התמרה בתיווך רטרו-ויראלי: שיטה להחדרת גן מטרה לתאים סרטניים

- רטרו-וירוסים הם נגיפי RNA המשתכפלים באמצעות שעתוק הפוך כדי להמיר את גנום ה-RNA שלהם ל-DNA דו-גדילי ולהשתלב לצמיתות בגנום המארח. חלקיקים נגיפיים חדשים יוצאים מהתא ויכולים להדביק תאים אחרים. טיפול גנטי בסרטן משתמש בווקטורים רטרו-ויראליים כדי להחדיר גנים טיפוליים לתאי מטרה באמצעות טכניקה הנקראת טרנסדוקציה כדי לווסת את הגן שעבר מוטציה או לחסל תאים.

כדי להשיג וקטורים רטרו-ויראליים בעלי טיטר גבוה, הדבק את תאי HEK 293 בתערובת טרנספקציה המכילה את הפלסמיד הרטרו-ויראלי הרצוי, פלסמיד אריזה וסוכן טרנספקציה מתאים. לדגור על התאים. סוכן transfecting מאפשר את המסירה של שני פלסמידים לתוך התאים.

הפלסמיד הרטרו-ויראלי מקודד את הגנום הנגיפי עם גן המטרה ואילו פלסמיד האריזה מקודד את חלבוני המעטפת הנגיפית. המנגנון התאי של תאי האריזה יוצר חלקיקים רטרו-ויראליים ומשחרר אותם למדיום. אספו את הסופרנאטנט הנגיפי והצנטריפוגה כדי להסיר תאים.

העבירו את הריכוז הרצוי של חלקיקים נגיפיים ותאים סרטניים לצלחת תרבית מצופה פיברונקטין כדי להקל על קשירת חלבוני מעטפת נגיפיים לתאים. לדגור על התאים. לאסוף את התאים ולבצע cytometry זרימה לנתח את יעילות התמורה. פרוטוקול זה יבצע התמרה בתיווך רטרו-ויראלי של תאי מח עצם עכבר חיוביים ל-c-Kit.

- ראשית, שלבו את ה-DNA של הפלסמיד הרטרו-ויראלי עם פלסמיד האריזה, סידן כלורי ומים בצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטר של HBS עוד 1.5 מיליליטר צינור. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה בטיפה לצינור המכיל HBS תוך ערבוב בו זמנית עם המערבולת המוגדרת להגדרה הנמוכה ביותר.

לדגור על תערובת transfection בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות. במהלך תקופת הדגירה מוסיפים כלורוקין לתאי HEK ושומרים אותם באינקובטור. לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה, לדגור על התאים במשך 8 שעות באינקובטור CO2 של 37 מעלות צלזיוס, 5%, לשנות את המדיה התאית על ידי הוספת 14 מיליליטר של מדיה DMEM 10 טרי לאט מאוד. פיפטינג איטי על דופן הצלחת מסייע למנוע כל הפשטה של תאי HEK.

לאחר מכן לדגור את התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי לאסוף את supernatant ויראלי. לאחר מכן חבר מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר למזרק. צללו את הסופרנאטנט הנגיפי לתוך צינור איסוף חדש. אספו את הסופרנאטנט הנגיפי כ-16 שעות לאחר מכן.

לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של מקטע פיברונקטין אנושי רקומביננטי ב- PBS לצלחות תרבית 6 בארות לא מטופלות. למחרת, להשתמש פיפטה כדי להסיר את פיברונקטין מן הצלחות. חסמו את הצלחות עם 2% BSA ב-PBS ודגרו על הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

השתמש בשואב אבק כדי להסיר BSA ושטוף את הצלחות עם PBS לפני הסרתו עם השואב. לאחר מכן, מיד להוסיף את supernatant ויראלי מסונן צנטריפוגה צלחת במשך שעתיים. השתמשו בשואב אבק כדי להסיר את הסופרנאטנט ולסובב את הצלחת שוב.

לאחר מכן, להסיר את supernatant עם ואקום ולשטוף את בארות מצופה ויראלי עם PBS. הסר את PBS עם שואב האבק. הוסף את תאי העכבר c-Kit+ שגודלו בעבר בתרבית לבארות מצופות הנגיף. לאחר הצנטריפוגה, לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. 48 שעות לאחר הטרנסדוקציה, משחררים את התאים באמצעות צנטריפוגה ומשעימים אותם מחדש במאגר FACS מספר 1.