Name: Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למדו שיטת מיקרודיסקציה לבידוד רשתית עין ואפיתלium פיגמנט הרשתית מעוברי דג זברה בגיל יום עד שלושה ימים. טכניקה זו מאפשרת שימור רקמות שלמות לחקר ביטוי RNA ספציפי לרקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרן הזנק מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת Purdue.

חלק 1: הכנות לפני microdissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> E3 בינוני 4 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2 ו - 0.33 mM MgSO 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של הצלצול 1, 5 (116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 1.8 מ"מ CaCl 2, 5 HEPES מ"מ, pH7.2), מסנן מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5N NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימית תחריט של מחטים טונגסטן <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure כוס קטן המכיל 5N NaOH על צלחת פטרי על ידי חימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מהדק נייר בצד של הכוס, כך הוא בא במגע עם הפתרון NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה השלילית של אספקת מתח DC קליפ הנייר אלקטרודה חיובית בקצה אחד של קטע קצר (~ 2cm) של תיל טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים את הקצה השני של החוט טונגסטן עם כדור חימר קטנים לטבול זה סוף לתוך הפתרון NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת מתח 3V כ וטובלים את החוט למעלה ולמטה הפתרון NaOH עד שיעור תחריט טוב מושגת. מחט באיכות טובה בדרך כלל ניתן חקוק 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיל טונגסטן חשופים פתרון יהפוך בהדרגה רזה. כאשר כדור חימר נושר, הצד השני של הקו כי הוא עדיין מחובר האלקטרודה החיובית תהיה צורה מחט חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המחט חדה עם הפתרון של רינגר או E3 להסיר הפקדות מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המחט אל המוליך עץ על ידי קלטת או בעל מחט לטיפול קל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות צלחות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלקון 60 x 15 מ"מ לוחות קלקר תרבות מוכנים לשימוש עבור microdissection הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לנתח הרשתית המצורפת הרשתית, למעוך שני עוברים לחלוטין צלחת תרבות המכיל פתרון של רינגר להיפטר דביקות של המשטח 30 דקות לפני החיתוך. זמן קצר לפני הניתוח, לשטוף את הצלחת נרחב עם פתרון Ringer של טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים אוסף ובימוי <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה למבוגרים נשמרים כפי שתואר 4, 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הדגים הורה טנקים רבייה סטטי pairwise על ידי מחיצה בלילה שלפני הרבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחיצה אחרי האור בחדר מופעלת למחרת בבוקר. לאפשר להורים לעבור אל במרווחים של 10 דקות כל חצי שעה. הפרד את הדג לאחר חציית כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על העוברים במעבר שנאספו כל מדיום E3 בנפרד 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב בו עוברים הפריה שעות 10-12 פוסט (hpf) ו restage מיד לפני לנתיחה בנקודות זמן מסוימות, על פי הקריטריונים שנקבעו 1, 6. </li></ol></li></ol> חלק 2: Dissection - הסרת המוח חשיפה עין 1 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליכים המתוארים בסעיף זה נפוצים לנתח הרשתית (חלק 3A) ו הרשתית המצורפת הרשתית (חלק 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והניתוחים כל קנס נעשים על ידי קצה של מלקחיים דומון ובסיוע זוג נוסף של דומון מלקחיים עבור מיקום הרקמה. מחט כימי חרוט טונגסטן יכולה לשמש מניפולציות עדין במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והניתוחים כל קנס מבוצעות בהגדלה ~ 5-8x תחת מיקרוסקופ אולימפוס SZX16 מצויד אובייקטיבי 1X או שווה ערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על העוברים בתווך E3 בשנת עליון ספסל החממה ב 28 ° C ליד המיקרוסקופ עבור גישה קלה העובר במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב המיקרוסקופ הוא חימם עד 28 ° C על ידי צלחת תרמו כדי למזער את ההשפעה של תנודות הטמפרטורה על ביטוי גנים. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עובר בשלב התפתחותי מסוים לפתרון של רינגר ב 60 פלקון X צלחת 15 מ"מ תרבות מוכנים כמתואר חלק 1 # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הראש עם החלק הקדמי של תא המטען במהירות מהגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הקצה האחורי של רקמה זו על הצלחת תרבות עם מלקחיים סיוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הראש בצד הגבי החל המצח הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח, כך הצד המדיאלי של העיניים הוא חשוף פונה כלפי מעלה מניפולציות נוספות. </li></ol> 3A חלק: דיסקציה רשתית 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העובר כפי שמתואר חלק 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות המברשת הרשתית חשוף בצד המדיאלי של כדור העין פונה כלפי מעלה על ידי קצה מלקחיים עד פתח קטן על הרשתית נתפסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך צחצוח ומתקלף פעולה עד הצד המדיאלי של הרשתית כמעט חשוף לכל. הימנע מגרד ניקוב הרשתית חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הרשתית לרוחב על הרשתית אשר כעת פונים כלפי מטה, הגישה ולצחצח בזווית של כ -45 מעלות מעל פני צלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשתית המצורף יחסית היטב serrata אורה ידי מצמיד את החלק המנותק של הרשתית אל גצלחת ulture לנתיחה, ואז להרים את הרשתית בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלגלים את הרשתית בתחתית המנה תרבות לנקות את הרשתית שיורית. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנו לב תרבות המסוים הזה פלקון צלחת קלקר יש דבקות מועדף של הרשתית למשך כ 20 דקות פעם עובר הוא כתוש. מאפיין זה מנוצל להסרת שאריות הרשתית. עם זאת, תאים ברשתית לעשות מקל על פני השטח במידה פחותה יותר, אשר יכול להיבדק מקרוב בהגדלה גבוהה. צריך לאזן בין השלמות של הסרת הרשתית שלמות הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העדשה לעיתים קרובות שומרת על הצלחת תרבות מתנתק הרשתית במהלך תהליך מתגלגל. לעיתים, יש צורך לנתק את העדשה על ידי מחט טונגסטן חרוט עם פעולה מתערבל על פני העדשה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלים אלה מצליח להסיר מן הרשתית הרשתית מבלי להתפשר על שלמות הרקמה. זה מסומן על ידי מורפולוגיה הכולל טוב (איור 1B ו 'ב') היסטולוגיה (איור 1B "), החץ בפרט, שימור תאי המטריצה ​​בין שכבת photoreceptor ואת הרשתית הוא טוב במיוחד (איור 1B."; להשוות עם היסטולוגיה מעובר כולה (איור 1 א ")). </li></ol> 3B חלק: הרשתית המצורפת לנתיחה רשתית 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העובר כפי שמתואר חלק 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין ראש לצלחת התרבות על ידי מלקחיים עוזר. הרם את העין בעדינות מהצד האחורי לרוחב ומגלגלים אל הצד הקדמי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמית העין משוערת ורקמות scleral בצד החיצוני של השכבה הרשתית מחוברים בחוזקה יחסית לעור וניתן קלופים בעיקר על ידי גלגול את העין בזהירות בצד הקדמי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את העדשה עם מחט טונגסטן אחרי הצד לרוחב של העין חשופה וכאשר העין מחוברת עדיין העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלים אלה מצליח לשמר את השכבה הרשתית כולה עם הרשתית. Choroids משוערת ורקמות scleral ניתן להסיר במידה רבה (איור 1 ג, 'C ו-C "). </li></ol> חלק 4: דגימת רקמות אוסף לעבודה RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימות גזור ניתן לאסוף ב TRIzol בצינור RNase ללא microfuge לאפיון הזרם RNA כפי שתואר לפני 1. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (א) הרוחב (א ') להציג הגבי של ראש הזחל דג הזברה hpf בשעה 52 לפני לנתיחה. (א ') בסעיף היסטולוגית המקביל ראש הזחל ב (א) &amp; (א'). (ב) הרוחב (ב ') להציג הגבי של הרשתית גזור hpf ב 54. פני הרשתית היה שלם משני צדדי ותצוגות הגבי. (ב ') סעיף היסטולוגית המקביל של הרשתית גזור ב (ב) &amp; (ב'). מבנה הרשתית למינציה רשתית היה שלם. בפרט, מטריקס בין תאי השכבה ואת הרשתית קולטי האור (A ", חיצים) השתמרה היטב ברשתית גזור (B", חיצים). (ג) הרוחב (ג') להציג המדיאלי של הרשתית הרשתית המצורפת גזור hpf ב 52. הרשתית היא שכבה שלם ורצוף, אשר הצביעו גם על ידי בסעיף היסטולוגית של הרקמה גזור (C "). אזור לבן" C הוא עצב הראייה (חץ). לבדיקת רקמות, דגימות רקמה נאספו קבוע 4% paraformaldehyde. פלסטיק הטבעה וכן חתך של דגימות אלה בוצעו כמתואר 3. בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים פרדו ועדת שימוש.

Microdissection של רקמות דג הזברה עין יכול למעשה לקבל הרשתיות שלם הרשתית המצורפת הרשתיות. זו מסייעת באופן משמעותי מחקרים ביטוי הנוגעים רקמת עין ספציפיים (כלומר הרשתית הרשתית או). למעשה, יש לנו מנוצל בהצלחה הליכים אלה להשיג פרופילים ביטוי RNA של הרשתית כולה 1 ו 3 הרשתית. השירות של פרופילים אלה נתמכת במידה רבה על ידי זיהוי האחרונות שלנו מסלולים למשפחות הגן, כי הם מודאגים ב בידול רשתית מוטציה 2. השלבים הקריטיים ביותר בהליכים לנתיחה הרשתית הם פעולה צחצ...

<table><tbody><tr><td>מנוע עקה אלחוטי</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח DC</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>כל מקור מתח DC יעבוד. יהיה צורך באופטימיזציה נוספת עבור המתח הספציפי של מכשיר אחר.</td></tr><tr><td>עייך חד-פעמי &amp;מבחנה זעירה (microtube), 1.5 מ"ל (נקייה מ-DNase, RNase ומפירוגנים)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>אלה משמשים לאיסוף רקמות ב-TRIzol לצורך ניתוח ביטוי.</td></tr><tr><td>פינצטה Dumont #5, חודים: 0.05 x 0.01 מ"מ, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>מימד קצה דק הוא רצוי אך אינו מחייב, שכן ייתכן שיהיה צורך להשחיז את הקצה מעת לעת.</td></tr><tr><td>פינצטה Dumont #5SF, חודים: 0.025 x 0.005 מ"מ, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>מימד קצה דק הוא רצוי אך אינו מחייב, שכן ייתכן שיהיה צורך להשחיז את הקצה מעת לעת.</td></tr><tr><td>צלחות תרבית פוליסטירן Falcon, ‏60 X 15 מ"מ</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>לוחות אלו משמשים כלוחות נתיחה.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו Olympus SZX16</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>כל סטראו-מיקרוסקופ יהיה יעיל. במחקרים קודמים השתמשנו בסטראו-מיקרוסקופ של Leica.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; ללא כל תקלות. אנו משתמשים בעדשת 1X בלבד עבור הניתוח, למרות שמותקנת לנו עדשת 2X. </td></tr><tr><td>אבן השחזה</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>השתמשו בכך כדי להשחיז את קצה הפינצטה במידת הצורך</td></tr><tr><td>פלטת חימום</td><td>טוקאי היט</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>זה משמש לשמירה על טמפרטורת הרקמה לאורך כל תהליך הנתיחה, ולהפחתת השפעת תנודות הטמפרטורה על ביטוי גנים. כמו כן, הנחנו את המיקרוסקופ כולו בחדר מבוקר סביבתית בטמפרטורה של 28 מעלות.&amp;#x00B0;C במהלך נתיחה במחקרים קודמים&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; בהצלחה רבה.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>חוט טונגסטן, בקוטר 0.015 אינץ'</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>מקל Applicator מעץ</td><td>פוריטן</td><td>807</td><td>זה משמש להחזקת מחט טונגסטן שנחרטה כימית.</td></tr></tbody></table>

microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

דג הזברה הוא מודל החיה פופולרי למחקר על התפתחות העין בגלל המהירה שלה<em&gt; לשעבר ברחם</em&gt; פיתוח פוריות טובה. על ידי הפריה 3 ימים הודעה (DPF), הזחלים יראה את התגובה החזותית הראשונה. גנים רבים זוהו לשלוט על התפתחות העין הנכונה, אבל אנחנו רחוקים מהבנה מלאה של הארכיטקטורה הגנטית הבסיסית. הגנום כולו הגן פרופיל הביטוי הוא כלי שימושי להבהיר רשת רגולטורית גנטי להתפתחות העין. עם זאת, גודלו הקטן של העין עוברי דג הזברה עושה את זה מאתגר להשיג ברקמות העין שלם וטהור לניתוח הביטוי. לדוגמה, אורך קדמית, אחורית של העין בין יום 2 ו 3 רק כ 200-300 מיקרומטר, כאשר הקוטר של העדשה הוא 100 מיקרומטר פחות. כמו כן, אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) שבבסיס הרשתית היא רק אפיתל שכבה אחת. בעוד הביטוי פרופילים הגן ניתן לקבל העובר כולו, הם לא לייצג במדויק את הביטוי של רקמות אלה. לכן רקמות טהור יש לקבל עבור פרופיל ביטוי מוצלח של פיתוח הגן העין. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גישה microdissect הרשתית הרשתית שלם עם הרשתית מחוברים מן DPF 1-3, אשר מכסים שלבים עיקריים של המורפוגנזה העין. כל הנהלים ניתן לעשות עם מלקחיים בסדר וציוד מעבדה כללי לפי stereomicroscopes סטנדרטי. עבור לנתיחה הרשתית, הרשתית שכבה אחת היא להסיר קילף ידי צחצוח הפעולה ואת הדבקות מועדף של שרידי הרשתית אל פני השטח של הצלחת תרבות לנתיחה. עבור לנתיחה הרשתית המצורפת רשתית, הדבקות של הרשתית הצלחת הניתוח יוסר לפני לנתיחה, כך הרשתית ניתן לשמר לחלוטין עם הרשתית. פעולה הרמת זהיר של רקמה זו יכולה ביעילות להפריד את דמית העין sclera משוערת ו. העדשה ניתן להסיר בשני המקרים על ידי מחט טונגסטן חרוט כימית. בקיצור, הגישה שלנו יכול להשיג ברקמות העין שלמים נוצל בהצלחה כדי ללמוד ספציפיים רקמות ביטוי פרופילים של הרשתית דג הזברה<sup&gt; 1, 2</sup&gt; ו אפיתל הפיגמנט ברשתית<sup&gt; 3</sup&gt;.

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

דג הזברה הוא מודל חיה פופולרי למחקר על התפתחות העין בשל התפתחותו המהירה מחוץ לרחם ופריון גבוה. עד ליום השלישי לאחר...

סרטון זה מציג מיקרו-דיסקציה של רשתית ושל רשתית עם אפיתל פיגמנט רשתי (RPE) צמוד מעוברים של דגי זברה (zebrafish) בגילים של יום אחד עד שלושה ימים לאחר ההפריה. ניתן לבצע את כל הפעולות באמצעות פינצטות עדינות וציוד מעבדה כללי. תחת מיקרוסקופ סטריאו סטנדרטי לדיסקציה של הרשתית, השכבה הבודדת של ה-RPE מוסרת ומוקלפת באמצעות פעולת הברשה והידבקות של ה-RPE לפני השטח של פלטת התרבית.בעבור דיסקציה של רשתית המחוברת ל-RPE, מסירים את תכונות ההדבקה של פלטת התרבית על ידי ריסוק עוברי ושטיפה לפני הדיסקציה. כדי לשמר את ה-RPE שלם, הרמה זהירה של רקמה זו מפרידה ביעילות את הכורואיד והסקלרה מהרשתית המחוברת ל-RPE, ולאחריה הסרת העדשה באמצעות מחט טונגסטן חרוטה כימית. שיטת דיסקציה זו מאפשרת השגה של רקמות רשתית שלמות, והיא שימשה בהצלחה למחקר של ביטוי RNA ספציפי לרקמה ופרופילים של רשתית ושל אפיתל הפיגמנט הרשתי של דגי זברא.שלום, אני Li Jang מהמעבדה של פרופסור UFE Leon במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת Purdue. היום נראה לכם כיצד לבצע דיסקציה של רקמות עין בעוברים של דגי זברה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את רשת הגנים המווסתת את התפתחות העין.בואו נתחיל. שמונה. לפני המיקרו-דיסקציה, הכינו את התמיסות הבאות: E3, תמיסת רינגר בסינון סטרילי ו-5N נתרן הידרוקסיד.בשלב הבא, בצעו תססורת כימית למחטי טונגסטן. הניחו כלי כימי קטן בתוך צלחת פטרי על גבי חימר כדי להקל על הטיפול בכלי ולמנוע שפיכה של נתרן הידרוקסיד. הצמידו מהדק נייר סטנדרטי לדופן הכלי.מזגו נתרן הידרוקסיד ריכוז נורמלי חמישה לכוס כימית עד שהמהדק יבוא במגע עם נתרן ההידרוקסיד. חברו את האלקטרודה השלילית מספק כוח DC למהדק הנייר ואת האלקטרודה החיובית לקצה אחד של חתיכה קצרה של תיל טונגסטן. עטפו את הקצה השני של תיל הטונגסטן בכדור חימר בקוטר ארבעה מילימטרים וטבלו קצה זה לתוך תמיסת נתרן ההידרוקסיד.העלו את המתח לכשלושה וולטים והטבילו את התיל למעלה ולמטה במרווחי של שנייה אחת בתוך תמיסת נתרן הידרוקסיד למשך כ-10 דקות. תיל התונגסטן החשוף לנתרן הידרוקסיד יהפוך לדק יותר בהדרגה, כאשר כדור החימר ייפול מהצד השני של התיל המחובר לאלקטרודה החיובית, ויקבל צורת מחט חדה. שטפו את המחט החדה בתמיסת רינגר או ב-E3 כדי להסיר משקעי מלח, וחברו את המחט למקל עץ בעזרת סרט דביק או מחזיק מחטים לנוחות בטיפול, כדי להכין את העובריים לניתוח.יש להחזיק את דגי ה-super fish הבוגרים בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים בלילה שלפני ההפריה. יש להפריד את דגי ההורים במכלי הטרג במיים סטטיים בזוגות באמצעות מחיצה. יש להסיר את המחיצה לאחר הדלקת האור בחדר למחרת בבוקר, ולאפשר להורים להתרבית במרווחים של 10 דקות בכל חצי שעה, תוך הפרדה של הדגים לאחר כל פעולת הכלאה.שמר את העוברים שנאספו מכל הכלאה בנפרד במצע E3 בטמפרטורה של 28 מעלות צלסיוס. בצע שלב (stage) לעוברים 10 עד 12 שעות לאחר ההפריה, ובצע שלב חוזר מיד לפני הניתוח בנקודות הזמן הספציפיות. השתמש בצלחות תרבית פוליסטירן של Falcon בגודל 60 על 15 מילימטר לצורך הניתוח.לפלטה חדשה שלא נעשה בה שימוש יש תכונה דביקה טבעית לרקמת RPE למשך כ-20 דקות, וניתן להיעזר בה להסרת RPE לצורך דיסקציות של הרשתית. אם נדרשת רשתית עם RPE צמוד, ניתן להתגבר על תכונה דביקה זו על ידי ריסוק מלא של שני עוברים בפלטת תרבית המכילה תמיסת ringer והמתנה למשך 30 דקות לפני הדיסקציה, ולאחר מכן שטיפה יסודית בתמיסת ringer רעננה לפני הדיסקציה. כל הדיסקציות העדינות מבוצעות בהגדלה של פי חמישה עד שמונה במיקרוסקופ Olympus SC X 16 עם עדשה של פי אחת.בעזרת פינצטת Dumont או מחט טנגסטן חרוטה כימית, מחממים את בסיס המיקרוסקופ ל-28 °C. כדי למזער את השפעת תנודות הטמפרטורה לפני תחילת דיסקציית הרשתית, מעבירים עובר בשלב התפתחותי ספציפי לחמישה מיליליטר של תמיסת Ringer בתוך צלחת תרבית Falcon בגודל 60 על 15 מילימטר, שהוכנה כפי שתואר עבור דיסקציית רשתית ללא RRPE. בעזרת הקצה החד של הפינצטה, חותכים במהירות את הראש וחלק מהגוף הקדמי ומסירים את גוף דג הזברה. לאחר מכן, מקבעים בעזרת סיכות את הקצה האחורי של חלק הראש והגוף על צלחת התרבית. בעזרת פינצטת עזר, פותחים את הראש בצד הגבי, החל מהמצח הקדמי.הסיר את המוח כך שהצד המדיאלי של העיניים יהיה חשוף ופונה כלפי מעלה לצורך מניפולציות נוספות. כדי להוציא את הרשתית, השתמש בקצה הפינצטה כדי להבריש בזהירות את ה-RPE החשוף בצדו המדיאלי של העין הפונה כלפי מעלה, עד שייראה פתח קטן לרשתית. המשך בפעולת ההברשה והקילוף עד שרוב הצד המדיאלי של הרשתית יהיה חשוף.הימנעו משריטות או חורים ברשתית החשופה בעת הסרת ה-RPE הלטרלי מרשתית העין הפונה לכיוון צלחת התרבית. שמרו על זווית של כ-45 מעלות מפני השטח של צלחת התרבית והניעו את העין בעזרת הפינצטה. הסירו את ה-RPE המחובר באופן יחסי חזק ל-ora serrata על ידי קיבוע החלק שהסר מה-RPE לצלחת התרבית לצורך הדיסקציה.לאחר מכן, הרימו בעדינות את הרשתית כדי לנקות את שאריות ה-RPE ולהסיר את העדשה באמצעות תכונת ההידבקות של כלי התרבית. היזהרו לא לפגוע בתאי הרשתית, אשר יידבקו אף הם קלות לפני השטח של הכלי. אם העדשה אינה נפרדת באמצעות גלגול, השתמשו במחט טונגסטן חרוטה תוך ביצוע תנועות סיבוביות על פני השטח של העדשה.כדי להתחיל בדיסקציה של רשתית המחוברת ל-RPE, השתמשו בצלחת תרבית Falcon בגודל 60 על 15 מילימטר שהוכנה כפי שתיאר עבור דיסקציה של רשתית המחוברת ל-RPE. העבירו עובר בשלב התפתחותי ספציפי לחמישה מיליליטר של תמיסת רינגר. חתכו את הראש ואת חלקו הקדמי של הגוף.הסרה מהירה של גוף דג הזברה כפי שבוצע קודם לכן. מקבעו את הקצה האחורי של קטע הראש והגוּף על פלטת תרבית. באמצעות פינצטה עזר, פתחו את הראש בצדו הגבי, החל מהמצח הקדמי.הסיר את המוח כך שהצד המדיאלי של העיניים יהיה חשוף ויפנה כלפי מעלה. לצורך מניפולציות נוספות באמצעות פינצטה, הרם בעדינות את העין מהצד הלטרלי האחורי וגלגל אותה לכיוון הצד האנטרי). את רקמת הכורואיד והסקלרה שבחוץ לשכבת ה-RPE המחוברת באופן הדוק יחסית לעור, ניתן להסיר ברובה על ידי גלגול זהיר של העין לכיוון הצד האנטרי).הסר את העדשה באמצעות מחט טונגסטן לאחר חשיפת הצד הלטראלי של העין, ובעוד העין עדיין מחוברת לעור לצורך דיסקציה של הרשתית. ללא RPE ורשתית המחוברת ל-RPE, ניתן לאסוף את הדגימות המבודדות ב-triol בתוך מיקרו-מבחנה ל-RNA לצורך אפיון RNA בהמשך.כאן מוצגת הפרדה מוצלחת של הרשתית ללא RPE, שבה השלמות של הרשתית נשמרת כפי שעולה מפני השטח השלם של הרשתית. החיתוך ההיסטולוגי התואם מראה גם כי ארכיטקטורת הרשתית נשמרה היטב. בפרט, השמירה על המטריצה החוץ-תאית בין שכבת הפוטורספטורים ל-RPE היא טובה במיוחד.הסרה מוצלחת של הרשתית עם ה-RPE צמודה מתאפיינת בשכבת RPE שלמה ורציפה. החיתוך ההיסטולוגי התואם מראה כי הן תאי הרשתית והן תאי ה-RPE נמצאים במצב תקין. ה-RNA הכולל שהופק מהרשתיות שהוסרו הוא באיכות גבוהה.דבר זה בא לידי ביטוי באלקטרופורוגרמה ובתמונת הג'ל שהתקבלו מניתוח הביואנלייזר. קו הבסיס שטוח והפיקים הריבוזומליים של 18 s ו-28 s שלמים. מספר שלמות ה-RNA הוא בדרך כלל גדול מ-9.8.הצגנו בפניכם את נהלי המיקרו-דיסקציה להשגת רשתית עוברית של דג זבbestroute עם ובלי RPE. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי השלבים הקריטיים ביותר בדיסקציה של הרשתית הם פעולת ההברשה באמצעות קצה הפיפטות וגלגול הרקמה. להסרת שאריות RPE, מצאנו כי הנחת המרפקים על משענת זרוע מתכווננת בכיסא במהלך הדיסקציה יכולה לייצב באופן משמעותי את תנועות היד.זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

microdissection-of-zebrafish-embryonic-eye-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

העדשה כוללת פיתוח אינטראקציות עם רקמות אחרות. מספר מוטציות עין דג הזברה מתאפיינים בגודל העדשה קטן באופן חריג. כאן אנו מדגימים השתלת עדשה הניסוי כדי לקבוע אם פנוטיפ זה נובע גורם פנימי או אינטראקציות עם רקמות פגומות המקיפים את העדשה.

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לנתח עדשות של דגי זברה בוגרים וזחלים כדי לנתח את המורפולוגיה של העדשה הקורטיקלית ואת השלמות המבנית של תפרי העדשה.

דיסקציה של עדשת העין: טכניקה לצפייה במורפולוגיה של עדשת דג הזברה

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי להשיג תוצאות לוקליזציה חלבון subcellular על דג זברה הרשתית על ידי התאמת מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

למדו שיטת מיקרודיסקציה לבידוד רשתית עין ואפיתלium פיגמנט הרשתית מעוברי דג זברה בגיל יום עד שלושה ימים. טכניקה זו מאפשרת שימור רקמות שלמות לחקר ביטוי RNA ספציפי לרקמה.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

גלה סרטונים נוספים