צנטריפוגת שיפוע צפיפות: שיטה לבידוד תאי CLL מדם היקפי

- בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית, או CLL, הלימפוציטים של תאי B גדלים באופן משמעותי במח העצם ובדם. כדי לבודד תאי CLL אלה מדגימת דם, ראשית, טפלו בדגימה בקוקטייל העשרה אנושי של תאי B המפריד בין תאי B באמצעות ברירה שלילית. הנוגדנים בקוקטייל מזהים באופן ספציפי ומצליבים את האנטיגנים המבוטאים על ידי תאים שאינם B ואריתרוציטים, ויוצרים קומפלקסים צפופים.

לאחר מכן, שכב את הדגימה על מדיום שיפוע צפיפות בעל צפיפות אופטימלית לבידוד לימפוציטים. עם הצנטריפוגה שלאחר מכן, מרכיבי הדם השונים נפרדים בהתבסס על שינויים בצפיפותם ביחס לתווך השיפוע. קומפלקסים RBC-non-B תאים עם צפיפות גבוהה יותר להתיישב דרך המדיום, וליצור גלולה. החלק הכי פחות צפוף בפלזמה יוצר את השכבה העליונה. תאי ה-CLL הצפופים פחות יוצרים שכבה לבנה בממשק הבינוני בצפיפות הפלזמה.

מעבירים בזהירות את השכבה הלבנה לצינור טרי. צנטריפוגה שוב כדי לקבל גלולה המכילה תאי CLL מטוהרים. בפרוטוקול הבא, אנו מראים את הבידוד של תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית, מדגימות דם של מטופלים.

- קבלת דגימות דם היקפיות מחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית שהוסכם עליהם בעבר בצינורות איסוף דם EDTA בליווי ספירת התאים הלבנים.

- יש להתייחס לדגימות דם אנושיות כמסוכנות, מכיוון שהן עלולות להכיל וירוסים המועברים בדם. ודא שדגימות אלה מטופלות בארון בטיחות ביולוגית Class II ושהמשתמש לובש חלוק מעבדה וכפפות בכל עת. יש להשליך חומרים מזוהמים בדם ולחטא אותם.

- אם ספירת התאים הלבנים שווה או גדולה מ-40 מיליון תאים למיליליטר, יש לדלל את הדגימה ביחס של 1 ל-1 באמצעות מאגר שטיפה RT CLL. לאחר מכן aliquot צפיפות RT מדיום הדרגתי לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי בגודל מתאים עבור הדגימה. שכבות בזהירות את הדגימה על גבי התווך והצנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך 30 דקות ב RT.

בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק, קוצרים בעדינות את השכבה הלבנה של התאים החד-גרעיניים שנאספו בממשק של מדיום שיפוע הצפיפות וחיץ השטיפה CLL. מעבירים את החד-שכבה המבודדת הזו לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 50 מיליליטר. כדי לשטוף את התאים, הוסף 40 מיליליטר של חיץ שטיפה CLL לשכבה אחת זו וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

השליכו את הסופרנטנט, העבירו את תחתית הצינור כדי להשהות מחדש את הכדורית, וחזרו על השטיפה. השליכו את הסופרנטנט, העבירו שוב את תחתית הצינור ואז השהו מחדש את כדורית התא בנפח מוגדר של חיץ שטיפה CLL, בהתאם לגודל הכדור. לאחר ספירת התאים ולאחר ציטומטריית זרימה לבדיקת טוהר התא, הניחו את התאים בצלחות תרבית רקמה בצפיפות התאים הנדרשת, מוכנים לגירוי או לטיפול תרופתי.