ברירה אימונומגנטית שלילית: שיטה לטיהור תאי B מתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים או PBMCs, כוללים תאי B, תאי T, תאי הרג טבעי או NK ומונוציטים. תאי B מייצרים מולקולות אימונוגלובולינים כדי להילחם בזיהום. בלוקמיה, תאים אלה מתרבים ושולחים גרורות לאיברים שונים.

כדי לבודד תאי B, התחילו עם השעיה של PBMCs מבודדים. הוסיפו תערובת נוגדנים ראשונית המכוונת כנגד מולקולות ספציפיות של פני התא הנקראות צביר התמיינות או CD. נוגדנים ספציפיים נקשרים למולקולת CD-3 על תאי T, למולקולת CD-14 על מונוציטים, ומולקולת CD-16 על תאי NK, ומשאירים את תאי B ללא תווית.

לאחר מכן, לשטוף את הדגימה כדי להסיר את נוגדנים לא קשורים. הוסף מיקרו-כדוריות מגנטיות מצומדות נוגדנים משניים לדגימה. נוגדנים משניים נקשרים לאזור FC של נוגדנים ראשוניים המחוברים לתאים ספציפיים. הניחו את הצינור המכיל את תרחיף התא המסומן תחת השפעת שדה מגנטי. בשדה, התאים המסומנים מגנטית נודדים ונקשרים לדופן הצינור, מה שמוביל לברירה שלילית של התאים הלא רצויים. אספו את הסופרנאטנט המכיל תאי B מועשרים לתוך צינור איסוף טרי.

בפרוטוקול זה נבצע סלקציה אימונומגנטית שלילית של תאי B לוקמיים מ-PBMCs של חולי לוקמיה לימפוציטית כרונית.

השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש 10 מיליון PBMCs במיליליטר אחד של מאגר בידוד, שהוא PBS עם 0.1% BSA ו-2 מילימולר EDTA, כאשר ה-pH מותאם ל-7.4. לימפוציטים CLL עכשיו צריך להיות מטוהרים מן ההכנות PBMC. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוגרם של נוגדנים ראשוניים חד-שבטיים נגד CD-3, CD-14 ו- CD-16 של עכברים, ודגור במשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

לאחר שטיפת התאים עם חיץ הבידוד וצנטריפוגה ב 500 פעמים גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, להשהות מחדש את 10 מיליון PBMCs במיליליטר אחד של מאגר בידוד. לדגור את התאים resuspended עם 100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שטף במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם resuspending עדין. לאחר מכן, מניחים את הצינור במחזיק המגנט למשך שתי דקות ומעבירים את הסופרנאטנט עם התאים הלא קשורים לצינור טרי עם פיפטה 5 מיליליטר. לאחר שלב זה, לימפוציטים CLL מטוהרים מוכנים לשימוש.