דרוזופילה מוניטור פעילות (DAM): שיטה למדידת פעילות מוטורית בזבובים

- מוניטור פעילות דרוזופילה, או DAM, מחזיק צינורות פעילות ממורכזים המצוידים במזון זבובים בקצה אחד וחדיר אוויר קרוב יותר בקצה השני. מערך זה מתאים לזבובים בודדים במהלך ניסויים הנמשכים מספר ימים או אפילו שבועות.

מקם את ה- DAM בסביבה מבוקרת כמו אינקובטור עם טמפרטורה, לחות ומחזור אור מוגדרים. ערכו את הניסוי בחדר חשוך ובמידת הצורך השתמשו במקור אור אינפרא אדום לטיפול במכשיר, שבניגוד לאור בהיר, אינו משפיע על המערכת הצירקדית של הזבוב.

כדי להקליט את פעילות התנועה, חבר את המנגנון למערכת מחשב המאחסנת את הקריאות מגלאי הסכר. האלקטרוניקה של הסכר מזהה ברציפות את תקינות קרן אינפרא אדום הנפלטת דרך נקודת האמצע של כל צינור ומעלה מעת לעת נתונים למערכת המחשב.

כאשר הזבוב הולך הלוך ושוב בתוך הצינור, הוא חוצה את קרן האינפרא אדום. הפרעות אלה נספרות על ידי ה-DAM לאורך זמן עבור כל צינור ומשמשות כמדד לפעילות הזבוב.

בפרוטוקול הבא, נשתמש במערכת DAM כדי לחקור מקצבים צירקדיים אצל זכרים בוגרים של דרוזופילה.

- לפני העמסת זבובים לצינורות פעילות, יש להפעיל את האינקובטורים שישמשו לאחסון צגי הפעילות. יש לכוונן את הטמפרטורה באמצעות פקדי האינקובטור ולהגדיר את משטר האור/חושך באמצעות בקר האור של מערכת DAM או מערכת בקרת האור של האינקובטור עצמו, בהתאם לתכנון הניסוי הרצוי.

לאחר מכן, להרדים את הזבובים עם פחמן דו חמצני. לאחר מכן, בעזרת מברשת צבע עדינה, העבירו בעדינות זבוב בודד לתוך צינור פעילות. תפסו את האמצע של פיסת חוט בודדת שאורכה כחצי אינץ' בעזרת מלקחיים עדינים והכניסו את החוט לקצה הלא מזון של צינור הפעילות כדי לסתום את הפתח ולמנוע מהזבוב לברוח במהלך הניסוי, ובמקביל לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור.

השאירו את הצינור מונח על צידו עד שהזבוב יתעורר כדי למנוע מהזבוב להידבק למזון. הכנס את הצינורות לצגי הפעילות. עם הדגם החדש והקומפקטי יותר של צגי TriKinetics, יש צורך להחזיק את הצינורות במקום עם גומיות כדי להבטיח שקרן האינפרא אדום תעביר את הצינור במיקום המרכזי.

לבסוף, הכניסו את מוניטרי הפעילות לחממות וחברו אותם למערכת איסוף הנתונים באמצעות חוטי הטלפון. בדוק, באמצעות תוכנת איסוף מערכת DAM, שכל הצגים מחוברים כראוי, וכי הנתונים נאספים מכל אחד מהם.

כעת, לאחר שהזבובים הועמסו לתוך צינורות הפעילות ומערכת ניטור הפעילות המוטורית מוכנה, ניתן כעת לרשום את הנתונים. הזבובים מסונכרנים ומאומנים על ידי חשיפתם למשטר האור/חושך הרצוי, או LD, וטמפרטורה למשך יומיים עד חמישה ימים מלאים. מצב האילוף הנפוץ ביותר הוא מחזור אור/חושך של 12 שעות אור / 12 שעות חושך ב -25 מעלות צלזיוס.

לחקר השעון הביולוגי ביחס לפרוטוקול זה, הזמן שבו נדלקים האורות באינקובטור מוגדר כזמן צייטגבר 0 וכל שאר הזמנים הם יחסיים לערך זה. בתנאי LD סטנדרטיים של 12:12, Drosophila melanogaster מסוג פראי מציג בדרך כלל שני התקפי פעילות; אחד מתרכז סביב ZT0, המכונה שיא בוקר, ואחר סביב ZT12, המכונה שיא הערב.

מקצבי הפעילות המוטורית החופשית נמדדים בתנאי חושך וטמפרטורה קבועים לאחר תקופת האימון. ניתן לשנות את ההגדרה של מחזור האור בכל עת בשלב החשוך ביום האחרון של LD, כך שהיום הבא של הניסוי מייצג את היום הראשון של DD. שבעה ימים של איסוף נתוני DD מספיקים כדי לחשב את התקופה הצירקדית ואת המשרעת או עוצמת הקצב של הזבובים.

באופן כללי, גודל מדגם של לפחות 16 זבובים נחוץ כדי לקבל תקופות ריצה חופשיות אמינות עבור גנוטיפ מסוים. בסיום הניסוי, נתונים בינאריים גולמיים שנאספו באמצעות תוכנת מערכת DAM יורדים להתקן אחסון נתונים נייד, לדוגמה, מפתח USB.

הנתונים הבינאריים הגולמיים מעובדים באמצעות DAM Filescan102X, ומסוכמים לסלים של 15 ו -30 דקות בעת ניתוח פרמטרים צירקדיים, או לסלים של 1 עד 5 דקות בעת ניתוח פרמטרים של שינה/מנוחה. נכון לעכשיו, חמש דקות רצופות של חוסר פעילות הן ההגדרה הסטנדרטית של שינה/מנוחה בדרוזופילה.