DNA-איזוטופ יציב גשוש (ה-DNA SIP)

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק DNA ממיקרואורגניזמים פעילים שצרכו תסבסב גדילה רלוונטי, ללא צורך בגידול מעבדתי מוקדם. דבר זה מושג תחילה על ידי דגירה של דגימה סביבתית עם תסבסב רלוונטי המסומן באיזוטופ יציב, בתנאים הדומים לאלו המצויים בסביבתם הטבעית. השלב השני של ההליך הוא מיצוי של DNA כולל מדגימה זו המסומנת באיזוטופים.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא להעביר DNA זה אלטרה-צנטריפוגציה במדרג צפיפות של צסיום כלוריד. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הפרדה למקטעים (פרקציונציה) של מדרג הצפיפות כדי להשיג DNA כבד וקל לצורך אפיון מולקולרי לאחר מכן. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות החושפות את זהותם של מיקרואורגניזמים פעילים שטרם תורבדו, המעורבים במטבוליזם של סובסטרט מסוים, באמצעות מגוון טכניקות מולקולריות אפשריות, הכוללות טביעת אצבע (fingerprinting), מערך זעיר (microarray), היברידיזציה, ניתוח שיבוטים וספריות, ומטגנומיקה.

שלום, אני ג'וש נופלד מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ווטרלו. אני אריק דנפורד, סטודנט לתואר מתקדמים במעבדת נופלד. היום נדגים לכם פרוטוקול לסריקת איזוטופים של DNA, או DNA sip, שהפכה לטכניקה נפוצה לקישור בין זהותם של מיקרואורגניזמים לא ידועים וכאלו שייתכן שאינם ניתנים לתרבית, לבין יכולתם להשתמש בסובסטרט גדילה רלוונטי.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדת Newfeld כדי לחקור את חילוף החומרים של מקורות פחמן במגוון סביבות יבשתיות ומימיות. היום נדגים לכם את היישום של תסבכת פחמן ספציפית, 13 C glucose, על דגימת קרקע. עם זאת, אנו מציינים כי מאז ששיטה זו פותחה לראשונה על ידי קבוצתו של Colin Merle באוניברסיטת Warwick, חוקרים הגדילו את מגוון יישומי הפרוטוקול לסביבות שונות, וכן השתמשו במגוון איזוטופים מסומנים שונים, כגון חנקן וחמצן.

היום נתמקד בפחמן, אך ניתן להחיל את הפרוטוקול עצמו על תכנונים ניסיוניים שונים. לכן, בואו נתחיל. לפני תחילת הליך זה, הכינו את כל הריאגנטים לסימון יציב של DNA (DNA stable isotope probing) או DNA CYP כפי שמתואר בחלק הכתוב של פרוטוקול זה.

בדיקת DNAC מתחילה בדגירה של הדגימה. תנאי הדגירה משתנים במידה רבה בהתאם למגוון מאפיינים של הדגימה והמצע. לאחר שנקבעו תנאי דגירה מתאימים באופן אמפירי, יש להוסיף את תוספת המצע המתאימה לדגימה הסביבתית.

ניתן לבחור להוסיף רכיבי תזונה משלימים כדי לאפשר צמיחה מיקרוביאלית, במידה ואלו נדרשים על סמך דגימות אינקובציה מקדימות. לאחר הגדרת האינקובציה של הדגימה, סגרו ואטמו את הדגימה, ולאחר מכן בצעו אינקובציה לדגימות הסביבתיות המכילות את התססון המסומן. הדוגמה המוצגת כוללת הוספה של תמיסת גלוקוז המסומנת ב-carbon 13 לדגימת קרקע.

בשלב הבא, הגדירו דגירה של ביקורת שתשמש כהשוואה כדי לאשש את הסימון הנראה של חומצות גרעין שייראה בשלבים הבאים. הכינו דגימה זו תחת תנאים זהים, למעט שימוש בפחמן לא מסומן ככיסוי לסובסטרט; אטמו ודגרו את הדגימה הסביבתית עם סובסטרט לא מסומן תחת אותם תנאים. לאחר הדגירה, שלפו DNA מהמיקרוקוסמוסים באמצעות פרוטוקול מיצוי המתאים ליישומים הרצויים בהמשך התהליך. לאחר מכן, כמתו את ה-DNA שמוצא עבור שלביה העיקרון-צנטריפוגה הבאים באמצעות ג'ל אגרוז וספקטרופוטומטר.

השתמשו ברוטורים אנכיים או כמעט אנכיים עבור אולטרה-צנטריפוגה כדי להבטיח הפרדה מקסימלית של DNA קל וכבד. לרוטור Beckman Coulter VTI 65.2 יש 16 בארות להחזקת מבחנות פולימר עם סגירה מהירה (quick seal) בנפח של 5.1 milliliter להכנת דגימות לאולטרה-צנטריפוגה. ראשית, חשבו את נפח ה-DNA המופק הדרוש כדי להוסיף 0.5 עד חמישה micrograms של DNA למבחנות האולטרה-צנטריפוגה.

השתמש בריכוזי ה-DNA שנקבעו קודם לכן. לאחר מכן, קבע את הצפיפות המדויקת של תמיסת המלאי של cesium chloride באמצעות רפרקטומטר דיגיטלי. כפי שמוצע בפרוטוקול הכתוב, חשב את נפח תמיסת ה-DNA של באפר הגרדיאנט הנדרש כדי ליצור יחס ערבוב מתאים.

בעזרת חישובים אלו, ערבבו את ה-DNA המופק עם בופר גרדיאנט ו-4.8 milliliters של cesium chloride במבחנה סטרילית חד-פעמית של 15 milliliter. הנפח שיתקבל יהיה גדול מהקיבולת המצוינת של מבחנות הצנטריפוגה כדי למלא את המבחנות באופן מלא. לסיום, הומיגנו את התמיסה על ידי הפיכת המבחנה 10 פעמים בשינויים של פרוטוקול זה.

השתמש בצבע פלואורסצנטי כגון אתידיום ברומיד (ethidium bromide) בתוך תמיסת המדרג כדי לאפשר ויזואליזציה של ה-DNA בתוך המבחנה. שינוי הצפיפות של ה-DNA בעת הכנה עם DNA מתרבית טהורה, כולל מדרג אתידיום ברומיד כפי שמוצג כאן, שימושי במיוחד כדי לספק אישור ויזואלי מיידי להיווצרות המדרג לאחר כל סבב צנטריפוגה. השלבים לביצוע בגישה זו מתוארים בפרוטוקול הכתוב.

כדי להכין תחילה את העלטרצנטריפוגציה, השתמשו בנורית ובפיפטה כדי למלא בזהירות את מבחנות העלטרצנטריפוגה בתמיסות הגרדיאנט. סמנו את המבחנות על כתף המבחנה באמצעות טוש קבוע עדין. ודאו שהמבחנות מלאות בדיוק עד לבסיס צוואר המבחנה, שכן למבחנות שאינן מלאות מספיק יש נטייה להתפוצץ במהלך העלטרצנטריפוגציה.

לאחר שמילאו את כל המבחנות הנדרשות בתמיסות הדגימה, רשמו את המסה המדויקת של כל מבחנה. מיינו את המבחנות לזוגות תואמים ככל האפשר, והוסיפו או הסירו כמויות קטנות של תמיסה עד להשגת איזון של עד 10 milligrams. שמרו על מפלס התמיסה קרוב ככל האפשר לבסיס המבחנה. לאחר מכן, אטמו את המבחנות באמצעות פקק למבחנות בהתאם להוראות היצרן.

בדקו שהמבחנות אטומות כראוי על ידי הפיכתן והפעלת לחץ מתון. שקלו את המבחנות שוב כדי לוודא שהן עדיין מאוזנות לאחר האיטום ולפני העלטרסנטריפוגציה. בדקו בקפידה כל תא ברוטור כדי לוודא שהם נקיים ומכל אבק ופסולת שעלולים לנקב את המבחנות במהלך העלטרסנטריפוגציה.

הכנס את המבחנות לרוטור, כאשר זוגות מאוזנים ממוקמים זה מול זה. רשום את מיקום כל דגימה ברוטור, שכן תהליך האולטרה-צנטריפוגציה עלול להפוך את תוויות הסימון לבלתי קריאות. אטום בזהירות את בארות הרוטור לפי הנחיות היצרן.

לאחר שאתרי הרוטור נחתמו, הכניסו את הרוטור לאולטרה-צנטריפוגה. סגרו את דלת האולטרה-צנטריפוגה ושאירו ואקום עבור רוטור VTI 65.2. הגדירו את מהירות הסיבוב ל-44,100 RPM, את הטמפרטורה ל-20 °C ואת זמן האולטרה-צנטריפוגציה ל-36 עד 40 שעות.

וודאו שהוואקום פעיל, בחרו בתאוצה מקסימלית ובטלו את הבלימה כדי להבטיח שהמדרג לא יופרע כתוצאה מהאטה. מיד לאחר סיום העלטרה-צנטריפוגציה, הוציאו את הרוטור בזהירות. היזהרו לא להטות או להטלטל את הרוטור כדי למנוע הפרעה למדרגים בתוך המבחנות.

לבסוף, הוצא בעדינות את המבחנות לצורך הפרדה במדרג (gradient fractionation). ניתן להפיק DNA ממבחנות anultracentrifuge באמצעות טכניקת ההפרדה. כדי להתחיל, מלא מזרק סטרילי בנפח 60 milliliter במים מזוקקים ודה-יוניים סטריליים המכילים כמות מספקת של צבע propofol blue.

כדי להשיג צבע כחול כהה, הניחו את המזרק על זרוע הטעינה של משאבת המזרקים. לאחר מכן, חברו צינורית משאבה המצוידת במחט של 1 אינץ' בנתיב 23, והפעילו את המשאבה עד למעבר מים מקצה המחט. הימנעו מבועות אוויר באספקת המים, שכן הן ישפיעו לרעה על תהליך הפראקציונציה.

עבור כל דגימה, הכינו 12 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות בנפח 1.5 milliliter עם תוויות המציינות את מספר הדגימה והפרקציה. לאחר מכן, קבעו את אחת ממבחנות האולטרה-צנטריפוגה למעמד עם תפסן בתנועה מהירה ומבוקרת. נקבו את תחתית המבחנה לאורך תפר המבחנה באמצעות מחט חדשה במידה 23 gauge ואורך one inch, וסובבו את המחט כדי להבטיח שנוצר חור אחיד.

ייתכן ותגלו שכפפות לטקס מספקות אחיזה טובה יותר בגוף המחט מאשר כפפות ניטריל. בעזרת המחט המחוברת לצינורית המשאבה, דקרו את החלק העליון של הצינור בכתף הצינורית העליונה לאורך התפר, בצורה מהירה ומבוקרת. שימו לב שניתן לדקור תחילה את החלק העליון של הצינור ולאחר מכן את החלק התחתון של הצינור.

כמו כן, שימו לב כי כמות קטנה של שמן מינרלי המצפה את כתף המבחנה יכולה לסייע במניעת דליפה כתוצאה מאטימה לא תקינה מסביב למחט העליונה עם קצב משאבה שכויל מראש. הזרים את המים הצבועים לראש המבחנה כדי לקבל 12 פראקציות של 425 microliter בתוך 12 דקות. השתמשו בטיימר כדי לאסוף את תמיסת המדרג (gradient) למבחנות מיקרו-צנטריפוגה המסומנות.

לבסוף, בדקו את הצפיפות של כל הפראקציות עבור דגימה אחת לפחות או גרדיאנט ביקורת. השתמשו ברפרקטומטר דיגיטלי. הערכים הצפויים הם בטווח של 1.690 עד 1.760 גרם למיליליטר, עם צפיפות חציונית של כ-1.725 גרם למיליליטר, כדי להשקיע DNA מכל הפראקציות.

ראשית, הוסיפו 20 micrograms של polyacrylamide לינארי כנשא להשקעה וערבבו על ידי היפוך. לאחר מכן, הוסיפו שני נפחים של תמיסת PEG ושוב, ערבבו על ידי היפוך. השאירו את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר ל-DNA להשקיע לאחר הדגירה.

הניחו את הדגימות במיקרו-צנטריפוגה כאשר המבחנות מכוונות לאותו כיוון כדי להבטיח מיקום עקבי של המשקע לאחר הצנטריפוגה. סובבו את המבחנות ב-13,000 G למשך 30 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הוציאו את הדגימות מהמיקרו-צנטריפוגה, ואז שאבו בזהירות והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). בשלב זה המשקע צריך להיות נראה בעזרת מקור אור חזק.

שטפו את המשקע עם 500 µL של 70% ethanol לאחר שטיפת המשקע בצנטריפוגה. סנטריפוגו את הדגימות ב-13,000 G למשך 10 דקות, ולאחר הסנטריפוגה שאבו בזהירות והשליכו את supernatant. המשקע יהיה גלוי יותר כעת, אך יתנתק מדופן המבחנה בקלות רבה יותר.

הניחו למשקע להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר שהמשקעים התייבשו, השעו כל משקע ב-50 µL של באפר TE. לבסוף, הריצו 5 µL מכל פרקציה על ג'ל aeros כדי לאפיין את פרקציות הגרדיאנט באמצעות השיטות הנדונות בפרוטוקול הכתוב.

תוצאות טיפוסיות של DNA SIP יראו הפרדה של DNA מסומן ובלתי מסומן בצורת גרדיאנט באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. באופן אידיאלי, תתקבל רזולוציה מלאה של חומר גנטי בעל משקל מולקולרי גבוה, כגון סימון ב-carbon 13 וב-nitrogen 15, מחומר בלתי מסומן; ובפרט, טביעות אצבע ייחודיות מבוססות PCR הקשורות לפרקציות ארבע עד שמונה של דגימות שדוגרו עם איזוטופים יציבים, אך לא עם סובסטרט טבעי. ביקורות דגירה מספקות ראיות חזקות הקושרות אורגניזמים ספציפיים למטבוליזם של סובסטרט מסומן מסוים כאשר הן מבוצעות על DNA משני תרביות טהורות: זן bath של *Methylococcus capsulatus* המסומן ב-carbon 13, ו-*Syan medi A TCC 10 21* שאינו מסומן; ה-DNA הגנומי המסומן והבלתי מסומן נפרדים לפרקציות גרדיאנט תואמות בעלות צפיפויות שונות.

בדוגמה זו, ניתן להבחין ב-DNA המסומן באיזוטופים כבדים בפרקציות ארבע עד חמש, בעוד ש-DNA שאינו מסומן נמצא בריכוזים גבוהים בפרקציות תשע עד 10. DNA שעבר הגברה באמצעות PCR מאותן פרקציות הורץ באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה וגרדיאנט (DGGE), והפיק תבניות פסים נפרדות התואמות לשני האורגניזמים שנכללו בגרדיאנט. צפיפות הפרקציות נעה בין 1.580 ל-1.759 גרם למיליליטר בקירוב, והן מוצגות לפי סדר של צפיפות יורדת משמאל לימין.

לעומת זאת, הפרדה של איזוטופים ודגיינות של דגימות סביבתיות עשויות להיות קשות יותר לפירוש. קרקעות טונדרה מ-Resolute Bay שבקנדה דגרו עם גלוקוז המסומן בפחמן 12 או פחמן 13 למשך תקופה של 14 ימים ב-15 degrees Celsius. ג'לי האגרוז של ה-DNA המופק מפרוקציית הגרדיאנט הגולו העלו מריחה של DNA גנומי בפרוקציות שבע עד 10 הן עבור דגימות הפחמן 12 והן עבור דגימות הפחמן 13.

עם זאת, כאשר נעשה שימוש ב-DGGE של גני 16 s ribosomal RNA כדי לקבוע את העשירה ב-carbon 13 של ביומסה מטקסונים מיקרוביאליים מסוימים, ה-DNA שהופק מקרקע שהודגרה עם carbon 12 glucose הראה דפוסים דומים בכל פракציות הגרדיאנט, בעוד שהדגימה שהודגרה עם carbon 13 glucose הניבה טביעות אצבע של DGGE הקשורות באופן ייחודי לפракציות חמש עד שמונה; הפסים השמורים המסומנים בחצים ייצגו פילוטייפ דומיננטי העקבי בכל פракציות הגרדיאנט. הפילוטייפ מראה הסטה לפракציות כבדות יותר עבור DNA שהופק מקרקע שהודגרה עם carbon 13 glucose. ניתן לקבוע את זהותו של גן 16 s ribosomal RNA ספציפי זה כדי להנחות גישות מטאגנומיות או גישות המבוססות על תרבית בהמשך.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע ניסוי של סימון איזוטופי יציב של DNA (DNA stable isotope probing), החל מהדגרת הדגימות ועד להשגת DNA מסומן לצורך אנליזה מולקולרית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לתכנן את מערך הניסוי בקפידה ולהקפיד לא להוסיף כמות מוגברת של סובסטרט, כדי למנוע הטיה של הניסוי לטובת אורגניזמים בעלי קצב גדילה מהיר. כמו כן, יש להימנע מהדגרה ממושכת כדי למנוע מהסובסטרט להתפזר לאיברים אחרים בקהילה באמצעות רשת המזון.

כעת תוכלי להשתמש בכמות המדויקת של תשתית ובזמני אינקובציה מספיקים כדי לאפשר זיהוי של כמות קטנה של DNA מסומן בפרקציות כבדות באמצעות יישומים רגישים המבוססים על PCR. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.