גידול וקציר של שיבוטים HSPC: שיטה להשגת שיבוטים HSPC ממוינים יחיד

- תאי גזע ותאי אב המטופויטיים או HSPC, יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגים שונים של תאי דם. HSPCs צוברים בהדרגה מוטציות DNA במהלך החיים, אשר יכול לתרום לוקמיה. כדי לנתח מוטציות כאלה, HSPCs נוצרים בדרך כלל ממח העצם.

התחילו בהוספת נוגדנים מצומדים פלואורופורים לתאים חד-גרעיניים - תאי גזע בוגרים שבודדו ממח העצם - ודגרו עליהם למשך הזמן הרצוי. הנוגדנים נקשרים לסמנים ספציפיים של פני התא כגון CD34. כעת, טען את התערובת בציטומטריה התאית המופעלת על ידי פלואורסצנטיות או במכונת FACS.

נוגדנים מצומדים פלואורופור פלואורס כאשר נפגע על ידי הלייזר. טיפות תא בודדות עוברות דרך הגלאי המודד את עוצמת הפלואורסצנטיות, שעל בסיסה יש לטיפה מטען חשמלי. בנוכחות שדות אלקטרומגנטיים, תאים טעונים חיובית עוברים למיכל השלילי ולהיפך.

כעת, הגדל את HSPCs CD34 חיוביים ממוינים FACS במדיום מתאים למשך הזמן הרצוי עד שהשיבוטים גלויים. לאחר מכן, עקרו את השיבוטים על ידי פיפטינג נמרץ וצנטריפוגה כדי לגרש את התאים. אחסנו את הגלולה המכילה HSPCs משובטים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף. בפרוטוקול הבא נייצר שיבוטים של HSPC מהתאים החד-גרעיניים.

- התחל הליך זה בהכנת חומר לדוגמה וצביעה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להכין 25 מיליליטר של גזע hematopoietic ותא אב, או HSPC, מדיום תרבית. מלאו צלחת תרבית תאים של 384 בארות עם 75 מיקרוליטר של מדיום תרבית HSPC בכל באר. כדי למנוע אידוי של התווך בבארות החיצוניות, מלא את הבארות החיצוניות ב -75 מיקרוליטר מים סטריליים או PBS ואל תשתמש בבארות אלה למיון תאים.

מיון נכון של HSPCs אות קיימא הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. הגדר שערים למיון HSPC בהתבסס על בקרה לא מוכתמת ב- 10,000 תאים מדגימת הכתם. שער תאים בודדים על-ידי ציור שער סביב גובה הפיזור הליניארי קדימה לעומת שבר שטח הפיזור קדימה.

השתמש בשבר הבקרה שאינו מוכתם כדי לצייר שער עבור שבר השושלת. צייר שערים עבור תאים חיוביים CD34, ואפיין עוד יותר תת-קבוצה זו על ידי הגדרת שער ספציפי עבור תאים שליליים CD38, CD45RA שליליים. טען את צלחת 384 הקידוחים במכשיר FACS ומיין תאים בודדים. אם רלוונטי למחשב FACS, הפעל את האפשרות לשמור נתוני מיון אינדקס כדי לאפשר שחזור של התאים הממוינים.

לתרבית HSC ממוינת ביחידות, עטפו את צלחת התרבית בת 384 הבארות במכסה בעטיפת פוליאתילן שקופה. מעבירים את הצלחת בת 384 הבארות לאינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ושומרים אותה באינקובטור למשך שלושה עד ארבעה שבועות עד להופעת שיבוטים גלויים. לאחר ארבעה שבועות של תרבית, לקבוע אילו בארות יש מפגש של 30% או יותר.

עבור כל שיבוט, מלא מראש מיקרו-צינוריות 1.5 מילימטר במיליליטר אחד של 1% BSA ב- PBS ותייג את הצינור בהתאם לבאר המתאימה. הרטיבו מראש קצה פיפטה עם 1% BSA ב-PBS כדי למזער את מספר התאים שנדבקים לקצה הפיפטה. פיפטה עזה את המדיום למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים תוך גירוד תחתית הבאר עם פיפטה 200 מיקרוליטר להגדיר 75 מיקרוליטר.

לאסוף את השעיית התא במיקרו-צינור המסומן המתאים לבאר. יש לחזור על הצנרת בבאר עם עד 75 מיקרוליטר של 1% BSA ו-PBS טריים כדי להבטיח ספיגה מרבית של תאים. תאים בתרבית קלונאלית יכולים להידבק לתחתית באר. בדוק את הבארות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטי כדי לוודא אם כל התאים נאספו.

אם כל הבארות עם יותר מ -30% מפגש כבר נקצרו, מניחים את צלחת 384 בארות בחזרה באינקובטור. תרביות שבטים יכולות להתרבות עד חמישה שבועות. סובבו את מתלה התא למשך חמש דקות במהירות של 350 פעמים גרם. גלולה קטנה צריכה להיות גלויה. בזהירות להסיר את כל מלבד כחמישה מיקרוליטרים של supernatant. ניתן להקפיא כדורי תאים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ולאחסן אותם במשך חודשים רבים לפני בידוד הדנ"א.