בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין: טכניקה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתאים

- Chromatin immunoprecipitation, או ChIP, היא טכניקה המשמשת לקביעת אינטראקציות חלבון-DNA בתאים. חלבונים נקשרים לאתרים ספציפיים בדנ"א ומווסתים את ביטוי הגנים. ראשית, לייצב את קומפלקס חלבון ה- DNA עם פורמלדהיד. פורמלדהיד מקשר חלבונים לרצף הדנ"א הקשור על ידי יצירת קשרים קוולנטיים.

לאחר מכן, השתמש במאגר ליזה מתאים כדי ליזה את התאים לשחרר כרומטין המכיל את קומפלקסי ה- DNA-חלבון הצולבים. צנטריפוגו את המתלה והפעילו את הסופרנאטנט כדי לקבל שברי כרומטין. לאחר מכן, תייגו את הדגימה בנוגדן מתאים שנקשר במיוחד לחלבון הקשור לדנ"א.

הוסף חרוזים מגנטיים מיוחדים לדגימה. החרוז מזהה את הנוגדן ונקשר אליו. השתמש מגנט כדי לאסוף את החרוזים המגנטיים עם קומפלקס נוגדן-חלבון-DNA. שטפו את הדגימה כדי להסיר כרומטין או נוגדנים לא מאוגדים. הוסיפו חיץ בריכוז מלח גבוה לקומפלקס ודגרו בטמפרטורות גבוהות יותר כדי להפוך את הקשרים הצולבים של חלבוני DNA.

בעזרת מגנט, אספו את הסופרנאטנט המכיל את הדנ"א והחלבונים. הוסף אנזים פרוטאינאז K כדי לפרק את החלבונים בדגימה. הוסף חיץ מתאים כדי לזרז DNA ולהשתמש בו לניתוח נוסף. הפרוטוקול הבא ידגים את המשקעים החיסוניים של הכרומטין בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית כדי לזהות גני מטרה של NFAT2.

- ראשית, הכינו 20 מיקרוליטר חרוזים מצופים חלבון A לכל משקעים בצינור אחד של 1.5 מיליליטר. הניחו לחרוזים להתיישב על מדף מגנטי למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את החרוזים עם 40 מיקרוליטר של 1x חיץ ChIP 1 לכל 20 מיקרוליטר של חרוזים מצופים חלבון A על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

הניחו לחרוזים להתיישב על מדף מגנטי למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנטנט. חזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים נוספות לפני שתשהה מחדש את החרוזים בנפח המקורי שלהם של 1x ChIP buffer 1. הוסף BSA, מעכב פרוטאזות, מאגר ChIP 5x ומים בדרגת ChIP-seq לחרוזים. לאחר מכן, להוסיף את כרומטין.

השתמש ב- 10 מיקרוגרם של נוגדן נגד NFAT2 כדי ללכוד NFAT2 ו- 2.5 מיקרוגרם של נוגדן IgG כבקרה. דוגרים על התערובות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב בשישה סל"ד. למחרת, סובבו את הצינורות במשך חמש שניות במהירות של 7,000 פעמים גרם ודגרו עליהם על המדף המגנטי למשך דקה אחת.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנאטנט ושטפו את החרוזים פעם אחת עם מאגרי כביסה 1, 2, 3 ו-4, ברצף. סובב את הצינורות במשך חמש שניות במהירות של 7,000 פעמים גרם לפני שתדגור על הצינורות על המדף המגנטי למשך דקה אחת. לאחר מכן, להסיר את supernatant ולהוסיף את חיץ הכביסה הבא.

לאחר השטיפה האחרונה, סובבו את הצינורות במשך חמש שניות במהירות של 7,000 פעמים גרם. דגרו על הצינורות על המדף המגנטי למשך דקה אחת. מוציאים את הסופרנאטנט ותופסים את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של חיץ אלוציה 1. לאחר מכן, לדגור את הצינורות על הגלגל המסתובב במשך 30 דקות.

לאחר מכן, סובב בקצרה את הצינורות והנח אותם על מדף מגנטי למשך דקה אחת. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומוסיפים 4 מיקרוליטר של חיץ אלוציה 2. כדי ליצור את בקרת הקלט, ערבב מיקרוליטר אחד של הכרומטין החתוך עם 99 מיקרוליטר של חיץ אלוציה אחד ו -4 מיקרוליטר של חיץ אלוציה שני. לאחר מכן לדגור על הדגימות במשך ארבע שעות ב 65 מעלות צלזיוס עם רעידות.

לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של 100% isopropanol לצינורות. מערבלים ומסובבים את הדגימות במשך חמש שניות במהירות של 7,000 פעמים גרם. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לכל דגימה. מערבלים ודגרים על הדגימות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר במשך שעה.

לאחר מכן, סובבו את הצינורות לזמן קצר והניחו אותם על מדף מגנטי למשך דקה אחת. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה אחד. הפכו את הצינורות כדי לערבב ולדגור עליהם במשך חמש דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן צנטריפוגה קצרה את הצינורות. הניחו אותם במדף מגנטי למשך דקה אחת והשתמשו בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט.

לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של חיץ כביסה שניים. הופכים את הצינורות כדי לערבב, ודגרים עליהם במשך חמש דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה קצרה את הצינורות ומניחים אותם במדף מגנטי למשך דקה אחת. הסירו את חיץ הכביסה השני, באמצעות שאיפה, והשעו מחדש את החרוזים ב-55 מיקרוליטר של חיץ אלוציה.

כדי לנטרל את הדנ"א המואץ, דגרו על הדגימות בגלגל מסתובב בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, סובב את הצינורות בקצרה והנח אותם במדף מגנטי למשך דקה אחת. לבסוף, העבירו את הסופרנאטנט לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר.