JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:59 דק' • April 30th, 2023
- התחל עם תרחיף תאי לוקמיה המכיל את צפיפות התאים הרצויה. צנטריפוגה והשעיה מחדש של התאים במדיום תרבית המכיל סרום. הוספת סרום מקדמת צמיחת תאים מתמשכת ותאים נעים על פני שלבי מחזור התא השונים. לדלל את התאים ברומודוקסיורידין, או BrdU, תמיסת תיוג ולגדל אותם בתנאים פיזיולוגיים למשך הזמן הנדרש.
תאים בסינתזה או בשלב S קולטים BrdU - אנלוג תימידין - שמחליף את תימידין בתהליך שכפול הדנ"א. צנטריפוגה את התאים כדי להסיר עודפי BrdU ולהשהות מחדש את התאים במדיה מתאימה. מעבירים את התאים לצלחת באר מרובה. אפשרו לתאים לגדול בתנאים פיזיולוגיים לפרקי זמן שונים.
בפרקי זמן שונים, תאים מתקדמים דרך שארית שלבי S, G2, מיטוזה ו- G1 ונכנסים למחזור התא הבא, המאפשר הערכה של התפשטות התא. בצע צביעת נוגדנים כדי לתייג BrdU עם נוגדן פלואורוכרום ולמדוד את התפשטות התאים באמצעות ציטומטריית זרימה.
בתוך ציטומטר הזרימה, פלואורוכרומים סופגים את אנרגיית הלייזר והפלואורס. מספר התאים המתרבים נמצא בקורלציה ישירה לפלואורסצנטיות שנצפתה. בפרוטוקול לדוגמה, נדגים את תיוג הדופק של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה.
- פרוטוקול זה משתמש בקו תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה, NALM6, אך ניתן להחיל אותו על כל קו תאים שאינו דבק. שמור על תאי NALM6 בצלוחיות תרבית T-75 בסל"ד מלא ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני באוויר. לאחר איסוף התאים וביצוע ספירת תאים, להשעות מחדש את התאים בסל"ד מלא ב 2 פעמים 10 ל 6 תאים למיליליטר.
לדלל את התאים 1 מתוך 2 עם BrdU Complete RPMI כדי לייצר ריכוז תאים סופי של 1 כפול 10 עד 6 תאים למיליליטר. טפל ב- BrdU בזהירות מכיוון שהוא מוטגן וטרטוגן פוטנציאלי. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 45 דקות.
לאחר מכן, לדלל את התאים 1 מתוך 10 עם RPMI מלא. צנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בזהירות להשליך את כל supernatant. להשהות מחדש את התאים בנפח קטן של סל"ד מלא, לבצע ספירת תאים, ולהתאים את ריכוז התא ל 1 פעמים 10 ל 6 תאים למיליליטר. פיפטה 1 מיליליטר של תאים לתוך כל באר של צלחת 48 באר.
פיפטה 1 מיליליטר של DPBS לתוך כל בארות פנויות כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני באוויר לנקודות הזמן הרצויות, בהתאם למה שמתכנן הניסוי שואף למדוד. כאשר הדגירה הושלמה, להעביר את כל התאים לתוך צינורות FACS.
יש לשטוף כל באר ברצף בנפחים של 1 מיליליטר PBS עד לנפח כולל סופי של 5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 150 פעמים G במשך חמש דקות בזהירות להסיר את כל supernatant. התאים מוכנים כעת לצביעה, שיש לבצע באופן מיידי. אם יש צורך בצביעת פני השטח, יש לבצעה כבר עכשיו, לפני הקיבוע.