חיתוך כרומטין: שיטה ליצירת מקטעי כרומטין באמצעות עיכול אנזימטי

- גורמי שעתוק הם חלבונים הנקשרים לאתר מסוים בדנ"א כדי לווסת את ביטוי הגנים. טעויות בגורמי שעתוק משנות פעילות זו, מה שמוביל לביטוי יתר של גנים, הגורם לסרטן. כדי להבין את תפקידם של גורמי שעתוק ובקרת גנים, אנו יכולים לבצע בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין או CHIP, וגזירת כרומטין היא שלב חשוב בתהליך העבודה של שבב

לחיתוך כרומטין, ייצבו את קומפלקס הדנ"א-חלבון על ידי הוספת פורמלדהיד. פורמלדהיד מקשר חלבונים לרצף הדנ"א הקשור על ידי יצירת קשרים קוולנטיים. לאחר מכן, השתמש במאגר ליזה מתאים כדי לשכב את התאים כדי לשחרר כרומטין המכיל את קומפלקסי חלבון DNA צולבים וצנטריפוגה. גזירת הכרומטין באמצעות אנזים נוקלאז מיקרוקוקלי. אנזים זה חותך את הכרומטין בין הנוקלאוזומים ומעכל את קצות הדנ"א הרופפים. צנטריפוגו את התערובת ואספו את הסופרנטנט.

טען את supernatant על ג'ל אגרוז TBE לנתח את הגודל המתאים של מקטעי DNA. החל שדה חשמלי על פני הג'ל, אשר גורם לדנ"א הכרומטין הטעון שלילית לנוע לכיוון האנודה. שברים קטנים יותר נעים במורד הג'ל. הכרומטין הגזור מופיע ככתם בג'ל. בפרוטוקול הבא, נגזור כרומטין של קו תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית באמצעות סוניקציה.

- כדי להתחיל, למלא צינור 1.5 מילימטר עם 1 מיליליטר של 37% פורמלדהיד. לאחר מכן, מלא עוד צינור 1.5 מיליליטר עם 1 מיליליטר של 1.25 גליצין טוחנת וצינור 5 מיליליטר עם 4 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, לאחר גירוי התאים, סובבו את התאים בהתאם לפרוטוקול הטקסט, והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS והניחו את הצינור בקופסה מלאה בקרח. מוסיפים 13.5% מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד לתאים ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

לאחר מכן, לדגור על המתלה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 57 מיקרוליטר של 1.25 גליצין מולארי כדי לעצור את הקיבוע ולאפשר תרחיף זה לדגור בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מיד לאחר תקופת הדגירה, מניחים את התאים על קרח וצנטריפוגות את התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. ואז שאפו את הסופר-נאנט. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מיליליטר של PBS קר כקרח ב 200 פעמים גרם במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא ב -5 מיליליטר של חיץ ליזיס-1 על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.

לאחר מכן, לשים את הדגימות על קרח לדגור אותם עם רעד במשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להסיר בזהירות את supernatant. הומוגניזציה של התאים ב 5 מיליליטר של ליזיס buffer-2 ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. לאחר מכן, לדגור את התאים על קרח במשך 10 דקות עם רעידות. לאחר תקופת הדגירה, צנטריפוגו את הצינורות ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס בזהירות להסיר את supernatant.

לאחר מכן, השהה מחדש את גלולת התא בחיץ גזירה-1 עם מעכב פרוטאז 1X. לאחר מכן, לדגור על תרחיף התא על קרח במשך 10 דקות. מעבירים 140 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינורות הסוניקטור, תוך הקפדה על הימנעות מיצירת בועות אוויר. מניחים את הצינורות באולטרסאונד ממוקד בטמפרטורה של 7 מעלות צלזיוס וגוזרים במשך עשר עד שבע וחצי דקות. מעבירים את תרחיף התא לצינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 15,700 פעמים גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנאטנט בצינור חדש.