העשרת תאי T: טכניקה לבידוד תאי T מאוכלוסיית תאים מעורבת על ידי הפרדה מגנטית

- תאי T, קבוצה של לימפוציטים, ממלאים תפקיד פעיל במאבק בזיהום. יחד עם סוגים רבים אחרים של תאי דם, תאי T חיסוניים נמצאים בטחול העכבר ובבלוטות הלימפה. כדי לבודד באופן סלקטיבי תאי T, יש לקצור טחול מורין ובלוטות לימפה ולמקם אותם על מסננת תאים. לשטוף את הרקמה עם מדיה מתאימה כדי לקבל תרחיף תא בודד.

הוסף אשלגן אמוניום-כלורי, או חוצץ ACK, כדי ליזה את תאי הדם האדומים. צנטריפוגה להפרדת תאי הדם השלמים מהליזט. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בחיץ מתאים. טפל בתרחיף עם תערובת של נוגדנים אנטי-עכבריים ביוטינילציה כדי להתמקד בתאי דם כמו גרנולוציטים, תאי B, תאי NK, וכל אריתרוציטים שנותרו. תאי T אינם ממוקדים ולכן נשארים לא מתויגים.

לאחר מכן, הוסיפו מיקרו-כדוריות מגנטיות נגד ביוטין לתרחיף. כל התאים המסומנים בביוטין נקשרים למיקרו-כדוריות. כאשר הם נשמרים תחת השפעת שדה מגנטי חזק, התאים המסומנים מגנטית נצמדים לדופן הצינור. תאי T לא מסומנים נשארים בהשעיה. אספו את תאי ה-T המועשרים הבלתי מאוגדים לתוך צינור איסוף טרי. בפרוטוקול הבא, אנו מראים את הבידוד של תאי T מטחול העכבר ומבלוטות הלימפה, תוך שימוש בטכניקת הפרדה מגנטית.

- אגרו את בלוטות הלימפה והטחול במסננת נקבוביות של 40 מיקרומטר והשתמשו בבוכנה מזרק כדי לאוורר את הרקמות דרך הפילטרים כדי לשחרר את התאים. שטפו את המסננת והבוכנה עם מדיום RPMI בתוספת FBS 1% כדי לאסוף את כל התאים ולקבוע את התאים באמצעות צנטריפוגה. הוסף 5 מיליליטר של חיץ ליזיס ACK לכדורית התא.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, להפסיק את התגובה עם 5 מיליליטר של בינוני בתוספת 1% FBS ו pellet את תאי הדם הלבנים על ידי צנטריפוגה. להשהות את הגלולה ב 5 מיליליטר של חיץ MACS לספירה ולדלל את התאים לריכוז של 2 פעמים 10 ל 8 תאים למיקרוליטר במאגר MACS טרי. הוסף את הריכוז המתאים של נוגדנים אנטי-אריתרואידים, אנטי-גרנולוציטים, אנטי-תאי B ונוגדנים נגד דלדול תאי NK-cell לכל 1 כפול 10 ל-6 התאים לדגירת 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 10 מ"מ של חיץ MACS קר כקרח, ולהשהות מחדש את הגלולה בריכוז 1 פעמים 10 עד 8 תאים למיליליטר במאגר MACS טרי. לאחר מכן, הוסף 0.22 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין לכל 1 כפול 10 ל-6 התאים עם ערבוב לדגירת 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר של חיץ MACS קר כקרח ואספו את תאי ה-T המועשרים הבלתי מאוגדים על ידי הפרדת חרוזים מגנטית באמצעות מפריד אקספרס MACS בהתאם לפרוטוקולי בידוד חרוזים סטנדרטיים. בסוף ההפרדה, משקעים את תאי T על ידי צנטריפוגה ומשעיפים מחדש את הגלולה ב -5 מיליליטר של חיץ MACS טרי לספירה.