מיקרו-הזרקה של עוברי דרוזופילה חיים: מסירה מוקדמת של ריאגנטים לעובר המתפתח

- אספו עוברי דרוזופילה חיים והסירו את הכוריון הלא שקוף שלהם. לאחר מכן, על מכסה זכוכית, להחיל שורה של דבק heptane, שהוא דבק סרט מומס heptane נוזלי. כדי להיות מסוגלים לטפל בעוברים שעברו דה-כוריוניזציה, יישרו בזהירות את הדגימות בשורה על הדבק.

העבירו את הכיסוי לתא התייבשות כדי לייבש חלקית את העוברים. זה ימנע דליפה ציטופלזמית במהלך או אחרי זריקות. לאחר מכן, הסירו את הכיסוי וכסו את העוברים בשמן הלוקרבון כדי למנוע התייבשות נוספת ועדיין לאפשר לחמצן להתפזר לתוך העוברים.

כדי לבצע את המיקרו-הזרקה, השתמש במערכת מיקרו-הזרקה במיקרוסקופ תואם. על ידי התבוננות דרך חתיכות העיניים, זהה הן את העוברים והן את המחט הטעונה מראש בתמיסת הזרקה. שברו את המחט וודאו שהיא מייצרת טיפות נוזל עקביות ובגודל מתאים. לאחר מכן, הביאו את המחט לתוך העובר והזריקו את הנפח המתאים. מוציאים את המחט, וממשיכים למחט, חוזרים על הזריקה לעוברים הנותרים.

בפרוטוקול לדוגמה, נראה הדגמה של מיקרו-הזרקה של עובר דרוזופילה למחקרי הדמיה חיים של חלוקת תאים.

- לפני הגדרת הכיסוי, הכינו דבק הפטן על ידי פתיחת סרט דביק כפול, והכנסתו לבקבוק של 100 מיליליטר. מוסיפים כ-50 מיליליטר הפטאן, אוטמים את הבקבוק ומנדנדים אותו למספר ימים.

לפני הכנת העוברים, יש להכין תא התייבשות שהעוברים יוכנסו אליו לפני ההזרקה. כדי לעשות זאת, לשים חלק אחד של צלחת 35 מ"מ בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ לעשות "שולחן". מוסיפים סביבו דריריט, שהוא סידן גופרתי נטול מים, כך שגובה הדריריט לא יהיה גבוה מה"שולחן", ומכסים.

כדי להתחיל להכין את העוברים, ראשית לאסוף אותם מכלוב ההטלה על ידי החלפת צלחת מיץ ענבים עם שמרים כל שעה. יש לצלם את העוברים כשעתיים לאחר תחילת האיסוף. כדי להכין את הכיסוי, הניחו אותו בצד אחד של מגלשת מיקרוסקופ והדביקו את ארבע הפינות כלפי מטה, כך שהוא לא יזוז.

בעזרת מוליך צמר גפן, מניחים שכבה אחת של דבק הפטן בשורה על הכיסוי. הדבק לא צריך להיות צמיג צריך להתייבש בעוד כמה שניות. אם הוא סמיך מדי, מוסיפים עוד הפטן.

לבסוף, הניחו חתיכת סרט דביק כפול על המגלשה ליד הכיסוי. בעזרת מברשת לחה, הרימו בזהירות את העוברים מצלחת מיץ הענבים והניחו אותם על הסרט הדביק הכפול בשקופית.

לאחר מכן, השתמשו בחצי פינצטה כדי לגלגל את העוברים על הסרט הדביק הכפול עד שהכוריון ייפתח. הרימו את העובר על ידי גלגול עדין שלו על הכוריון, כך שיידבק לטוויטר, והניחו אותו על דבק הפטן על הכיסוי כאשר הצד הארוך של העובר מקביל לצד הארוך של הכיסוי.

הניחו 10 עד 20 עוברים בשורה אחת. הסירו את הכיסוי והניחו אותו בתא ההתייבשות למשך שלוש עד שמונה דקות. הזמן תלוי בלחות המקומית ובכמות שיש להזריק. לאחר מכן, מניחים את הכיסוי על תא מתכת עם שומן ואקום. לבסוף, לכסות את העוברים עם שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת. העוברים מוכנים כעת לזריקה.

ראשית, מצאו את העוברים תחת יעד של פי 16. הרחיקו את העוברים, ומצאו את המחט מבלי להזיז את מישור המוקד. מרכז את המחט והזז אותה למעלה מבלי להזיז אותה בכיוון X או Y.

כדי לפתוח את המחט, לשים את קצה הכיסוי לתוך שדה הראייה, אבל לא איפה המחט תהיה, ולהוריד את המחט לאותו מישור מוקד. בזהירות רבה, הזיזו את הכיסוי עד שהוא פוגע במחט ושובר אותה בעדינות. הזיזו את המחט למעלה.

עכשיו הביאו את העוברים לידי ביטוי. הורידו את המחט לתוך השמן, ודאגו לקבל טיפות נוזל נחמדות מהמחט. הזיזו את העובר בהתמדה לתוך המחט, הזריקו טיפה לתוך העובר, ואז הרחיקו את העובר. לאחר שכל העוברים הוזרקו, הם מוכנים לתצפית במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של 60 או 100X.