$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- בעת הדמיה של טיפות שומנים, אברוני האחסון התוך-תאיים עבור שומנים ניטרליים, מתחילים בהוספת תמיסת דטרגנט, כגון זו המכילה Triton X-100, לדגימה. זה יחלחל לתאי התולעת. לאחר מכן, לתקן את המדגם בריכוז המתאים של isopropanol, למשל 40%.
לאחר מכן, הוסיפו אדום נילוס לדגימה והגנו עליה מפני אור, מכיוון שהצבע רגיש לאור. הקיבוע מאפשר לצבע לגשת לטיפות שומנים ברחבי החיה. אדום הנילוס הוא צבע ליפופילי שספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי שלו תלוי בקוטביות של סביבת השומנים המקומית.
כאשר נחשפים לשומנים קוטביים, כגון פוספוליפידים, ספקטרום הפליטה של אדום הנילוס נמצא באורכי גל אדומים גבוהים יותר. כאשר נחשפים לשומנים ניטרליים, כגון טריאצילגליצרולים ואסטרי סטרול בליבה הניטרלית של טיפות השומנים, ספקטרום הפליטה של אדום הנילוס משתנה לאורכי גל נמוכים יותר, צהובים-זהובים.
לכן, השתמשו בתעלה הירוקה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שיאסוף את פליטות אורכי הגל הצהובים-זהובים, כדי לדמיין כתמים אדומים של הנילוס של טיפות שומנים ברחבי החיה. בפרוטוקול לדוגמה נראה הליך צביעה של אדום הנילוס והדמיה של טיפות שומנים בדגימות קבועות.
- לביצוע צביעת שומנים אדומים של הנילוס, תולעי צלחת על מצע גידול נמטודות, או NGM, שנזרעו עם לוג מאוחר OP50 E. coli, ולגדל את התולעים ב 20 מעלות צלזיוס עד תחילת שלב L4. שטפו את התולעים עם 1 מיליליטר של תמיסת PBST והעבירו את תרחיף התולעת לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגו את התולעים במהירות של פי 560 מכוח הכבידה למשך דקה אחת, ואז הסירו את הסופרנאטנט וחזרו על שטיפת PBST עד שה-E. coli ינוקה מהמתלים. לאחר מכן, לגלולת התולעת, להוסיף 100 מיקרוליטר של 40% איזופרופנול, או 60% עבור צביעת ORO, ולדגור את הדגימה בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.
- תוספת של איזופרופנול חיונית לחדירה תקינה של התולעים לפני הצביעה.
- צנטריפוגו את התולעים בכוח משיכה של פי 560 למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התולעת.
- חשוב למזער את החשיפה לאור במהלך שלבי הצנטריפוגה.
- כעת, בעודכם בחושך, הוסיפו 600 מיקרוליטר של פתרון עבודה NR שהוכן בעבר לכל דגימה. הפוך את הצינורות שלוש פעמים וערבב לחלוטין את התולעים והתמיסה. לאחר מכן לדגור על הדגימה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
לאחר הדגירה, צנטריפוגו את התולעים והוציאו את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסיפו 600 מיקרוליטר PBST ודגרו על הדגימות בחושך למשך 30 דקות כדי להסיר את כתם ה-NR העודף. לאחר סיבוב הדגימות שוב כמו קודם, להסיר את כל מלבד כ 50 מיקרוליטר של supernatant.