JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:24 דק' • April 30th, 2023
- Bromodeoxyuridine או BrdU הוא אנלוגי נוקלאוזיד תימידין סינתטי. במהלך שלב הסינתזה של מחזור התא, BrdU מחליף תימידין ומשתלב בדנ"א המסונתז החדש. BrdU המשולב מאפשר מעקב אחר התקדמות מחזור התא. כדי לזהות את BrdU המשולב, ראשית, לתקן ולחדור את התאים כדי להפוך אותם חדירים.
לאחר מכן, טפל בתאים עם אנזים DNAse כדי לבקע את גדילי ה- DNA ולחשוף את BrdU המשולב. לאחר מכן, הוסף נוגדן פלואורסצנטי מתאים שכותרתו נוגדן נגד BrdU. הנוגדן נכנס לגרעין ונקשר בקלות ל-BrdU החשוף שנמצא בדנ"א.
בנוסף, טפלו בתאים בצבע קושר DNA פלואורסצנטי מתאים. הצבע נקשר לדנ"א ומאפשר לכמת את תכולת הדנ"א הכוללת. השתמש בציטומטריית זרימה כדי לזהות את הפלואורסצנטיות הן מ- BrdU והן מה- DNA.
עוצמות פלואורסצנטיות מהדנ"א המסומן מתיינות תאים בשלבים שונים של מחזור התא בהתבסס על השונות בתכולת הדנ"א הכוללת. האות הפלואורסצנטי מ-BrdU מזהה את מיקום מחזור התאים הנוכחי של תאים המשולבים ב-BrdU.
בדוגמה זו, נבצע את הצביעה האימונופלואורסצנטית BrdU של NALM-6 - תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה.
- לפני צביעת נוגדנים, יש לטפל בתאים באמצעות DNAse. להשהות מחדש את התאים ב 100 מיקרוליטר של תמיסת DNAse ולדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ שטיפה, צנטריפוגות את התאים ומשליכים את הסופרנטנט. צביעת נוגדנים לסמנים תוך תאיים שאינם BrdU יכולה להתבצע במקביל לצביעת BrdU.
- חשוב להכין בקרות פיצוי המורכבות מתאים לא מוכתמים ותאים המסומנים בכל פלואורוכרום בודד. באופן אידיאלי, השתמש באותם נוגדנים לבקרות פיצוי כמו אלה המשמשים בצינורות הניסוי.
- השהה מחדש את התאים ב 50 מיקרוליטר של חיץ שטיפה עם מיקרוליטר אחד לכל 10 ל -6 תאים של נוגדן BrdU. אם משתמשים בנוגדנים לאנטיגנים תוך תאיים ספציפיים אחרים, יש להוסיף אותם בשלב זה. דוגרים על התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר 20 דקות, שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של חיץ כביסה כפי שמוצג קודם לכן. לבסוף, הכתימו את הדנ"א לצורך ניתוח מחזור התא. שחררו את הגלולה על ידי הזזת הצינור והוסיפו 20 מיקרוליטר של תמיסת 7-AAD. זה קריטי להשתמש בכמות קבועה של 7-AAD לכל תא. השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של חיץ צביעה. לאחר מכן, לבצע ניתוח ציטומטריה זרימה.