דגימת דם רטרו-מסלולית: שיטה לבידוד תאים חד-גרעיניים מהסינוס הרטרו-אורביטלי של עכבר

- ראשית, החזיקו עכבר מורדם בצווארו והבליטו את העין. הכנס צינור נימי דק לתוך הקנטוס המדיאלי של העין. אפשר לדם לזרום על ידי פעולה נימית לתוך צינור. מעבירים את הדם לתוך צינור מצופה EDTA ושומרים אותו על קרח. EDTA קושר את יוני הסידן ומונע קרישת דם. טמפרטורה נמוכה יותר מפחיתה את הפעילות הגליקוליטית של התאים ואת הסיכויים לזיהום מיקרוביאלי.

לאחר מכן, לדלל את הדם עם חיץ המכיל EDTA ולערבב היטב. בזהירות להוסיף שכבה של פתרון הפרדה מתאים לתחתית, מבלי להפריע את הדם. צנטריפוגה את המתלים. הפולימר בתמיסת ההפרדה צובר את תאי הדם האדומים ואת המשקעים בתחתית. תאים חד-גרעיניים וטסיות דם, בהיותם קלים יותר מהפולימר, שוקעים מעל השיפוע הפולימרי.

הסירו את השכבה העליונה המכילה פלזמה ואספו את הטבעת הלבנה האטומה המכילה תאים חד-גרעיניים. לדלל את התאים באמצעות PBS וצנטריפוגה כדי להסיר שאריות פלזמה וטסיות. השתמש בתאים החד-גרעיניים המבודדים לניתוח נוסף. הפרוטוקול הבא ידגים בידוד של תאים חד-גרעיניים מעכבר קונגני המוזרק עם קו תאים לוקמי C1498.

- החדרת צינור נימי לתוך הקנטוס המדיאלי של העין של בעל החיים הלוקמי המורדם. 100 עד 200 מיקרוליטר דם יימשכו מהסינוס האורביטלי לתוך צינור הנימים. הסר את הצינור ולשלוט על הדימום עם יישום עדין של ספוג גזה סטרילי על העין. לאחר מכן, העבירו את הדם לצינור EDTA ואחסנו את הצינור על קרח עד לבידוד התא החד-גרעיני.

כדי לבודד את תאי הדם החד-גרעיניים, יש להוסיף תחילה PBS בתוספת EDTA של 1 מילימולרית עד לנפח סופי של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן, להעביר את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, להשתמש מזרק 1 מיליליטר מצויד מחט 30 מד בזהירות שכבה 500 מיקרוליטר של פתרון הפרדה מתחת לדם, נזהר לא לערבב את השכבות.

הפרידו את התאים באמצעות צנטריפוגה והשתמשו בפיפטה כדי להעביר את שכבת התא החד-גרעיני הלבנה האטומה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש. לאחר מכן לשטוף תאים חיסוניים ב 1 מיליליטר של PBS. צנטריפוגות אותם ולהשהות מחדש את הגלולה ב 600 מיקרוליטר של חיץ FACS עבור צביעה וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.