בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

- בדיקת שטף חוץ-תאי מסייעת לחקור את חילוף החומרים בתאים על ידי מדידת שני מסלולי האנרגיה העיקריים - גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית. במהלך הגליקוליזה, התאים מעכלים גלוקוז ומפרישים לקטט לחלל החוץ תאי יחד עם פרוטונים, שנקבע על ידי מדידת קצב החמצה חוץ-תאי או ECAR. במהלך נשימה מיטוכונדריאלית, תאים מנצלים חמצן לייצור ATP, הנמדד על ידי קביעת קצב צריכת החמצן או OCR.

תאים סרטניים מפגינים ספיגת גלוקוז גבוהה כאשר הם משנים את קצב חילוף החומרים שלהם כדי להסתגל ולשמור על שגשוג תאים בלתי מבוקר. כדי לנתח את חילוף החומרים בתאים סרטניים, תחילה הרכיבו מיקרו-צלחת לניתוח שטף המכילה חד-שכבה של תאים סרטניים דבקים ומחסנית חיישן מיובשת. מעבירים את מכלול הצלחת למנתח שטף. בתוך האנלייזר, גשושיות החיישן יורדות כדי ליצור מיקרו-תא חולף. כדי למדוד שטף חוץ-תאי, יציאת ההזרקה מציגה תרכובות בדיקה לתוך המיקרו-צלחת בנקודות זמן קבועות מראש.

בהתבסס על חילוף החומרים בתאים, ריכוזי החמצן הזמין והפרוטונים המשתחררים בתא המיקרו משתנים. שני פלואורופורים המוטבעים בבסיס המחסנית חשים ומודדים בו זמנית את רמות החמצן והפרוטונים, דבר המעיד על נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה, בהתאמה. בפרוטוקול הבא נדגים בדיקת שטף חוץ-תאי למדידת הפעילות המטבולית של תאים לוקמיים ראשוניים.

- בינתיים, כדי להכין את הצלחות לניתוח שטף חוץ-תאי, הוסיפו 12.5 מיקרוליטר של תמיסת דבק תאים לכל באר של שתי צלחות אנלייזר שטף חוץ-תאי בנות 8 בארות. לאחר 20 דקות, שאפו את דבק התא ושטפו כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר מים סטריליים בכל שטיפה.

לאחר השטיפה השנייה, השאירו את הצלחות במכסה המנוע עד שהבארות יבשות, והניחו את מחסנית החיישן הפוכה על ספסל המעבדה. הפרד את צלחת השירות ואת מחסנית החיישן של מנתח השטף, ומלא כל באר של צלחת השירות עם 200 מיקרוליטר של calibrant וכל חפיר סביב החלק החיצוני של הבארות עם 400 מיקרוליטר של כיול.

החזירו את מחסנית החיישן ללוחית השירות המכילה כעת את המכייל, והניחו את מכלול המחסנית באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ללא CO2 למשך הלילה. לאחר מכן הפעילו את מנתח השטף החוץ תאי ותנו לו להתחמם ל-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת בבוקר, להעביר את התאים מן הבקבוק לצינורות חרוטי 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את הכדורים ב 1 מיליליטר של המדיום הניסיוני המתאים לספירה. להשהות מחדש את התאים ב 4 כפול 10 ל 6 תאים ב 400 מיקרוליטר של ריכוז בינוני ניסיוני ולהוסיף 50 מיקרוליטר של תאים לתוך בארות B עד G של צלחת אנלייזר שטף, ו 180 מיקרוליטר של התווך הניסיוני לתוך בארות A ו- H כמו בארות בקרת הרקע.

לאחר הצנטריפוגה, מוסיפים לאט ובזהירות 130 מיקרוליטר של המדיום הניסיוני לבארות B עד G, ומאשרים ויזואלית היצמדות יציבה של התאים לתחתית כל באר מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן להחזיר את צלחת ניתוח שטף לח, 37 מעלות צלזיוס אינקובטור ללא CO2 במשך 30 דקות.

20 דקות לפני תום הדגירה, לטעון את התרכובות לתוך יציאות מזרק מתאים של המחסנית על פי פרוטוקול הניסוי, כפי שמצוין בטבלה. לאחר מכן הגדר את תוכנית ניתוח השטף החוץ תאי המתאימה. הפעל את התוכנית והחלף את צלחת הכיול בלוח הבדיקה כאשר תתבקש לעשות זאת.