עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף
30 ביוני 2010
איברים עובריים מוקדמים תרבות ריאות היא מערכת שימושית מאוד ללמוד אפיתל-mesenchymal אינטראקציות. המורפוגנזה ההכנסות הן אפיתל mesenchymal בתנאים מסוימים, כי ניתן להשפיע בקלות במערכת זו.
בסרטון זה מוצגת שיטה לדיסקציה ולתרבית של ריאות עובריות של עכבר. ההליך מתחיל באיסוף עוברי בשלבים E 11.5 או E 12.5. לאחר מכן, פותחים את העוברי ומחלצים את הריאות.
לאחר מכן, הריאות מושתלות בממשק אוויר-נוזל (liquid air interface) ומודגרות לאחר התרבית. ניתן להבחין בשינויים בצמיחה ובהסתעפות של המזנכימה והאפיתל של ריאת העובר בתגובה לטיפולים ספציפיים באמצעות מיקרוסקופ סטריאומִי. שלום, אני דייוויד וורבורטון.
אני מנהל את התוכנית לביולוגיה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית במכון המחקר Ban בבית החולים לילדים, לוס אנג'לס. ואני ג'אן קארו, פוסט-דוקטורנט בכיר במעבדה של ד"ר וורטון. היום נדגים לכם טכניקה לבידוד ריאות של עוברי עכבר והצבתן בתרבית איברים.
טכניקה זו התפתחה מהתיאור המקורי של טינה ג'קו הלקין ופבלו ברינגס מבית הספר לרפואת שיניים של USC לפני כ-20 שנה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור מורפולוגיית התבססות של lamb. בואו נתחיל.
ביום 11.5 או 12.5 לאחר ההמהלה, הנח עכברה בהריון ששוחטה במועד קבוע באמצעות פחמן דו-חמצני על גבה תחת מנדף זרימה למינרית. רסס ב-70% ethanol. בצע חתך בבטן.
לאחר מכן, תוך כדי החזקת רגליו האחוריות של בעל החיים, הסיר את העור על ידי משיכה כלפי מעלה. פתח את חלל הפריטונאום והוצא את הרחם. העבר את הרחם לשפופרת קונית של 50 milliliter ממולאת ב-hanks balanced salt solution קר או HBSS, ונער בעדינות במשך שתי דקות כדי לשטוף את הדם.
בשלב הבא, יש להעביר את הרחם לצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לדיסקציה. באמצעות מספרי קפיץ, חתוך את דופן הרחם כדי לשחרר את העוברים. לאחר מכן, בעזרת כף מחוררת, אסוף את העוברים והעבר אותם לצלחת פטרי המכילה HBSS והנח אותה על קרח.
המשיכו לעבוד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (מיקרוסקופ dissecting) והתחילו בניתוח של הריאות העובריות. התחילו בהנחת העובר על צדו השמאלי. בעזרת פינצטה, והחזיקו את הפינצטה ביד שמאל, הסירו את הגפה הקדמית הימנית.
חתכו את העובר החל מפתח הגפה והסירו את העור. שלב זה יאפשר לכם לראות את האיברים הפנימיים ולאתר את הלב והריאות עבור השלב הבא. הסירו את הלב.
הריאות העובריות ממוקמות אחורית ללב וקדמיות לעמוד השדרה. לאחר מכן, הפרידו את הריאה השלמה מהעובר. לאחר מכן הסִירו רקמות עודפות ואת הוושט.
לאחר הוצאת הריאות, השתמשו בפיפטת העברה סטרילית כדי להעבירן לצלחת פטרי המכילה HBSS קר על קרח. לכל באער של צלחת פוליסטירן ללא שכבת ציפוי (no clone delta), הוסיפו 0.5 עד 1 ml של D-M-E-M-F 12 המועשר ב-50 units/ml של penicillin streptomycin. לאחר מכן, הניחו ממבנה פוליקרבונט עם חריצים (nucleo polycarbonate track etch membrane) מעל המצע, כאשר הצד המבריק פונה כלפי מטה והצד המחוספס פונה כלפי מעלה.
בעזרת פיפט העברה סטרילית, הניחו ריאה עוברית מבודדת על גבי ממבנה ה-nucleo polycarbonate track etch. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו, כווננו את מיקום הריאה העוברית. הריאה העוברית צריכה להיות בעלת קנה נשימה שלם המונח במצב ישר, כפי שמוצג כאן.
כדי להבטיח שלכל הריאות יהיה אותו לחץ פנימי, העבירו את הצלחת לדגירה בתנאי אינקובטור תאי וטפחו למשך הזמן הרצוי. במקרה זה, ריאות E 12.5 גודלו בנוכחות או בהיעדר FGF9. FGF9 הוא חבר במשפחת גורמי הגדילה של הפיברובלסטים, המשרה התרחבות של המזנכימה ודילטציה של האפיתל בריאות שגודלו in vitro לאחר 48 שעות.
בהיעדר FGF nine, נצפית עלייה בפיצול הענפים. תמונות אלו הן צילומים של ריאה עוברית שצולמו תחת מיקרוסקופ סטריאו. לעומת זאת, ריאות שגודלו במשך 48 שעות בנוכחות FGF nine מראות אפיתל מורחב ומבנה רשתי.
לאחר 24 שעות של תרבית. לאחר 48 שעות, ההשפעה על האפיטל היא בולטת אף יותר. כך הדגמנו בפניכם כיצד להכין תרביות איברים מריאת עכבר עוברית.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להוציא את הריאה מהעובר מהר ככל האפשר כדי להפחית את התדרדרות הרקמה. תודה שצפיתם. אנו מקווים שתמצאו טכניקה זו שימושית.
בהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לבידוד וגידול של ריאות עובריות של עכברים במטרה לחקור אינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימליות. הטכניקה מאפשרת מעקב אחר שינויים בצמיחה ובענפן בתגובה לטיפולים ספציפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה התפתחותית
- רפואה רגנרטיבית
- טכניקות לתרביות איברים
רקע
- תרבית איברים של ריאה עוברית היא חיונית לחקר התפתחות הריאה.
- אינטראקציות בין תאי אפיתל למזנכימה הן המפתח להבנת המורפוגנזה של הריאה.
- השיטה מאפשרת מניפולציה של תנאי התרבית.
- טכניקות קודמות התפתחו לאורך השנים לשיפור התוצאות.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה מהימנה לבידוד ריאות עובריות של עכבר.
- לבחון את השפעותיהם של טיפולים ספציפיים על התפתחות הריאות.
- לספק משאב לחוקרים הלומדים ביולוגיה של הריאה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נתיחה של עוברי עכבר בשלבי E 11.5 או E 12.5.
- בידוד ריאות עובריות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- תרבית של ריאות בממשק נוזל-אוויר.
- מעקב אחר צמיחה והסתעפות באמצעות מיקרוסקופיה.
תוצאות עיקריות
- טיפול ב-FGF9 מוביל להרחבה של האפיתל והמזנכימה.
- הסתעפות מוגברת נצפית בהיעדרו של FGF9.
- ניתן לתעד שינויים במורפולוגיה של הריאה לאורך זמן.
- תזמון נכון של הסרת הריאה הוא קריטי להפסקת התדרדרות הרקמה.
מסקנות
- השיטה יעילה לחקר התפתחות הריאה העוברית.
- טכניקות של תרבית איברים יכולות לחשוף אינטראקציות ביולוגיות חשובות.
- ניתן להשתמש בגישה זו במגוון מסגרות ניסיוניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
מערכת תרבית ריאות עוברית זו מאפשרת חקירה מכניסטית של מסלולי איתות אפיתליאליים-מזנכימליים הקריטיים למורפוגנזה של הסתעפות הריאות. על ידי אספקת פלטפורמה מוגדרת, נטולת סרום, למניפולציה של גורמי גדילה כגון FGF9, היא תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים בתגליות טיפוליות ריאתיות. המודל מציע רלוונטיות טרנסלציונלית לזיהוי מודולטורים של התפתחות הריאה ותיקונה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה פונקציונלית של אותות השראה ממקור מזנכימלי על התבססות (branching) ומורפוגנזה של אפיתל.
- ערך תפעולי: תומך במחקרי הגברה (gain-of-function) ואיבוד תפקוד (loss-of-function) באמצעות חלבונים רקומביננטיים, וקטורים ויראליים או RNAi כדי לאשש את הספציפיות של המטרה.
- ערך ניבוי: מכמת תוצאות מבניות, כגון התרחבות אפיתליאלית והתרחבות מזנכימלית, בתגובה למודולציה של מסלול signal.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מבסס מערכת תרביות של ממשק נוזל-אוויר הניתנת לשחזור לצורך צמיחה עקבית של נתחי ריאה ואנליזה של הסתעפות.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה מורפומטרית של התרחבות אפיתליאלית, התרחבות מזנכימלית ותדירות הסתעפות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- <قابליות הרחבה: תואם לפורמטים של מספר בארות לצורך סריקה מקבילית של תרכובות או הפרעות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מורפוגנזה מוקדמת של הריאה כדי לשפוך אור על מנגנונים של הפרעות מולדות ואסטרטגיות רגנרטיביות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי של מודולציה של מסלולים לבין הערכה פרה-קלינית של התערבויות לתיקון ריאות או לטיפול בפיברוזיס.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה את הדיאלוג בין התאים האפיטליאליים למזנכימליים כדי להפחית עמימות בבחירת מטרות לטיפולים ריאתיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתוך זרימות עבודה של שלבי גילוי מוקדמים, שבהן נבדקת מודולציה ספציפית למסלול במערכת איברים ex vivo רלוונטית פיזיולוגית, לפני תיקוף in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: מסייע בבדיקת היפותזות לגבי גורם גידול פיברובלסטים ונתיבי איתות אחרים בהתפתחות הריאה.
- סריקה: מספק פלטפורמה סטנדרטית להערכת השפעות של תרכובות על מורפוגנזה של הריאה עם תוצרי הדמיה כמותיים.
- אנליטיקה: מייצר נתונים מורפולוגיים ומרחביים המאפשרים השוואה בין תנאי טיפול בקבוצות ניסוייות שונות.
- מחקר תרגומי: תומך ברצף מהבנה מכניסטית למודלים פרה-קליניים של פגיעה בריאה או תיקון התפתחותי.
- שימוש חוזר ארגוני: תנאים מוגדרים ללא סרום מאפשרים התאמה בין מעבדות ופרויקטים החוקרים מורפוגנזה או תיקון ריאתי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במסלולי התפתחות הריאות באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימליות.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולי נתיחה, תרבית והדמיה סטנדרטיים תחת תנאים מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את רמת הביטחון במטרות על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתוצאות מבניות מדידות באיבר מתפתח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות ריאתיות על ידי תיקוף הרלוונטיות התפקודית במערכת התפתחותית רלוונטית לבני אדם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביצוע דיסקציה של עוברים ובטיפול סטרילי ברקמות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- התהליך תלוי בגישה לדגרי תרבית תאים, לכלי העברה סטריליים ולמרכיבי מדיה מוגדרים.
- נדרש תיקנון של שלבי התפתחות העובר (E11.5–E12.5) ותזמון בידוד הריאות כדי למזער שונות.
- התאמה למערכות מודל חלופיות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הדיסקציה והתרבית.
- מגבלות מעשיות כוללות את חלון חיוניות הרקמה והתלות בשלב התפתחותי מדויק של העובר.
