Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

סרטון זה מציג מיקרו-דיסקציה של רשתית ושל רשתית עם אפיתל פיגמנט רשתי (RPE) צמוד מעוברים של דגי זברה (zebrafish) בגילים של יום אחד עד שלושה ימים לאחר ההפריה. ניתן לבצע את כל הפעולות באמצעות פינצטות עדינות וציוד מעבדה כללי. תחת מיקרוסקופ סטריאו סטנדרטי לדיסקציה של הרשתית, השכבה הבודדת של ה-RPE מוסרת ומוקלפת באמצעות פעולת הברשה והידבקות של ה-RPE לפני השטח של פלטת התרבית.

בעבור דיסקציה של רשתית המחוברת ל-RPE, מסירים את תכונות ההדבקה של פלטת התרבית על ידי ריסוק עוברי ושטיפה לפני הדיסקציה. כדי לשמר את ה-RPE שלם, הרמה זהירה של רקמה זו מפרידה ביעילות את הכורואיד והסקלרה מהרשתית המחוברת ל-RPE, ולאחריה הסרת העדשה באמצעות מחט טונגסטן חרוטה כימית. שיטת דיסקציה זו מאפשרת השגה של רקמות רשתית שלמות, והיא שימשה בהצלחה למחקר של ביטוי RNA ספציפי לרקמה ופרופילים של רשתית ושל אפיתל הפיגמנט הרשתי של דגי זברא.

שלום, אני Li Jang מהמעבדה של פרופסור UFE Leon במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת Purdue. היום נראה לכם כיצד לבצע דיסקציה של רקמות עין בעוברים של דגי זברה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את רשת הגנים המווסתת את התפתחות העין.

בואו נתחיל. שמונה. לפני המיקרו-דיסקציה, הכינו את התמיסות הבאות: E3, תמיסת רינגר בסינון סטרילי ו-5N נתרן הידרוקסיד.

בשלב הבא, בצעו תססורת כימית למחטי טונגסטן. הניחו כלי כימי קטן בתוך צלחת פטרי על גבי חימר כדי להקל על הטיפול בכלי ולמנוע שפיכה של נתרן הידרוקסיד. הצמידו מהדק נייר סטנדרטי לדופן הכלי.

מזגו נתרן הידרוקסיד ריכוז נורמלי חמישה לכוס כימית עד שהמהדק יבוא במגע עם נתרן ההידרוקסיד. חברו את האלקטרודה השלילית מספק כוח DC למהדק הנייר ואת האלקטרודה החיובית לקצה אחד של חתיכה קצרה של תיל טונגסטן. עטפו את הקצה השני של תיל הטונגסטן בכדור חימר בקוטר ארבעה מילימטרים וטבלו קצה זה לתוך תמיסת נתרן ההידרוקסיד.

העלו את המתח לכשלושה וולטים והטבילו את התיל למעלה ולמטה במרווחי של שנייה אחת בתוך תמיסת נתרן הידרוקסיד למשך כ-10 דקות. תיל התונגסטן החשוף לנתרן הידרוקסיד יהפוך לדק יותר בהדרגה, כאשר כדור החימר ייפול מהצד השני של התיל המחובר לאלקטרודה החיובית, ויקבל צורת מחט חדה. שטפו את המחט החדה בתמיסת רינגר או ב-E3 כדי להסיר משקעי מלח, וחברו את המחט למקל עץ בעזרת סרט דביק או מחזיק מחטים לנוחות בטיפול, כדי להכין את העובריים לניתוח.

יש להחזיק את דגי ה-super fish הבוגרים בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים בלילה שלפני ההפריה. יש להפריד את דגי ההורים במכלי הטרג במיים סטטיים בזוגות באמצעות מחיצה. יש להסיר את המחיצה לאחר הדלקת האור בחדר למחרת בבוקר, ולאפשר להורים להתרבית במרווחים של 10 דקות בכל חצי שעה, תוך הפרדה של הדגים לאחר כל פעולת הכלאה.

שמר את העוברים שנאספו מכל הכלאה בנפרד במצע E3 בטמפרטורה של 28 מעלות צלסיוס. בצע שלב (stage) לעוברים 10 עד 12 שעות לאחר ההפריה, ובצע שלב חוזר מיד לפני הניתוח בנקודות הזמן הספציפיות. השתמש בצלחות תרבית פוליסטירן של Falcon בגודל 60 על 15 מילימטר לצורך הניתוח.

לפלטה חדשה שלא נעשה בה שימוש יש תכונה דביקה טבעית לרקמת RPE למשך כ-20 דקות, וניתן להיעזר בה להסרת RPE לצורך דיסקציות של הרשתית. אם נדרשת רשתית עם RPE צמוד, ניתן להתגבר על תכונה דביקה זו על ידי ריסוק מלא של שני עוברים בפלטת תרבית המכילה תמיסת ringer והמתנה למשך 30 דקות לפני הדיסקציה, ולאחר מכן שטיפה יסודית בתמיסת ringer רעננה לפני הדיסקציה. כל הדיסקציות העדינות מבוצעות בהגדלה של פי חמישה עד שמונה במיקרוסקופ Olympus SC X 16 עם עדשה של פי אחת.

בעזרת פינצטת Dumont או מחט טנגסטן חרוטה כימית, מחממים את בסיס המיקרוסקופ ל-28 °C. כדי למזער את השפעת תנודות הטמפרטורה לפני תחילת דיסקציית הרשתית, מעבירים עובר בשלב התפתחותי ספציפי לחמישה מיליליטר של תמיסת Ringer בתוך צלחת תרבית Falcon בגודל 60 על 15 מילימטר, שהוכנה כפי שתואר עבור דיסקציית רשתית ללא RRPE. בעזרת הקצה החד של הפינצטה, חותכים במהירות את הראש וחלק מהגוף הקדמי ומסירים את גוף דג הזברה. לאחר מכן, מקבעים בעזרת סיכות את הקצה האחורי של חלק הראש והגוף על צלחת התרבית. בעזרת פינצטת עזר, פותחים את הראש בצד הגבי, החל מהמצח הקדמי.

הסיר את המוח כך שהצד המדיאלי של העיניים יהיה חשוף ופונה כלפי מעלה לצורך מניפולציות נוספות. כדי להוציא את הרשתית, השתמש בקצה הפינצטה כדי להבריש בזהירות את ה-RPE החשוף בצדו המדיאלי של העין הפונה כלפי מעלה, עד שייראה פתח קטן לרשתית. המשך בפעולת ההברשה והקילוף עד שרוב הצד המדיאלי של הרשתית יהיה חשוף.

הימנעו משריטות או חורים ברשתית החשופה בעת הסרת ה-RPE הלטרלי מרשתית העין הפונה לכיוון צלחת התרבית. שמרו על זווית של כ-45 מעלות מפני השטח של צלחת התרבית והניעו את העין בעזרת הפינצטה. הסירו את ה-RPE המחובר באופן יחסי חזק ל-ora serrata על ידי קיבוע החלק שהסר מה-RPE לצלחת התרבית לצורך הדיסקציה.

לאחר מכן, הרימו בעדינות את הרשתית כדי לנקות את שאריות ה-RPE ולהסיר את העדשה באמצעות תכונת ההידבקות של כלי התרבית. היזהרו לא לפגוע בתאי הרשתית, אשר יידבקו אף הם קלות לפני השטח של הכלי. אם העדשה אינה נפרדת באמצעות גלגול, השתמשו במחט טונגסטן חרוטה תוך ביצוע תנועות סיבוביות על פני השטח של העדשה.

כדי להתחיל בדיסקציה של רשתית המחוברת ל-RPE, השתמשו בצלחת תרבית Falcon בגודל 60 על 15 מילימטר שהוכנה כפי שתיאר עבור דיסקציה של רשתית המחוברת ל-RPE. העבירו עובר בשלב התפתחותי ספציפי לחמישה מיליליטר של תמיסת רינגר. חתכו את הראש ואת חלקו הקדמי של הגוף.

הסרה מהירה של גוף דג הזברה כפי שבוצע קודם לכן. מקבעו את הקצה האחורי של קטע הראש והגוּף על פלטת תרבית. באמצעות פינצטה עזר, פתחו את הראש בצדו הגבי, החל מהמצח הקדמי.

הסיר את המוח כך שהצד המדיאלי של העיניים יהיה חשוף ויפנה כלפי מעלה. לצורך מניפולציות נוספות באמצעות פינצטה, הרם בעדינות את העין מהצד הלטרלי האחורי וגלגל אותה לכיוון הצד האנטרי). את רקמת הכורואיד והסקלרה שבחוץ לשכבת ה-RPE המחוברת באופן הדוק יחסית לעור, ניתן להסיר ברובה על ידי גלגול זהיר של העין לכיוון הצד האנטרי).

הסר את העדשה באמצעות מחט טונגסטן לאחר חשיפת הצד הלטראלי של העין, ובעוד העין עדיין מחוברת לעור לצורך דיסקציה של הרשתית. ללא RPE ורשתית המחוברת ל-RPE, ניתן לאסוף את הדגימות המבודדות ב-triol בתוך מיקרו-מבחנה ל-RNA לצורך אפיון RNA בהמשך.

כאן מוצגת הפרדה מוצלחת של הרשתית ללא RPE, שבה השלמות של הרשתית נשמרת כפי שעולה מפני השטח השלם של הרשתית. החיתוך ההיסטולוגי התואם מראה גם כי ארכיטקטורת הרשתית נשמרה היטב. בפרט, השמירה על המטריצה החוץ-תאית בין שכבת הפוטורספטורים ל-RPE היא טובה במיוחד.

הסרה מוצלחת של הרשתית עם ה-RPE צמודה מתאפיינת בשכבת RPE שלמה ורציפה. החיתוך ההיסטולוגי התואם מראה כי הן תאי הרשתית והן תאי ה-RPE נמצאים במצב תקין. ה-RNA הכולל שהופק מהרשתיות שהוסרו הוא באיכות גבוהה.

דבר זה בא לידי ביטוי באלקטרופורוגרמה ובתמונת הג'ל שהתקבלו מניתוח הביואנלייזר. קו הבסיס שטוח והפיקים הריבוזומליים של 18 s ו-28 s שלמים. מספר שלמות ה-RNA הוא בדרך כלל גדול מ-9.8.

הצגנו בפניכם את נהלי המיקרו-דיסקציה להשגת רשתית עוברית של דג זבbestroute עם ובלי RPE. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי השלבים הקריטיים ביותר בדיסקציה של הרשתית הם פעולת ההברשה באמצעות קצה הפיפטות וגלגול הרקמה. להסרת שאריות RPE, מצאנו כי הנחת המרפקים על משענת זרוע מתכווננת בכיסא במהלך הדיסקציה יכולה לייצב באופן משמעותי את תנועות היד.

זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.