחזרה לצינור המיקרופוגה המקורי של 500 מיקרוליטר. 20 עד 25 נקבות אמורות להניב כ-50 מיקרוליטר של ביציות בוגרות מגולגלות.