בדיקת XTT: בדיקה קולורימטרית להערכת כדאיות התא ופעילות המיטוכונדריה

- גלי אולטרסאונד בתדר נמוך מובילים לליזה סלקטיבית של תאי לוקמיה אנושיים ובדיקת XTT מסייעת לקבוע את מידת הנזק הזה. הבדיקה פועלת על העיקרון שהאנזימים המיטוכונדריאליים של תאים בריאים ממירים צבע XTT צהוב לתרכובת כתומה בשם פורמזן. כדי להתחיל את הבדיקה, לטפל בתאים עם מתיל בטא cyclodextrin, סוכן מדלדל כולסטרול, ולאחר מכן sonicate התאים בעוצמה נמוכה כדי לגרום נזק לתאים.

צנטריפוגה כדי לגלול את התאים ולהוסיף מצע גידול תאים טרי לכדורית. זרעו את התאים בריכוז הרצוי לתוך צלחת מיקרו מרובת בארות ודגרו עליה למשך הלילה. כעת, הוסיפו את תמיסת ה-XTT המופעלת לתאים ודגרו עד שהצבע הכתום יתפתח בבארות המיקרו-לוחית. מניחים את הצלחת בספקטרופוטומטר. מדוד את הספיגה ב 450 עד 500 ננומטר ולאחר מכן ב 630 עד 690 ננומטר. חסר את שני הערכים לקבלת תוצאות מדויקות. הערך הגבוה יותר של ספיגה בבדיקת XTT מצביע על פעילות גבוהה יותר של אנזימים מיטוכונדריאליים ועל כדאיות גבוהה יותר של תאים.

בסרטון הבא נדגים את השימוש בבדיקת XTT לקביעת יעילותם של גלי אולטרסאונד בתדר נמוך לגרום נזק לתאים בתאי לוקמיה המטופלים במתיל בטא ציקלודקסטרין.

- כדי להעריך את הכדאיות של תאים סוניים על ידי בדיקת XTT, סוניק את התאים באמצעות טווח של פעימות של שנייה אחת עד שלוש שניות, המבוססות על הפרש של שנייה אחת, כדי לפתח טווח נזק עבור ערכת XTT להעריך. לאחר מכן סובבו את התאים והשעו מחדש את הכדוריות ל 1 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר במדיום גידול טרי. לאחר מכן, זרעו 100 מיקרוליטר של תאים לכל באר לתוך 96 לוחות מיקרוטיטר באר שטוחים בודדים במשולש, כולל שלוש בארות בקרה המכילות 100 מיקרוליטר של מצע גידול מלא בלבד לקריאות ספיגה ריקות. לדגור על התאים במשך 24 שעות.

בבוקר הבדיקה, מערבלים בעדינות אליציטוטים של XTT מחומם 37 מעלות צלזיוס וריאגנטים הפעלה עד שהתמיסות ברורות. לאחר מכן הוסף 0.1 מיליליטר של מגיב ההפעלה לאליציטוט 5 מיליליטר של מגיב XTT. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת XTT המופעלת לכל באר של לוחות החיסון U937 ו-THP1 והחזירו את התאים לאינקובטור תרביות התא. לאחר שעתיים, נערו את הצלחות בעדינות כדי לפזר באופן שווה את הצבע הכתום בבארות החיוביות ולמדוד את הספיגה בקורא לוחות מיקרוטיטר בין 450 ל -500 ננומטר. לבסוף, למדוד את הספיגה של כל בארות הבדיקה שוב בין 630 ל 690 ננומטר.