$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- c-Kit, או CD117, הוא קולטן טרנסממברנה טירוזין קינאז המתבטא על ידי תאי גזע או תאי אב המטופויטיים הנמצאים במח העצם ובדם. זהו גם סמן לגילוי לוקמיה מיאלואידית חריפה.
כדי לבודד תאים חיוביים של c-Kit, קצרו עצמות רגליים של מורין ומעכו אותן כדי לשחרר את המח מבפנים. סנן את מתלה המח כדי להסיר שברי עצם. שכבות את התסנין המכיל תאי מח עצם על מדיום שיפוע צפיפות, וצנטריפוגה כדי להפריד תאים חד-גרעיניים משברים אחרים.
אספו את השכבה העכורה של תאים חד-גרעיניים בצינור המכיל מיקרו-חרוזים מצומדים לנוגדנים נגד CD117 בעכבר. יש לדגור על קומפלקסים של נוגדנים-חרוזים כדי להיקשר לקולטני CD117 בתאים חיוביים של c-Kit. מעבירים את המתלה המוגר דרך עמוד מגנטי הממוקם בשדה מגנטי. כל התאים החיוביים של c-Kit המסומנים במיקרו-כדוריות מגנטיות נשארים בעמודה, בעוד שהתאים שאינם מסומנים עוברים דרכם.
הסר את העמוד מהשדה המגנטי, ושטוף את התוכן באמצעות חיץ מתאים כדי לאלוט תאים חיוביים c-Kit. בפרוטוקול הבא נראה בידוד של תאים חיוביים של c-Kit ממח עצם של עכבר מהונדס.
- בתור התחלה, קצרו את עצמות הרגליים מעכבר שעבר המתת חסד. נקה את הרקמות מן העצמות עם אזמל. לאחר מכן, מניחים את העצמות ב- PBS קר על קרח ומועכים את העצמות עם מזיק. לאחר מכן, סנן את מתלה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור מכסה בורג 50 מיליליטר עם פיפטה 10 מיליליטר. שטפו את הטיט והמזיק מספר פעמים עם PBS קר, והוסיפו את מתלה התא לצינור 50 מיליליטר.
לאחר מכן, צנטריפוגות את מח העצם ולהסיר את supernatant עם ואקום פיפטה זכוכית. להשעות מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של PBS. בעזרת פיפטה, מוסיפים לאט את מח העצם המרחף לחלק העליון של פוליסוכרוז בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, סובב את פוליסוקרוז ב 400 G של במשך 20 דקות עם הבלם כבוי. לאחר cetrifugation, לאסוף את ממשק התא המונוגרעיני הכולל מעונן עם פיפטה ולהעביר אותו צינור חדש 15 מיליליטר. הביאו את הנפח ל -10 מיליליטר עם PBS והסירו 20 מיקרוליטר לספירה.
לאחר הצטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט והניחו את הגלולה על קרח. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא PBS עם EDTA ו- BSA. הוסף מיקרו-כדוריות CD117 לתרחיף התא ולמערבולת כדי לערבב. לאחר מכן, לדגור את ההשעיה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הביאו את הנפח ל-10 מיליליטר עם PBS נוסף עם EDTA ו-BSA וצנטריפוגה ב-1,200 G ב-4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
השתמש בוואקום כדי להסיר את הסופרנאטנט ולהשהות את גלולת התא ב- PBS עם EDTA ו- BSA. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר PBS עם EDTA ו- BSA למעמד מגנט עם עמוד מגנטי ואפשר לו לזרום לתוך צינור איסוף. לאחר שהמאגר מסיים לזרום דרך העמודה, הוסף את מתלה התא ואפשר לו לזרום דרך העמוד לתוך צינור האיסוף.
לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר נוספים של PBS עם EDTA ו- BSA לעמודה ושטוף אותו מיד עם הבוכנה. הסר את הבוכנה וחזור על הסומק לפני ספירת התאים. לאחר צנטריפוגה של התאים, הסר את הסופרנאטנט והשהה את גלולת התא ב- IMDM מלא לתרבית. תרבית את התאים במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.