בדיקת CFU מבוססת מתיל תאית: שיטה לקביעת ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות על היווצרות מושבות בתאים לוקמיים

- לעיתים, תא גזע או תא אב עובר מוטציות, מה שיוצר תא גזע לוקמי. בתאים אלה, חלבונים מסוימים מווסתים, ושימוש בתרכובות אנטי-סרטניות כנגד חלבונים כאלה יכול לסייע בשליטה על גדילת התאים. ניתן לנתח את ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות אלה באמצעות בדיקת CFU על ידי ניטור מספר וגודל המושבות שנוצרו.

התחילו בלקיחת תאי אב מעכבר לוקמי ודילולם בתרבית מתאימה. הוסיפו את תרחיף התאים הזה יחד עם התרכובת האנטי-סרטנית המתאימה למתילצלולוז המכיל ציטוקינים ספציפיים לעכבר, ומזגו אותו לצלחת פטרי. דוגרים על תערובת זו עד להופעת המושבות. מתילצלולוז היא מטריצה אינרטית מבחינה כימית, מוצקה למחצה, המונעת נדידת תאים, בעוד ציטוקינים מעוררים תאי אב להתמיין וליצור מושבות המכילות צאצאים מוכרים.

לאחר מכן, מכתימים את המושבות באמצעות יודוניטרוטטראזוליום כלוריד, או INT, ודגרים למשך הלילה עד שהמושבות הופכות לחום אדמדם כהה. אנזימים מיטוכונדריאליים מפחיתים INT בצבע צהוב לצבע פורמזן בצבע חום אדמדם. לבסוף, לזהות ולספור את המושבות הנוכחיות על הצלחת. בפרוטוקול הבא, נבצע בדיקת CFU כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות על תאים חיוביים ל-YFP.

- ראשית, הפשירו את המתילצלולוז עם ציטוקינים לעכברים בטמפרטורת החדר. ואז aliquot 3 מיליליטר של methylcellulose בצינור FACS. הוסף 100 מיקרוליטר של השעיית התא עם המעכבים המתאימים ל -3 מיליליטר מתילצלולוז. לאחר מכן סובבו את המתלים על גבוה במשך 10 עד 30 שניות.

לאחר שרוב בועות האוויר בורחות, השתמש מזרק 1 מיליליטר כדי צלחת 1 מיליליטר של המדיה בשלושה לוחות משוכפלים. מניחים את הצלחות בצלחת פטרי גדולה יחד עם צלחת פתוחה אחת המכילה מים סטריליים. לאחר מכן מכסים את צלחת הפטרי הגדולה, ודגרים על התאים ב 37 מעלות צלזיוס.

הכן iodonitrotetrazolium כלוריד כתם על ידי המסת 10 מיליגרם של iodonitrotetrazolium כלוריד ב 10 מיליליטר של מים. פילטר לעקר את פתרון הצביעה עם מזרק Luer-Lok מצויד מסנן 0.2 מיקרומטר.

במכסה המנוע של תרבית הרקמה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה סביב צלחת CPU. לאחר מכן דוגרים על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של תרבית תאים. לבסוף, לאחר שהמושבות הפכו לצבע אדום-חום כהה, השתמשו ברקע לבן במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית כדי לצלם את צלחת CFU המוכתמת.