הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח בדיקת מיקרו צילום זול בזמן-lapse עם קפדנות מספקת כדי לייצר תוצאות הניתנות לשחזור וניתנות לכימות. זה מושג על ידי שימוש באטמי סיליקון זולים לשימוש חוזר לבניית לוחות מדיה אגרוס או שקופיות מיקרוסקופ. מתקבלות תוצאות המראות כי קומפלקסים אלה של לוחות נשארים לחים ומחומצנים מספיק במשך יותר משבוע על פני מגוון סוגי מדיה וריכוזי אגר.

בנוסף, מכיוון שמיקרו-צילום זמן-lapse הוא תהליך איטי, השימוש בשמונה מיקרוסקופים זולים עוזר להאיץ את רכישת הנתונים. שלום, אני ריאן טיילור מהמעבדה של ד"ר רוי וולש מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז. היום נראה לכם נוהל ליצירת סרטי זמן-lapse של ביופילמים חיידקיים במעבדה שלנו, נשתמש בהליך זה כדי לחקור התנהגות רב-תאית של ביופילמים של MTI.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, מדוד את צפיפות התאים של תרבית Occus sanus מעורבת לילה עם מד קלוט, העביר מיליליטר אחד של התרבית לתוך שטיפת גלולת צינור צנטריפוגה של 2.5 מיליליטר והשהה מחדש את החיידקים במדיה TPM כמתואר בפרוטוקול הכתוב הנלווה, פיפט ומערבולת כדי להשעות לחלוטין את הגלולה, מה שעשוי לקחת זמן מה. לאחר מכן, הוסף 0.5 גרם ארוס ל-50 מיליליטר TPM, שהיא אמצעי הבדיקה.

הוסף גם 0.5 גרם של aros ל-50 מיליליטר של C-T-T-Y-E, שהוא חיטוי המדיה התזונתי לעיקור. לאחר מכן שמור על המדיה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס בחממה או באמבט מים. תוך כדי בניית מבחן המעקב.

מתחמי צלחות ממשיכים לבנות את מיקרוסקופ הזכוכית של מעקר הלהבה הראשון של הדיסק התזונתי. החלק והניח אטם גומי סיליקון סטרילי בעובי 0.5 מילימטר על גבי השקופית. מכניס כ-300 מיקרוליטר של מדיה C TT YE לתוך הבאר שנוצרה על ידי האטם בשקופית.

חקלאי המדיה C-T-T-Y-E צריך לערום להבות, לעקר מגלשה נוספת ולהניח אותה בזווית על גבי ה-C-T-T-Y-E MEDIA AROS. הגדרת המגלשה בזווית מונעת היווצרות בועות. לאחר שהמגלשה נמצאת במקומה, שמנמן את המתחם יחד עם קליפס קלסר מיני אחד מכל צד.

הנח את הקומפלקס הקצוץ בארבע מעלות צלזיוס ואפשר לאגרו המדיה C-T-T-Y-E להתייצב. זה בדרך כלל לוקח כחמש דקות. לאחר הגדרת האגרו, ניתן להכין את מתחמי הצלחות המשמשים במבחן המעקב.

התחל בהכנת השקופיות לבניית מתחמי הבדיקה. עבור כל להבה מורכבת עוקר שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. הנח אטם חיטוי על גבי אחת המגלשות כדי ליצור את החלק התחתון של הבדיקה.

המגלשה השנייה משמשת להשטחת האגרוס וכמגלשת תמיכה. החלק העליון של הבדיקה הוא תלוש כיסוי. ראשית עטפו שקופית מיקרוסקופ עם סרט תיוג, ואז החלקה של כיסוי זכוכית מעקר להבה והניחו אותה על גבי השקופית העטופה המעוקרת.

החלק כלפי מעלה את השקופית העטופה תומכת בהחלקת הכיסוי, ומונעת ממנה להיסדק. הנח אטם חיטוי על גבי החלקת הכיסוי המעוקר של הלהבה בעזרת מלקחיים. לחץ כלפי מטה על האטמים בשקופית התחתונה ועל החלקת הכיסוי כדי לוודא שהם יוצרים אטימה עם הזכוכית.

אחרת, המדיה במערכים עלולה להתייבש. הנח את אטם השקופיות ואת מכלולי אטם החלקת הכיסוי בצד כשהצדדים המעוקרים כלפי מעלה מכאן והלאה עבדו רק על קומפלקס אחד בכל פעם כדי למנוע מאגרוס המדיה להתמצק, מה שיגרום לאיכות סרט ירודה. התחל בהנחת הדיסק התזונתי.

הסר את קומפלקס הדיסק התזונתי מארבע מעלות צלזיוס. הסר את ליקוי הקשירה ואת החלק הקודם של השקופיות וחושף את ה-C-T-T-Y-E aros שהתמצק כעת באמצעות פיפטה מיקרו-דגימה עם קצה חד פעמי מזכוכית של 100 מיקרוליטר. הסר דיסק תזונתי בקוטר מילימטר אחד גם מאגרו המדיה C-T-T-Y-E והנח אותו בבאר שנוצרה על ידי האטם על החלקת הכיסוי.

לאחר מכן אחזר את אגרוס המדיה TPM מהחממה ופיפטה 300 מיקרוליטר לבאר שנוצרה על ידי האטם על החלקת הכיסוי ומכילה את הדיסק התזונתי. ה-TPM media Agros צריך לערום כדי לשטח את ה-T-P-M-S-A medium aros הנח את אחת השקופיות המעוקרות להבה ללא אטם בזווית על גבי ה-TPM media. הצבת המגלשה בזווית מסייעת במניעת היווצרות בועות.

מהדקים את המתחם יחד עם קליפס קלסר מיני אחד מכל צד. הנח את הקומפלקס הקצוץ בארבע מעלות צלזיוס ואפשר למדיה שנוצרה להתייצב. זה בדרך כלל לוקח כחמש דקות.

לאחר שהמדיה התייצבה, הסר את הקומפלקס מארבע מעלות צלזיוס. הסר את תפסי הקלסר וסחט את קצה המתחם. כדי לשחרר את השקופית העטופה בסרט, הסר את השקופית העטופה בסרט והנח אותה על הספסל לשימוש נוסף.

ואז להשתמש בזוג מלקחיים כטריז. הפרד את קומפלקס האגרוס של אטם הכיסוי ממגלשת התמיכה והשליך את שקופית התמיכה. אל תשתמש בתנועה חטטנית כדי להפריד את קומפלקס אטם החלקת הכיסוי מכיוון שהדבר עלול לגרום לבלימת החלקת הכיסוי או להיצמד למגלשת התמיכה.

לאחר הסרת שקופית התמיכה, הנח את קומפלקס המדיה של אטם החלקת הכיסוי על השקופית העטופה בסרט כשצד האטם כלפי מעלה. הנח את הקומפלקס הזה ליד מבער כדי לאפשר לכל הלחות הנראית לעין להתאדות ממשטח האגרוס החדש שנחשף. אל תתנו לאגרוס המדיה להתייבש יותר מדקה אחת.

מכיוון שזה יכול להשפיע על התנהגות הנחיל של M Zant, המשך לצלחת התאים על קומפלקס הבדיקה החדש שהוכן. לאחר שעודף הלחות התאדה מהכיסוי, אטם האטם, קומפלקס אגרוס שואב 0.5 מיקרוליטר מהתאים המרוכזים להפקדה על המדיה. אירוס לוחץ על קצה הפיפטה לפני שהוא מתקרב לאגרוס המדיה.

טיפת תאים מופיעה בתחתית קצה הפיפטה, מה שמקל על הפקדת התאים מבלי שהקצה ייגע באגרוס המדיה. שקע על פני האגרוס יכול לשנות את התנהגות הנחיל. הזז את הפיפטה ישר כלפי מטה כדי להוציא את התאים במרחק של כמילימטר אחד מהדיסק התזונתי המוטבע.

לאחר מכן משוך את הפיפטה ישר למעלה. בדרך זו, מבטיחים שהנחיל יהיה מעגלי. לאחר הפקדת התאים, הניחו את המתחם ליד המבער כדי לאפשר לתאים להתייבש לא יותר מ -20 שניות.

לאחר הייבוש, יישר את מכלול אטם השקופיות היוצר את תחתית המתחם עם האטם שעל הכיסוי. אטם החלקה מדיה קומפלקס תאי אקרו היוצר את החלק העליון של המתחם. לחץ בעדינות יחד ליצירת אטימה.

נקה את משטחי המגלשה בהחלקת הכיסוי בעזרת מגבון קים כדי להסיר שאריות על מנת למנוע עיבוי. הנח את המתחם על המיקרוסקופ המחומם stage מיד לאחר ניקוי המגלשות כשהמגלשה כלפי מטה והכיסוי מחליק כלפי מעלה. אם נוצר עיבוי, הניחו למתחם השקופיות לשבת על הבמה המחוממת למשך מספר שניות לפני שתתחילו את תוכנת רכישת התמונות.

על מנת להכין את הסרט, בחר את המטרה המתאימה, 2 x 4 x או 10 x במיקרוסקופ. הפעל את המצלמה ואת המיקרוסקופ ובדוק את רמות האור כדי לוודא שהאור אינו חזק מדי. הפעל את המחשב ופתח את תוכנית רכישת התמונות.

לחץ על חלון התמונה החיה והתמקד במיקרוסקופ. התמונה נראית דומה לזו המוצגת כאן. התחל לרכוש תמונות.

הקפד לבדוק את המיקוד באופן קבוע במהלך השעה הראשונה מכיוון שאגר המדיה נוטה להתייצב וגורם למיקוד להיסחף. לאחר השלמת רכישת התמונות, העבר תמונות שנרכשו לאחסון. פרק את קומפלקס המגלשות על ידי השריית 90% אתנול למשך הלילה או TOLA את האטמים לשימוש חוזר.

סרטון דולג זמן זה מראה אותם נתונים לבדיקת המעקב המתוארת כאן. קצב הלכידה הוא תמונה אחת לדקה בהגדלה של פי 20, קצב ההשמעה הוא 60 תמונות לשנייה. סרטון דולג זמן זה מציג אוכלוסייה של תאים שבהם 1% מהתאים מבטאים GFP.

הסרט נערך על ידי מיזוג ניגודיות פאזה לסירוגין ותמונות פלואורסצנטיות. הבדיקה בוצעה על C-T-T-Y-E בקצב לכידת 1% Aros הוא תמונה אחת לדקה בהגדלה של פי 100. סרט דולג זמן זה מציג את תנועתיות הגלישה של M Anthes.

בדיקה זו בוצעה על C-T-T-Y-E בקצב לכידת 1% Aros הוא תמונה אחת לדקה בהגדלה של פי 100. סרטון TimeLapse זה מציג את התנועתיות של P OSA מתעוותת. בדיקה זו בוצעה על LB ב-1% קצב לכידת Aros הוא תמונה אחת לדקה.

בהגדלה של פי 20 קצב ההפעלה הוא 60 תמונות לשנייה. הסרט הזה מראה שסמאר חש בתנועתיות מתפרצת. בדיקה זו בוצעה על LB וקצב צילום של 1% Aris הוא תמונה אחת לדקה.

בהגדלה של פי 20 קצב ההפעלה הוא 60 תמונות לשנייה. סרטון דולג זמן זה מציג תנועתיות החלקה של EGT. בדיקה זו בוצעה על LB ב-0.5%קצב לכידת ורד תג הוא תמונה אחת לדקה שכן הגדלה של קצב השמעה של פי 20 היא 120 תמונות לשנייה בגלל השבריריות של 0.5% התעוררה ב-lv.

בדיקה זו משתמשת באטמים הגדולים יותר שנראים באיור 1 B.זה עתה הראינו לכם כיצד ליצור סרטוני זמן-lapse של ביופילמים חיידקיים. בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לקחת את הזמן ולהיות מדויקים ככל האפשר כדי להשיג תוצאות עקביות.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.