בדיקת תיוג דופק Bromodeoxyuridine: טכניקה למדידת התפשטות תאים
JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:59 דק' • April 30th, 2023
- התחל עם תרחיף תאי לוקמיה המכיל את צפיפות התאים הרצויה. צנטריפוגה והשעיה מחדש של התאים במדיום תרבית המכיל סרום. הוספת סרום מקדמת צמיחת תאים מתמשכת ותאים נעים על פני שלבי מחזור התא השונים. לדלל את התאים ברומודוקסיורידין, או BrdU, תמיסת תיוג ולגדל אותם בתנאים פיזיולוגיים למשך הזמן הנדרש.
תאים בסינתזה או בשלב S קולטים BrdU - אנלוג תימידין - שמחליף את תימידין בתהליך שכפול הדנ"א. צנטריפוגה את התאים כדי להסיר עודפי BrdU ולהשהות מחדש את התאים במדיה מתאימה. מעבירים את התאים לצלחת באר מרובה. אפשרו לתאים לגדול בתנאים פיזיולוגיים לפרקי זמן שונים.
בפרקי זמן שונים, תאים מתקדמים דרך שארית שלבי S, G2, מיטוזה ו- G1 ונכנסים למחזור התא הבא, המאפשר הערכה של התפשטות התא. בצע צביעת נוגדנים כדי לתייג BrdU עם נוגדן פלואורוכרום ולמדוד את התפשטות התאים באמצעות ציטומטריית זרימה.
בתוך ציטומטר הזרימה, פלואורוכרומים סופגים את אנרגיית הלייזר והפלואורס. מספר התאים המתרבים נמצא בקורלציה ישירה לפלואורסצנטיות שנצפתה. בפרוטוקול לדוגמה, נדגים את תיוג הדופק של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה.
- פרוטוקול זה משתמש בקו תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה, NALM6, אך ניתן להחיל אותו על כל קו תאים שאינו דבק. שמור על תאי NALM6 בצלוחיות תרבית T-75 בסל"ד מלא ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני באוויר. לאחר איסוף התאים וביצוע ספירת תאים, להשעות מחדש את התאים בסל"ד מלא ב 2 פעמים 10 ל 6 תאים למיליליטר.
לדלל את התאים 1 מתוך 2 עם BrdU Complete RPMI כדי לייצר ריכוז תאים סופי של 1 כפול 10 עד 6 תאים למיליליטר. טפל ב- BrdU בזהירות מכיוון שהוא מוטגן וטרטוגן פוטנציאלי. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 45 דקות.
לאחר מכן, לדלל את התאים 1 מתוך 10 עם RPMI מלא. צנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בזהירות להשליך את כל supernatant. להשהות מחדש את התאים בנפח קטן של סל"ד מלא, לבצע ספירת תאים, ולהתאים את ריכוז התא ל 1 פעמים 10 ל 6 תאים למיליליטר. פיפטה 1 מיליליטר של תאים לתוך כל באר של צלחת 48 באר.
פיפטה 1 מיליליטר של DPBS לתוך כל בארות פנויות כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני באוויר לנקודות הזמן הרצויות, בהתאם למה שמתכנן הניסוי שואף למדוד. כאשר הדגירה הושלמה, להעביר את כל התאים לתוך צינורות FACS.
יש לשטוף כל באר ברצף בנפחים של 1 מיליליטר PBS עד לנפח כולל סופי של 5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בזהירות להסיר את כל supernatant. התאים מוכנים כעת לצביעה, שיש לבצע באופן מיידי. אם יש צורך בצביעת פני השטח, יש לבצעה כבר עכשיו, לפני הקיבוע.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת שגשוג תאים בתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה באמצעות סימון ב-BrdU וציטומטריית זרימה. השיטה מאפשרת לחוקרים להעריך את ההתקדמות במחזור התא ואת קצבי השגשוג בשורות תאים שאינן נצמדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
- ציטומטריית זרימה
רקע
- BrdU הוא אנלוג של תימידין המשמש לסמימון תאים בשלב S של מחזור התא.
- ציטומטריית זרימה מאפשרת כימות של תאים מסומנים על בסיס פלואורסצנציה.
- הבנת שגשוג התאים היא קריטית למחקר סרטן ולפיתוח טיפולים.
- לוקמיה לימפתובלסטית חריפה היא סוג נפוץ של לוקמיה בילדים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה לסימון וכימות של תאי לוקמיה השוכפלים.
- לספק פרוטוקול הניתן לשחזור עבור חוקרים העובדים עם שורות תאים שאינן נצמדות.
- להקל על חקר דינמיקת מחזור התא במחקר הסרטן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תרחיף תאים וסנטריפוגציה.
- סימון תאים ב-BrdU ולאחריו אינקובציה.
- ציטומטריית זרימה למדידת שגשוג תאים.
- צביעה בנוגדנים לסימון BrdU באמצעות נוגדן פלואורו-כרומי.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תאים בשלב S באמצעות BrdU.
- כימות של תאים מתחלקים באמצעות ציטומטריית זרימה.
- הדגמה של התקדמות מחזור התא בתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה.
- פרוטוקול הישים לשורות תאים שונות שאינן נצמדות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר שגשוג תאים.
- סימון ב-BrdU בשילוב עם ציטומטריית זרימה הוא יעיל לניתוח דינמיקת מחזור התא.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של הביולוגיה של תאי לוקמיה.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידת שגשוג תאים היא קריטית להערכת יעילות טיפולית ולצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות לאונקולוגיה. בדיקת סימון הפולס של BrdU מאפשרת מעקב כמותי של הכניסה לשלב S ללא סנכרון תאים, ובכך תומכת בהערכה הדירה של השפעות תרכובות על התקדמות מחזור התא. גישה זו מספקת ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה על ידי קישור של מדדי השגשוג להיפותזות מכניסטיות במודלים של לוקמיה ומחלות פרוליפרטיביות אחרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת השערות טיפוליות באמצעות כימות סינתזת DNA באוכלוסיות תאים ספציפיות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מדידה ישירה של שינויים בשגשוג בעקבות מודולציה של מסלולים.
- ערך חיזוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי הפחתת סיכונים מנגנונית של תרכובות אנטי-פרוליפרטיביות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטי פלואורסצנציה כמותיים וסטנדרטיים התואמים לציטומטריה של זרימה לצורך סריקת תוכן גבוה (high-content screening).
- שחזוריות: מבטל ארטיפקטים של סנכרון, ובכך משפר את חסון הבדיקה בין חזרות וקווי תאים שונים.
- יכולת הרחבה: ניתן להתאמה לפורמטים של פלטות רב-בארים לצורך פרופיל תגובה למינון במסגרת קמפיינים לזיהוי מובילים (lead identification).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: יישום ישיר למודלים של לוקמיה, המאפשר התאמה תרגומית של סמנים ביולוגיים למדדי שגשוג קליניים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין תיקוף מנגנונים בשלב הגילוי לבין הערכות יעילות פרה-קליניות באמצעות מדדי שגשוג עקביים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני go/no-go באמצעות כימות השפעות מעורבות המטרה (target engagement) על התקדמות מחזור התא.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization), ומספקת נתונים על תהליכי שגשוג התורמים הן להבנה מכניסטית והן לקשרי מבנה-פעילות (structure-activity relationships).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות מדידת חלק ה-S-phase כקריאה תפקודית של פעילות המסלול.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים, מוכנים לבדיקה, להערכת ספריות תרכובות בתרביות סספנסיה.
- אנליטיקה: מייצר מדדי proliferציה במתאם פלורסצנטי המאפשרים השוואת תנאים וקביעת EC50.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות דינמיקת מחזור תא שמורה בדגימות לוקמיה ראשוניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת proliferציה לשימוש חוזר, הישימה בתחומי טיפול באונקולוגיה ובאימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במבחני פרוליפרציה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות סימון בעל רזולוציית זמן, ללא צורך בסנכרון.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מנגנונים ציטוסטטיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות ספי רזולוציה כמותיים של פרוליפרציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה ובטכניקות זיהוי מבוססות נוגדנים.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה עם ערוצי זיהוי פלואורסצנציה מתאימים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול ב-BrdU בשל תכונות מוטגניות וטראטוגניות.
- כולל אופטימיזציה של משך הפולס וזמני המרדף (chase times) עבור קינטיקה של שורות תאים ספציפיות.
- מוגבל לאוכלוסיות במצב של התחלקות; תאים שקטים (quiescent) או תאים בסנצנציה דורשים בדיקות משלימות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton
סרטונים קשורים
0 צפיות
ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים
סרטונים קשורים
0 צפיות
חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation
סרטונים קשורים
0 צפיות
איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי
סרטונים קשורים
0 צפיות
מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה
סרטונים קשורים
0 צפיות
BrdU Immunofluorescence Staining: טכניקה לזיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא
סרטונים קשורים
0 צפיות
בדיקת סינתזת DNA: טכניקה להערכת סינתזת DNA בתאים מתרבים באמצעות שילוב תימידין טריטיאט רדיואקטיבי
סרטונים קשורים
0 צפיות
מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון
סרטונים קשורים
0 צפיות
כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית
סרטונים קשורים
0 צפיות
מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026