Name: צעד אחד metabolomics: פחמימות, חומצות אמינו אורגני לכמת בהליך יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: למדו שיטת מטבולומיקס שלב אחד לניתוח פחמימות, חומצות אמינו וחומצות אורגניות בדגימות ביולוגיות באמצעות GC/MS. השיטה משפרת את הסקר הניאונטלי ומאפשרת זיהוי 38% נוספים של הפרעות גנטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הסיוע הטכני יכול של אנתוני תומאס הוא הודה בהכרת תודה.

נוהל עיבוד דגימות שתן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה דגימת שתן בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. למזוג לתוך מיכל חדש אם המקורי נפגעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו aliquot מרבי של 13 מ&quot;ל של המדגם ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס בצינור שכותרתו צנטריפוגה חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום את צפיפות אופטית של המדגם על ידי הצבת כמה טיפות של שתן refractometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן המדגם 0.2 באמצעות מסנן אממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדו את היקף המדגם מתחת לפי צפיפות אופטית <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1.000-1.009 </td><td> 1.00 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1.010-1.019 </td><td> 0.50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1.020-1.050 </td><td> 0.25 מ&quot;ל + 0.25 מ&quot;ל H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח המצוין הוא הועבר לאחר מכן Reactivial המכיל את הסטנדרטים הפנימיים הבאים: 500 nanomoles (nmoles) 3 קריאטין; 10 nmoles ד 3 חומצה methylmalonic: 100 nmoles כל אחד 13 הבאים C 3 לקטט, 13 C 3 pyruvate, 13 ג&#39;2 15 N גליצין, סרין 3 ד, ד 5 פנילאלנין, ד 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, חומצה 4 ד sebacic, 13 גלוקוז 6 C, D ו - אינוסיטול 6 ד 5 טריפטופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מיקרוליטר (μl) של 7.5 יחידות / פתרון μl של urease (Calzyme מעבדות מס. 116A0100) מתווסף המדגם, שהוא הסמיק ואז חתום תחת CO 2 דרך מחיצת אינרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם נערך על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם יותר גז פחמן דו חמצני נוסף ב 15 דקות intervals לשמור על הלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl יותר של הפתרון urease הוא הוסיף, את הבקבוקון הוא הסמיק עם דו תחמוצת הפחמן, ועל המדגם שמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl של אצטון 30:70: מתנול הוא הוסיף, מחצה גומי מוחלף מחצה מצופה טפלון, ועל המדגם הוא מקורר ב -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוצקים יוסרו על ידי צנטריפוגה ב 1500 סל&quot;ד x 10 דקות לאחר מכן יצק לתוך נקי 2.0 סמ&quot;ק Reactivial (Supelco / סיגמא) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף trifluoroacetate triethylammonium (תה / TFA) (Sigma) כדלקמן: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl של 1.00 דגימות מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 μl של 0.5 מ&quot;ל, או פחות, דגימות </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה מן עם אצטוניטריל מקום תחת זרם חנקן על 70 מעלות צלזיוס עד נפח קבוע מושגת (תה / TFA יישאר) (~ 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 13, עד 4 פעמים עד לקבלת משקע (~ 10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו מגניב כ -2 דקות. למעלה מן עם מתילן כלוריד, נזהר של לרתוח, ויבש (~ 4:00 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (תרמי מדעי) בשיעורים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 μl של 1.00 דגימות מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl של 0.50 מ&quot;ל, או פחות, דגימות </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי תחת אווירה חנקן לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה microvials, תחת אווירה חנקן, לניתוח על ספקטרומטר כרומטוגרף / מסת הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microvials מקום להזרקה אוטומטית על ידי 5975 Agilent GC / MS: טמפרטורות כלי הם: מזרק 200 ° C, ממשק 250 מעלות צלזיוס, בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך דקה 1; כבש ב 4 ° C / דקה 80-130 ° C, כבש ב 6 ° C / דקה 130-200 מעלות צלזיוס, כבש ב 12 ° C / דקה 200-285 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 10 דקות. טור: 25 מ &#39;, 320 מיקרון מזהה, סרט 0.5 מיקרון עובי DB-5. Spec המוניים: מקור 230 ° C, מרובע 150 ° C, סריקה 50-650 האמו ב 2.46 סריקות / sec. מרכך עיכוב 3.5 דקות. </li></ol> נציג תוצאות אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">לחץ כאן</a> כדי לראות את התוצאות נציג.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

המעבדה הקרנת מטבולית היא מעבדה מורשית CLIA-קליניים בבעלות אוניברסיטת סנט לואיס, תאגיד ללא מטרות רווח. ד&quot;ר סנדלר לא רווח ישירות בהכנסות מעבדה, אך הוא עשוי ליהנות בעקיפין מן התפוקה מעבדה. אף אחד שיטות, טכניקות, תוצאות, טווחי רגיל, פקודות מאקרו, ספריות תוכנה או מסקנות נחשבים קנייני זמינים באופן חופשי לכל המעוניין.

השיטה urease (1) צוטט 62 פעמים בספרות הרפואית עם שינויים שונים. הקבוצה של מאטסומוטו (2,3) לפשט את הליך המיון תפוקה גבוהה בילוד ודיווח על תוצאות מ 16,000 חולים. Kuhara ואחרים (07/04), דיווחו על שימוש בשיטת בכמה מקרים של אבחון שגיאה מולדות ומעקב. Rhead (8) אישר גם השירות של שיטה לאבחון קליני ומעקב של הטעויות המולדות. השיטה יושמה שתן של דובים, עקום החוצה עכברים, פילים homogenates של זבובי פירות שלמים הזחלים שלהם (9). התקשורת והתרבות מ קריפטוקוקוס לפני ואחרי mutagenesis אתר מכוונת נותחו גם בלי לשלב urease (10). השיטה יושמה הערכה תזונתית האדם סטודנטים לרפואה, תסמונת דאון בחולים וותיקי קשישים מטורפים לאחר טעינת נבדקים עם האכלות של חומצות אמינו טריפטופן, מתיונין isoleucine (11). Eight כל ויטמינים B-הוערכו על ידי לכימות מוצרי פירוט של שלוש חומצות אמינו, אשר ביניהם, לדרוש את כל הוויטמינים 8 בשלב כלשהו השפלה שלהם. ההשפעות הרעילות של תרופות להפחתת שלהם על ידי תוספת ויטמין דווחה (12). דגימות מי השפיר של הריונות תסמונת דאון נורמלי נותחו דיווחו (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/מחשב</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/מחשב</td></tr><tr><td>אוראז</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>בנוסף ל-Sigma C3</td></tr><tr><td>סטנדרטים של איזוטופים יציבים</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממיסים</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנליטים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודי GC</td><td>ג'&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות עם פקק</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

צעד אחד metabolomics: פחמימות, חומצות אמינו אורגני לכמת בהליך יחיד

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

כל תינוק נולד בארה&quot;ב מוקרן כעת לתקופה של עד 42 הפרעות גנטית נדירה בשם &quot;הטעויות המולדות של חילוף החומרים&quot;. שיטת ההקרנה מבוסס על טנדם ספקטרומטריית מסה מכמת acylcarnitines כמסך עבור acidemias אורגני וגם אמצעים חומצות אמינו. כל המדינות גם לבצע בדיקות אנזימטיות להפרעות פחמימות כגון galactosemia. כי התוצאות עלולות להיות בלתי ספציפיים, מעקב ובדיקה של תוצאות חיוביות נדרש בשיטה מוחלטות יותר. הדו&quot;ח הנוכחי מתאר את &quot;urease&quot; השיטה של ​​הכנת המדגם להקרנה שגיאה מולדת. אנזים urease הקריסטל משמש כדי להסיר אוריאה מתוך נוזלי הגוף המתירה ביותר אחרות מסיסים במים מטבוליטים להיות מיובש derivatized עבור גז כרומטוגרפיה בהליך אחד. התייבשות על ידי אידוי בזרם החנקן הוא הקל על ידי הוספת אצטוניטריל ו מתילן כלוריד. ואז, trimethylsilylation מתקיים בנוכחות זרז trifluoroacetate ייחודי, triethylammonium. הזרקת כרומטוגרפיה אוטומטיים מלווה כימות מאקרו מונחה מותאם אישית של 192 מטבוליטים למחצה כימות של כל רכיב מרכזי באמצעות ספריות המקצועית של ספקטרה המונית של תרכובות ביולוגיות derivatized TMS. הניתוח עשוי להתבצע על פלטפורמה בשימוש נרחב Chemstation באמצעות פקודות מאקרו וספריות זמין המחבר. במעבדה שלנו, מעל 16,000 דגימות המטופל כבר ניתחו בשיטת אבחון עם תשואה של כ 17% - כלומר, 17% את תוצאות דגימות לחשוף ממצאים שיש פעל על ידי הרופא ההזמנה. כולל אלה מעל 180 הטעויות המולדות אישר, מתוכם כ 38% לא יכול היה להיות מאובחן בשיטות הקודמות.

השיטה urease של הכנת המדגם לניתוח GC / MS של מטבוליטים מתווך מוצג על ידי הממציא שלה. השיטה מאפשרת צעד אחד המעקב של ההקרנה היילוד עבור הטעויות המולדות של ספקטרומטריית מסה במקביל על ידי פחמימות לכימות, אורגני וחומצות אמינו בתהליך כל אחד.

כל תינוק שנולד בארה"ב עובר כעת סקר למעלה מ-42 הפרעות גנטיות נדירות הנקראות "שגיאות חילוף חומרים מולדות". שיטת הסקר מבוססת על...

בפרוצדורת מטבוליזציה זו של שלב אחד, דגימות ביולוגיות מוכנות לניתוח של פחמימות, חומצות אורגניות וחומצות אמינו באמצעות כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסות (GC-MS) בתהליך יחיד. תחילה מטפלים בדגימות באנזים urease כדי להסיר urea. השלב השני של הפרוצדורה הוא דהידרטציה של הדגימות בנוכחות דטרגנט המורכב משני רכיבים נדיפים, triathlon, ammonium, ו-tri fluoro acetate.לאחר מכן תבוצע נגזרת של הרכיבים באמצעות טרימתילציה. ולבסוף, ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה של גז ומספקטרומטריית מסות; כימות אוטומטי של פחמימות, חומצות אורגניות וחומצות אמינו, כולל גליצין וסוכרי אמינו, מאפשר אישור ומעקב אחר מרבית ההפרעות הגנטיות שנמצאו בבדיקות סקר לילודים ו-38% נוספים של הפרעות שאינן נסרקות כיום באמצעות מספקטרומטריית מסות בטן-לבטן. שלום, אני ג'ים שומייקר מהמעבדה לסקירה מטבולית באוניברסיטת סנט לואיס.אני כאן כדי להדגים מטבולימיקה בצעד אחד, שיטה לניתוח נוזלים ביולוגים לצורך זיהוי מטבוליטים ביניים ללא הפרדה של חומצות, בסיסים ותרכובות ניטרליות. הדבר מאפשר לבצע מעקב אחר סריקת יילודים באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם (tandem mass spec) באמצעות הליך יחיד, המאפשר לנתח חומצות אורגניות, חומצות אמינו, פחמימות, נגזרות של פחמימות ו-ACell glycine, הכל בצעד אחד. השורה התחתונה היא שבגרף שמאחוריי ניתן לראות שהאבחנות המסומנות באדום ניתנות לביצוע באמצעות מטבולימיקה בצעד אחד, אך לא היו מזוהות בסריקת יילודים הנוכחית המבוססת על ספקטרומטריית מסות טנדם.נתחיל בהדגמה. כדי להתחיל בהליך זה, חממו את דגימת השתן במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C. אם המכל המקורי אינו תקין, העבירו דגימה למכל חדש.קחו אליקוט מהדגימה ואחסנו אותו בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius בתוך מבחנת צנטריפוגה קונוית מסומנת כגיבוי. לאחר מכן, מדדו ורשמו את הצפיפות האופטית של הדגימה על ידי הנחת מספר טיפות שתן ברפרקטומטר ידני. לאחר מדידת הצפיפות האופטית, סננו את הדגימה דרך מסנן של 0.2 micron.מדדו את נפח הדגימה בהתאם לצפיפות האופטית שנמדדה לפני הסינון. עבור ערכים שבין 1 ל-1.009, השתמשו ב-1 מיליליטר של דגימה; עבור ערכים שבין 1.01 ל-1.019, השתמשו ב-0.5 מיליליטר של דגימה; ועבור ערכים שבין 1.02 ל-1.05, ערבבו 0.25 מיליליטר של דגימה עם 0.25 מיליליטר של מים.העבירו את הנפח שצוין למבחנה ריאקטיבית המכילה כבר את התקנים הפנימיים המסומנים באיזוטופים כפי שצוין בטבלה המוצגת כאן. התקנים כוללים creatine, methylmalonic acid, lactate, pyruvate, glycine, sine phenyl alanine, hexa oil, glycine, orate, SEBA acid glucose, inositol ו-tryptophan. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת urease בריכוז של 7.5 units per µL.שטפו את הדגימה ואטמו אותה תחת פחמן דו-חמצני באמצעות ספטום אינרטי. החזיקו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות, תוך הוספת גז פחמן דו-חמצני נוסף במרווחי זמן של 15 דקות כדי לשמור על הלחץ. בסוף דגירה של 30 דקות, הוסיפו 20 µL נוספים של תמיסת יוריאז. שטפו את הבקבוקון בפחמן דו-חמצני והחזיקו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות נוספות.עם סיום הטיפול ביוריאז, יש להמשיך ישירות לייבוש ולגזירה של הדגימה מיד לאחר הטיפול ביוריאז. יש להוסיף 500 microliters של תמיסת אצטון למתנול ביחס של 30 עד 70 לדגימות, ולהחליף את ספטום הגומי בספטום מצופה Teflon.קררו את הדגימה בטמפרטורה של 20- °C למשך 15 דקות. הסירו מוצקים באמצעות צנטריפוגציה במהירות של 1500 RPM למשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את הנוזל העליון למבחנה ריאקטיבית נקייה בנפח של 2.0 CC. כעת הוסיפו tri ammonium, tri fluoro acetate (או T-E-A-T-F-A), המשמש כזרז למתילציה טרימלית: עבור דגימות בנפח של 1 ml הוסיפו 20 µL, ועבור דגימות בנפח של 0.5 ml ומטה הוסיפו 40 µL.השלם את הנפח עם acetonitrile והצב תחת זרם חנקן בטמפרטורה של 70 °C עד להשגת נפח קבוע, המעיד על כך שנותר רק T-E-A-T-F-A. תהליך זה אורך כ-15 דקות. שוב, השלם את הנפח עם acetonitrile והצב תחת זרם חנקן בטמפרטורה של 70 °C עד להשגת נפח קבוע, וחזור על הפעולה עד ארבע פעמים עד להיווצרות משקע.פעולה זו אורכת כ-10 דקות בכל פעם לאחר דהידרציה; יש להניח לדגימה להתקרר למשך כשתי דקות. מלאו שוב עם methylene chloride, תוך זהירות מפני רתיחה געתה, ויבשו. שלב זה אורך כארבע דקות.מלאו עד הסוף במתילן כלוריד וייבשו. פעם נוספת. לאחר מכן, בצעו נגזרתיזציה של הדגימה.הוסיפו 150 µL של OFM, STFA עבור דגימות של 1 mL, ו-200 µL עבור דגימות של 0.5 mL או פחות. סגרו את הדגימות תחת האטמוספירה של חנקן והדגירו בטמפרטורה של 70 °C למשך שעה אחת. בתום שעת ההדגרה, העבירו את הדגימות למסובבויות (micro vials) לצורך ניתוח במכשיר גז כרומטוגרף-ספקטרומטר מסות (GCMS), תחת האטמוספירה של חנקן; כאן נעשה שימוש ב-Agilent 5975 GCMS עם capillary DB-5.עבור ספקטרומטר השיקולים, הגדירו את המקור ל-230 °C, את ה-quad ל-150 °C, ואת טווח סריקת המסה ל-50 עד 650 A MU בקצב של 2.46 סריקות לשנייה. השהיית הממס היא 3.5 דקות. טמפרטורות המכשיר הן 200 °C עבור המזרק ו-250 °C.עבור הממשק, הגדירו את התנור ל-80 °C למשך דקה אחת, לאחר מכן בצעו עלייה של 4 °C לדקה מ-80 ל-130 °C, ולאחר מכן עלייה של 6 °C לדקה בין 130 ל-200 °C, ולבסוף עלייה של 12 °C לדקה מ-200 ל-285 °C והחזקה למשך 10 דקות. הניחו את המיקרו-מבחנות המכילות את דגימות ה-deriv eye להזרקה אוטומטית על ידי ה-GCMS והתחילו בניתוח. ספקטרום מייצג של דגימת שתן שנותחה ב-GCMS לאחר טיפול ב-Urease מוצג כאן, כאשר הפסגות המתאימות למטבוליטים pyro glutamic acid, four hydroxy cyclo acetic acid ו-hawkinson מסומנות.מטבוליטים אלו מעידים על Hawkins Anuria, הפרעה גנטית נדירה. ניתן לשייך את כל הפסגות בספקטרום למטבוליטים מוכרים ולכמת אותם. תוצאות בדיקות סריקה ראשוניות שלוילדים רכים עשויות להיות לא ספציפיות.עם זאת, הרמות המוגברות של מטבוליטי Hawkins UR בדגימת השתן שנותחה ב-GCMS כפי שמוצג כאן, איששו את האבחנה של מחלה זו, שהיא שגיאת חילוף מולדת. באמצעות אותה שיטת URIs, אובחנו שגיאות חילוף מולדות ב-184 מטופלים. קרוב ל-40% מהאבחנות המוצגות באדום לא היו מתבצעות באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם המשמשת בדרך כלל בסריקה נאונוטלית.זו הייתה הדגמה של ביצוע שלב אחד של מטבולומיקה באמצעות שיטת האוריאז לניתוח נוזלים ביולוגיים עבור פחמימות, חומצות אורגניות וחומצות אמינו, ואציל גליצין, כולם באותו הליך. חשוב לזכור כי בעת הערכת יעילות ההליך, ניתן לבחון את מידת השלמתו של עיכול האוריאז, דהידרטציה והסימולציה של טרימטיל, וזאת פשוט על ידי בדיקת נוכחותם של כל התקנים הפנימיים.הסטנדרטים הפנימיים נבחרו במכוון כדי להדגים כי, לדוגמה, תהליך הדהידרציה הגיע לסיומו, שכן אם לא היה כך, ה-creatinine TRI TMS לא היה נוכח בכמות המלאה. כך הוכחנו זאת. אם אתם מעוניינים במאקרוס ובספריות שפיתחנו לניתוח של הליך זה באמצעות ChemStation, אנא שלחו אליי דוא"ל לכתובת המופיעה על המסך, ומידע נוסף על המעבדה שלנו ניתן למצוא בכתובת ה-URL המופיעה על המסך.תודה רבה. מדבר ג'ים שוומייקר.

one-step-metabolomics-carbohydrates-organic-amino-acids-quantified

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

בנינו זרימת עבודה מטבולית לא ממוקדת ששילבה את XY-Meta ו-metaX יחד. בפרוטוקול זה, הצגנו כיצד להשתמש ב- XY-Meta כדי ליצור ספרייה ספקטרלית מתוך הפניה לספקטרה בגישה פתוחה, ולאחר מכן ביצענו בקרת FDR והשתמשנו במטה-X כדי להגדיל את המטבוליטים לאחר זיהוי ספקטרום המטבולומיקה.

זרימת עבודה משולבת של זיהוי וכימות במטבולום לא ממוקד מבוסס בקרת FDR

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

למדו שיטת מטבולומיקס שלב אחד לניתוח פחמימות, חומצות אמינו וחומצות אורגניות בדגימות ביולוגיות באמצעות GC/MS. השיטה משפרת את הסקר הניאונטלי ומאפשרת זיהוי 38% נוספים של הפרעות גנטיות.

צעד אחד metabolomics: פחמימות, חומצות אמינו אורגני לכמת בהליך יחיד

גלה סרטונים נוספים