Name: שיטת בידוד של Francisella tularensis הקרומים החיצוניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: למד שיטת בידוד של קרומים חיצוניים מ-Francisella tularensis באמצעות ליזה אוסמוטית ואולטרה-צנטריפוגה במדרגת סוכרוז. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח חלבוני קרום חיצוני וחקר מנגנוני פתוגניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט מתואר נתמכה על ידי מספרים גרנט P01 AI055637 ו U54 AI057156 מ NIAID / NIH. תוכנו הם באחריות הבלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של תוכניות RCE Office, NIAID, או NIH.

יום 1: פ tularensis חיסון צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קפוא פלייט מניות תרבויות פ tularensis על אגר מולר-Hinton בתוספת 2.5% (כרך / כרך) התורם עגל בסרום, 2% (כרך / כרך) IsoVitaleX, 0.1% (wt / כרך) גלוקוז, ו 0.025% (wt / כרך) pyrophosphate ברזל. לגדול פ tularensis ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך כ 24 ח </li></ol> יום 2: פ tularensis התקשורת חיסון נוזלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן החיטוי 1 ליטר בינוני מותאם קטיון מולר-Hinton (המכיל 1.23 mM סידן כלוריד dihydrate ו 1.03 מגנזיום כלוריד hexahydrate mM). כאשר מקורר 37 ° C, תוספת בינוני נוסף עם גלוקוז 0.1% (wt / כרך), pyrophosphate ברזל 0.025% (wt / כרך), ו -2% (כרך / כרך) IsoVitaleX. סנן לעקר (0.22 μ) בינוני לתוך aliquots two-500 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 12 מ"ל של מדיום מולר-Hinton בתוספת ולהעביר לתוך צינור סטרילי פלקון 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאה סטרילי 10-μl חיסון, לגרד loopful גדול של פ tularensis צמיחה של צלחות אגר (מיום 1) וחיידקים להעביר לתוך 12 מ"ל של מולר-Hinton בינוני (ראו שלב 2). פעמים פיפטה פתרון מרובים התפרקות גושים ולהכין ההשעיה חיידקי הומוגנית. אל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סטרילית, לחסן כל כלי של 500 מ"ל עם 5 מ"ל של חיידקי השעיה מ שלב 3. לגדול תרבויות מרק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14-18 שעות עם רעד עדין (190-200 סל"ד על ניו ברונסוויק Innova 2300 סדרה שייקר). </li></ol> יום 3: תמוגה Spheroplasting, אוסמוטי, וצפיפות סוכרוז צנטריפוגה שיפוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג פ תרבויות tularensis מן האינקובטור רועד להסיר aliquot 1-ml מתרבות 500 מ"ל כל אחת כדי לבדוק את צפיפות אופטית, בהתאמה. מצאנו מיצוי אופטימלי קרום תוצאות הבידוד בעת השימוש פ tularensis תאים בשלב מוקדם לוגריתמי של צמיחה, אשר תואמת OD 600 בין 0.2-0.4 (~ 10 יולי - 10 אוגוסט CFU / ml). תרבויות עם 600 OD פחות מ 0.2 לא תניב בכמות מספקת של חומר הממברנה הכולל הדרגתיים סוכרוז הבאים. לעומת זאת, תרבויות עם 600 OD יותר מ 0.4 (מתקרבים לשלב נייח) נמצאו תשואה מעורב קרום fusions. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבויות ב 7500 x ג'למשך 30 דקות ב 15 ° C כדי לאסוף את התאים. אנו ממליצים צנטריפוגה של תרבויות בבקבוקים של 250 מ"ל four צנטריפוגות, כי זה מאפשר הבאים ההשעיה גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant התקשורת מבקבוק כל צנטריפוגה ובתקיפות הברז בקבוקים על חומר סופג כדי להסיר בינוני צמיחה עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות לאחר סיום של צנטריפוגה, להשעות כל גלולה חיידקים מ"ל של 8.75 M 0.75 סוכרוז (ב 5 מ"מ טריס, pH 7.5). כל ארבעת כדורי חיידקי צריך להיות מושעה והועברו (35 מ"ל סך של השעיה חיידקים) על בקבוק של 250 מ"ל סטרילי (עם stirbar קטן) בתוך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ערבוב בעדינות את ההשעיה על תא stirplate, לאט להוסיף 70 מ"ל (2 כרכים) של 10 mM EDTA disodium (ב 5 מ"מ טריס, pH 7.8) במשך 10 דקות. מוסיפים את פתרון EDTA עם קצה פיפטה מתחת לרמת ההשעיה התא, כדי למנוע ריכוז מקומי גבוה של EDTA. Stirbar צריך להיות מסתובב בקצב מספיק כדי לערבב היטב את ההשעיה התא אך לא מהר מספיק כדי לגרום מקציף או היווצרות בועה. לאחר פתרון EDTA נוספה, דגירה הפתרון למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, לאט לאט להוסיף 11 מ"ל (1 / 10 נפח ה) של פתרון ליזוזים 2 מ"ג / מ"ל ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל. ממשיכים לערבב את התא במהלך ההשעיה בנוסף הפתרון ליזוזים. כפי שצוין לעיל, להוסיף את הפתרון ליזוזים עם קצה פיפטה מתחת לרמת ההשעיה נוזל התא, כדי למנוע ריכוז מקומי גבוה של ליזוזים. מאגר פתרונות ליזוזים (2 מ"ג / מ"ל) אפשר להכין לשימוש יחיד aliquots ומאוחסנים ב -20 ° C במשך שלושה עד ארבעה חודשים. דגירה הפתרון שהתקבל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה 30 דקות, להכין בקבוק 1 ליטר סטרילי עם stirbar קטן 530 מ"ל של בטמפרטורת החדר Cellgro מולקולרית כיתה DH 2 O (4.5 כרכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסמוטי lyse ההשעיה תא (משלב 6) על ידי דילול איטי (קצב זרימה של כ -11 מ"ל / דקה) לתוך 530 מ"ל מולקולרית כיתה DH 2 O (מ שלב 7) במשך 10-15 דקות עם ערבוב עדין. בגלל נפח גדול יותר הפתרון בשלב זה, להגדיל את המהירות stirbar כדי להבטיח ערבוב ראויה. Stirbar צריך להיות מסתובב בקצב מספיק ביסודיות לפזר את ההשעיה תא פעם הוסיפו 2 DH O, אך לא מהר מספיק כדי להוביל מקציף או היווצרות בועה. מוסיפים את ההשעיה תא עם קצה פיפטה מונח על החלק התחתון של הבקבוק, סמוך stirbar, כדי להקל על דילול אחיד של celאני ההשעיה. מצאנו כי 25 מ"ל pipettes העבודה הטובה ביותר במהלך שלב זה. בזהירות לפקח על תהליך דילול לקטוע את קצב הזרימה על פי הצורך לפזר הצטברויות מקומיות של תאים, גושים התא, אניצי התא. דגירה הפתרון שהתקבל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב כי בשלב זה נראה כי אחד מאתגר ביותר קריטי להצלחה הכוללת של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, להעביר aliquots 40 מ"ל של התמיסה תמוגה אוסמוטי לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי ו צנטריפוגות XG ב 7500 למשך 30 דקות ב -10 ° C כדי להסיר תאים שלמים ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר בזהירות 27-30 מ"ל של supernatant מהצינור כל חרוטי ו supernatants בריכה בבקבוק 1 ליטר סטרילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 25 מ"ל של supernatant ונקווה, כל אחד, תוך 16 צינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 200.000 x g (44,400 סל"ד הרוטור F50L ב-8x39 ultracentrifuge FiberLite) עבור 2 שעות על 4 ° C. שים לב כי הרוטור כל בעל 8 צינורות, ולכן שלב זה דורש שני הרוטורים ושני ultracentrifuges. לחלופין, להגדיר את השני של 8 צינורות צריך להיות שנערך 4 ° C עד centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות של השלמת בטווח ultracentrifuge, להכין שונה resuspension חוצץ קרום. העברת 8 מ"ל של חיץ ההשעיה קרום (25% [wt / wt] סוכרוז, 5 מ"מ טריס, 30 מ"מ MgCl 2) אל צינור סטרילי להוסיף 1 טבלית של קוקטייל EDTA ללא מעכב פרוטאז ו 375 U של Benzonase. לערבב בעדינות פתרון לפזר מעכב פרוטאז הלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ultracentrifugation, יוצקים בזהירות את supernatants, להפוך צינורות ultracentrifuge על חומר סופג, ובתקיפות ברז צינורות להסיר supernatant עודף. סמן את מיקומו של כל גלולה קרום בטוש לסייע להדמיה. בעדינות resuspend eight כדורי קרום עם μl 600 כל אחד חוצץ שונה resuspension הממברנה. העברת כל resuspension קרום להגדיר הבא של שמונה שפופרות, בעדינות resuspend בשמונה כדורי, ואת הבריכה resuspensions קרום וכתוצאה מכך צינור סטרילי. ממברנות pelleted קשה resuspend, כך ממשיכים להעביר resuspension שונה חוצץ קרום על גלולה עד קליפות מהקיר של הצינור. זה לעתים קרובות יש צורך להשתמש קצה micropipette כדי לגרד את גלולה קרום מהקיר צינור וסיוע בתהליך resuspension. כאשר pipetting, להימנע מקציף או היווצרות בועה. שים לב כי בשלב זה נראה כי אחד מאתגר ביותר קריטי להצלחה הכוללת של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כדורי קרום כבר resuspended ומנותק מכל 16 צינורות, לשטוף כל ארבעה צינורות עם 600 μl של חיץ שונה resuspension הממברנה. לשטוף את צריכה להיות ממוקדת סביב האזור המסומן (קרום כדורית) של צינור אחד. העברת הכביסה לתוך הצינור resuspension הממברנה. חזור על השלב לשטוף את שלוש מערכות הנותרים של ארבעה צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה resuspension קרום עם נדנדה עדין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבזות DNA וסיוע לירידה של החומר הצמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת aliquot קטנה של ההשעיה קרום ולבצע כימות חלבון כדי לקבוע תשואה קרום מוחלט. אנחנו בדרך כלל להכין חי, מדולל 1:1 (ב -2.5% SDS), ו 01:03 מדולל (ב -2.5% SDS) בדגימות קרום, החום דגימות ב 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולהשתמש Assay חלבון BioRad DC לכמת resuspension קרום חלבון ריכוז. סה"כ תשואה חלבון הוא בדרך כלל בין 1.0 מ"ג / מ"ל ​​ו - 1.6 מ"ג / מ"ל. השימוש בחום SDS נדרשים לשחרר OMPs מן הקרומים חילוץ כך כימות מדויק יותר ערך חלבון ניתן להשיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הדרגתיים סוכרוז ליניארי על ידי 1.8 מ"ל כל שכבות של פתרונות סוכרוז (wt / wt, שהוכנו 5 mM EDTA, pH 7.5) תוך 14 x 95 mm-Ultra Clear צינורות ultracentrifuge לפי הסדר הבא: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Layering של gradients סוכרוז היא הקלה ביותר לבצע בעת שימוש pipettor הנורה, לא pipettor אוטומטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוסס על כימות resuspension חלבון קרום (שלב 16), שכבה 1.5 מ"ג resuspension קרום על גבי שיפוע כל אחד. לכל 14 x 95 מ"מ ultracentrifuge צינור בעל קיבולת מקסימלית של 12.5 מ"ל ו, בהתחשב בעובדה 10.8 מ"ל היא מוסברת על ידי הפתרונות סוכרוז משלב 17, אתה לא צריך להעמיס יותר מ 1.7 מ"ל של resuspension קרום לכל צבע. בנפרד לשקול בזהירות להתאים את המשקל הסופי של כל שפופרת צבע סוכרוז (על ידי הוספה או הסרה של resuspension קרום), כך כל צינורות לשקול אותו (± 0.01 גרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדרגתיים סוכרוז לתוך הרוטור SW-40Ti דלי נדנוד צנטריפוגות ב 256.000 x g (38,000 סל"ד) למשך תקופה מינימלית של 17 שעות ב 4 ° C. </li></ol> יום 4: אוסף של שברים שיפוע סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 17 שעות של צנטריפוגה, להפסיק להפעיל צנטריפוגות, ובזהירות להסיר הדרגתיים סוכרוז מן הרוטור SW-40Ti. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי בזהירות את החלק התחתון של צינור מפל סוכרוז עם אתנול 70%, לנקב אתהחלק התחתון של הצינור עם מחט 21g, ולאסוף שברים רציפים 500 μl של שיפוע לתוך צינורות microfuge סטרילית. חזור על הדרגתיים הבאים. שיפוע צריך להיות מותר לטפטף על ידי זרימת כוח הכבידה, כדי לא להפריע את שיפוע סוכרוז. עם זאת, אם נוטף חדל מהחלק התחתון של הצינור שיפוע, כמות קטנה של לחץ יכול להיות מיושם על החלק העליון של הצינור באמצעות אצבע אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מקדם השבירה של כל חלק סוכרוז הדרגתי באמצעות refractometer ו לתאם את השבירה עם צפיפות מסוימת גרם / מ"ל 1. הערכת לוקליזציה חלבון ידי הכנת נציג שיפוע סוכרוז שברים (במרווחים של צפיפות של 0.01, מ 1.11 גרם / מ"ל ​​ל 1.26 גרם / מ"ל) הפרדה SDS-PAGE, להעביר nitrocellulose ו immunoblotting. </li></ol> נציג תוצאות כאשר מבוצע כהלכה, הליך זה תוצאות הפרדה מוחלטת של צ'אט שלפוחית ​​OM מן סוג הן סוג (למשל SchuS4) ו-B (לדוגמא: LVS) זנים של פ tularensis. כפי שמוצג באיור 1, פ 'ב immunoblots נציג OMPs tularensis בתרגום בין צפיפויות של 1.17 ו - 1.20 גרם / מ"ל. לשם השוואה, שדונים בתרגום בין צפיפויות של 1.13 ו - 1.14 גרם / מ"ל. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Immunoblotting פ סוכרוז tularensis צפיפות הדרגתיים. שברים סדרתית נאספו הדרגתיים וצפיפות (g / ml) חושבו בהתבסס על המדדים השבירה. החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועבר nitrocellulose ו immunoblotted לזהות OMP ו חלוקה IMP. MW, prestained סטנדרטים משקל מולקולרי עם הגדלים (ב KDA) ציינה בצד שמאל של כל כתם. LVS, תא lysates שלם של פ tularensis LVS. שיפוע המתאים סוכרוז הצפיפויות הן חלק שצוין לעיל נתיבים בהתאמה. OMPs ו IMPS, כפי שמצוין לשוליים השמאליים, התגלו עם antisera, polyclonal monospecific. תוצאות דומות התקבלו עבור פ tularensis SchuS4.

<ol><li>Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+outer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li>
<li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li>
<li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li>
<li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li>
<li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li>
<li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li>
<li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+live+vaccine+strain%3A+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li>
<li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li>
<li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li>
<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מתאר וריאציה של תמוגה, spheroplasting האוסמוטי, וצפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה &quot;תקן הזהב&quot; עבור ההפרדה הפיזית והעשרה של גראם שליליים OMS חיידקי מרכיבים תאיים אחרים 2, 3, 4. הואיל ואנו בעבר תיאר את היישום של שיטה זו לבידוד OMS מן סוג שני זני A ו-B סוג של פ tularensis 5, מצגת זה מציע נוהל מפורט יותר אופטימיזציה עבור בידוד OM. ואכן, זוהי מקדמה חשובה לזיהוי פוטנציאל משטח חשוף גורמים ארסיות משוערת של הפתוגן הקטלני הזה. המשמעות של הליך זה הודגם על ידי מחקרים במעבדה שלנו מראה כי החיסון של עכברים עם OMPs מטוהרים העניקה הגנה ניכרת נגד סוג ארסית פ tularensis אתגר ריאתי 6. כפי שצוין לעיל, שלב הצמיחה של תאים חיידקיים, למעקב קפדני במהלך תמוגה האוסמוטי, ואת resuspension עדין של כדורי הממברנה הם צעדים קריטיים שנראים לתאם עם להצלחה / כישלון של הליך זה הפרדה הממברנה. אמנם שיטה זו אופטימיזציה היא קפדני ובכפוף השתנות כמה ניסויים, OMS וכתוצאה מכך נראה טוהר משופר להפליא לעומת אלה צבר משימוש של דטרגנטים, ליתיום כלוריד, סודיום קרבונט או 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>סרום מעגלי תורם</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro מים מזוקקים (dH) בדרג מולקולרי&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק פוליקרבונט בנפח 38.5 מ"ל</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה F50L-8x39</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאזאזים מלאה במינימום, ללא EDTA</td><td>קבוצת Roche</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>בנזונאז (Benzonase)</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה כמותית של חלבונים בשיטת DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה Ultra-Clear 14x95 מ"מ</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>רוטור בעלי דליים נערכים SW-40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>רפרקטומטר שולחני מסוג Abbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת בידוד של francisella tularensis הקרומים החיצוניים

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis הוא coccobacillus גראם שליליים תאיים ואת סוכן סיבתי של tularemia המחלה zoonotic. כאשר בהשוואה לפתוגנים חיידקים אחרים, המינון זיהומיות נמוך מאוד (&lt;10 CFU), התקדמות המחלה מהירה, ותחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מראים כי זנים אלימים של Francisella לקודד גורמים ארסיות רומן. משטח חשוף מולקולות, חלבונים בממברנה החיצונית כלומר (OMPs), הוכחו לקדם התא המארח חיידקי הכניסה מחייב, הישרדות תאיים, ארסיות והעלמת החיסונית. הרלוונטיות לחקר OMPs מודגשת עוד יותר על ידי העובדה כי הם יכולים לשמש מגן חיסונים נגד מספר מחלות חיידקים. בעוד OMPs ניתן להפיק חיידקים גראם שליליים דרך בתפזורת מיצוי טכניקות קרום, כולל sonication של תאים ואחריו צנטריפוגה ו / או מיצוי חומרי ניקוי, הכנות אלה מזוהמים לעיתים קרובות עם periplasmic ו / או cytoplasmic (פנימי) קרום (IM) מזהמים. במשך שנים, את &quot;תקן הזהב&quot; שיטה להפרדת ביוכימיות biophysical של IM גראם שליליים הקרומים החיצוניים (OM) כבר לחיידקים כפוף תמוגה spheroplasting ו האוסמוטי, ואחריו צנטריפוגה צפיפות סוכרוז הדרגתי. לאחר שכבתית על שיפוע סוכרוז, OMS ניתן להפריד IMS מבוסס על ההבדלים בצפיפות קליל, האמין להיות מבוססת במידה רבה על נוכחות של lipopolysaccharide (LPS) של OM. כאן אנו מתארים שיטה קפדני אופטימיזציה כדי לחלץ, להעשיר, ולבודד פ הקרומים החיצוניים ו tularensis OMPs הקשורים בהם.

פרוטוקול להפרדת הקרומים הפנימיים והחיצוניים של<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; על ידי תמוגה, spheroplasting האוסמוטי, וצפיפות סוכרוז ultracentrifugation הדרגתי.

שיטת בידוד של Francisella tularensis הקרומים החיצוניים

.Francisella tularensis הוא קוקובצילוס תוך-תאי גרם-שלילי והגורם למחלה הזונוטית טולרמיה. בהשוואה ל...

בידוד של שלפוחיות ממברא outer membrane של Francis Cellis והחלבונים של הממברנה החיצונית הקשורים אליהן מתחיל בליזיס אוסמוטית של תאי חיידקים. חיידקים בשלב לוגריתמי מטופלים באופן רצופי בתמיסות של סוכרוז היפרטוני, EDTA וליזוזים לפני כן הם מדוללים לאט במים דה-יוניים. הליזאטים של החיידקים שנוצרו עוברים סנטריפוגציה במהירות נמוכה, המסירה פסדתיים תאיים ותאים שלא נשברו, ולאחר מכן סנטריפוגיה במהירות גבוהה כדי לשקיע את שלפוחיות הממברנה.בשלב הבא, שכבות של שלפוחיות ממברנה כוללות מונחות על מדרגי צפיפות של סוכרוז כדי להפריד בין שלפוחיות ממברנה פנימית (IM) לשלפוחיות ממברנה חיצונית (OM). ניתן להפריד שלפוחיות OM משלפוחיות IM על בסיס הבדלים בצפיפות הציפה, אשר נחשבים כנובעים בעיקר מנוכחות של ליפופוליסכריד (LPS) בממברנה החיצונית. אימונו-בלוטינג של פракציות עוקבות ממדרגי צפיפות סוכרוז מראה הפרדה מרחבית של חלבון ממברנה פנימית מחלבון ממברנה חיצונית. שלום, אני ד"ר Michael Norgaard, וזהו ד"ר Jason Huntley מהמחלקה למיקרוביולוגיה ב-UT Southwestern Medical Center בדאלאס.היום, ד"ר Huntley תדגים בפניכם פרוצדורה למיצוי, העשרה ובידוד של ממברנות חיצוניות של תאי *Francisella* והחלבונים הממברנליים הקשורים אליהן. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור מולקולות הממוקמות בממברנה החיצונית ובעלות פוטנציאל לחשיפה על פני השטח עבור פתוגן חיידקי תוך-תאי זה. היום שלנו עמוס, לכן בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, הכין וגדל שתי תרביות של 500 מיליליטר של חיידקי FCIs כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב הנלווה. הוצא את תרביות החיידקים מהאינקובטור המנער והוצא aliquot של מיליליטר אחד מכל תרבית לצורך מדידת OD כדי לוודא שהתאים נמצאים בשלב לוגריתמי מוקדם של הצמיחה, המתאימה ל-OD 600 שבין 0.2 ל-0.4. השג תוצאות אופטימליות של מיצוי ובידוד ממברנות כאשר התרביות מגיעות ל-OD 600 הרצוי.השתמשו בארבעה בקבוקי צנטריפוגה של 250 milliliter כדי לצנטריפוג את התרביות ב-7,500 Gs למשך 30 דקות ב-15 degrees Celsius לצורך איסוף התאים. לאחר הצנטריפוגה, הסירו בזהירות את עליית המצע מכל בקבוק צנטריפוגה והקישו בחוזקה את הבקבוקים על חומר סופג כדי להסיר שאריות של מצע גידול. בתוך 10 דקות מסיום הצנטריפוגה, השעו כל משקע חיידקי ב-8.75 milliliters של 0.75 molar סוכרוז ב-five millimolar tris pH 7.5.לאחר השעיה של כל משקע, העבירו את התמיסה לבקבוק סטרילי בנפח 250 מיליליטר המכיל מקלט מגנטי קטן. חזרו על הפעולה עבור ארבעת משקעי החיידקים, עד לקבלת השעיה סופית של משקעי החיידקים בנפח כולל של 35 מיליליטר. ערבבו היטב את השעיית התאים על גבי בוחן מגנטי, אך לא במהירות רבה מדי.כדי למנוע היווצרות קצף או בועות במהלך ערבוב איטי, הוסיפו 70 milliliters של 10 millimolar EDTA לתמיסה במשך 10 דקות. החזיקו את קצה הפיפטה מתחת למפלס תרחיף התאים כדי למנוע ריכוזים מקומיים גבוהים של EDTA. לאחר הוספת ה-EDTA, דגרו את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, תוך כדי המשך ערבוב איטי, הוסיפו 11 milliliters של תמיסת lysozyme בריכוז של שני milligrams per milliliter, עד לריכוז סופי של 200 micrograms per milliliter. המשיכו לערבב את תרחיף התאים במהלך הוספת תמיסת ה-lysozyme. כפי שנעשה קודם לכן, החזיקו את הקצה מתחת למפלס תרחיף התאים.דגרו את התאים עם הליזוזים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך דגירה זו, הכינו בקבל סטרילי בנפח של ליטר אחד עם מגנט Stir bar קטן ו-530 milliliters של מים דה-יוניים בדרגת דיוק מולקולרית לגידול תאים בטמפרטורת החדר.כאשר התאים סיימו את הדגירה, שאבו את תרחיף התאים שעברו ליסיס אוסמוטי באמצעות פיפטה של 25 מיליליטר, המוצמדת לתחתית הבקבוק בסמוך למגנט השקיעה, ודללו את התאים באיטיות אל תוך המים בבקבוק של ליטר אחד במשך 10 עד 15 דקות תוך ערבוב עדין. שלב זה מאתגר והוא קריטי להצלחה הכללית של הניסוי. הערבוב צריך להיות מהיר מספיק כדי לפזר את תרחיף התאים באופן יסודי, אך לא מהיר מדי כדי למנוע היווצרות קצף או בועות, בהתאם לצורך.העלה באיטיות את מהירות המגנט כדי להבטיח ערבוב תקין. עקוב בקפידה אחר תהליך הדילול והתאם את קצב הזרימה או סובב את הבקבוק לפי הצורך כדי לפזר הצטברויות מקומיות של תאים, גושי תאים וסיבי תאים. לאחר הוספת כל התאים, הדגר את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום ההדגרה, העבר מנות של 40 milliliter מתמיסת הליזיס האוסמוטית למבחנות קוניות של 50 milliliter וסבב בצנטריפוגה ב-7, 500 Gs למשך 30 דקות ב-10 degrees Celsius.כדי להסיר תאים שלמים ופסוליות לאחר הצנטריפוגה, הוצאו בזהירות 27 עד 30 מיליליטר של נוזל עלון (supernatant) מכל מבחנה קונית ואיספו את הנוזל בבקבוק סטרילי של ליטר אחד. העבירו 25 מיליליטר מהנוזל המאוגד לכל אחת מ-16 מבחנות אולטרה-צנטריפוגה וסובבו בצנטריפוגה ב-200,000 Gs למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. 10 דקות לפני סיום הצנטריפוגה.הכינו בופר למשחיית ממברנות משונה. ערבבו שמונה מיליליטרים של בופר למשחיית ממברנות עם טבלייה אחת של תערובת מעכבי פרוטאז ללא EDTA ו-375 units של benzo nase בתוך מבחנה סטרילית, וערבבו בעדינות לאחר סבב צנטריפוגציה של התאים המולyses. המשיכו לשחזור משקע הממברנות.עם השלמת העל-צנטריפוגציה של התאים שעברו ליזיס, שפכו בזהירות את העליון (supernatant), לאחר מכן הפכו את המבחנות על חומר סופג והקישו עליהן בחוזקה. כדי להסיר עודפי עליון, סמנו את מיקום כל משקע ממברנה בעזרת מרקר כדי להקל על הזיהוי החזותי. השביו בעדינות שמונה משקעי ממברנה ב-600 µL של באפר למסירת ממברנה משונה (modified membrane resuspension buffer) לכל דגימה.קשה להחזיר את משקעי הממברנה לתמיסוף. לכן, המשיכו להעביר בעדינות את Buffer Resus של הממברנה המודגמת מעל המשקע, עד שהוא נפרד מדופן המבחנה. זהו שלב נוסף המהווה אתגר וקריטי להצלחה הכוללת של הניסוי.במידת הצורך, השתמשו בטיפ של המיקרופיפט כדי לגרד את משקע הממברנה מדופן המבחנה. בזמן הפיפטור הימנעו מהקצפה או מהיווצרות בועות; כוחות גזירה מוגברים יובילו להיווצרות מיצלים מעורבבים, דבר המונע הפרדה של הממברנה. העבירו כל תמיסת רסס של ממברנה לסדרת שמונת המבחנות הבאה.יש להשעות בעדינות את המשקעים שנותרו ולאחד את כל התלויות במבחנה סטרילית. לאחר הוצאת משקעי הממברנה מכל 16 המבחנות, יש לשטוף כל ארבעה מבחנות ב-600 µL של בופר השעיה לממברנה משופר. יש לרכז את השטיפה סביב האזור המסומן בכל מבחנה ולאחד את השטיפה עם הממברנות המושעות.חזור על השטיפה עבור שאר המבחנות. דגרי את תרחיף השחלוף של הממברנה בתנועת נדנוד עדינה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפרק DNA ולסייע בהפחתת חומרים פלוקולנטיים. לאחר מכן, הוצא נפח קטן של תרחיף הממברנה ובצע כימות חלבונים.כדי לקבוע את תפוקת הממברנה הכוללת, הכין דילול של 1:1 ודילול של 1:3 של תרחיף הממברנה ב-2.5% SDS; חמם את תרחיפי הממברנה הבלתי מדוללים, של 1:1 ושל 1:3, בטמפרטורה של 90 degrees Celsius למשך 10 דקות. SDS וחום נדרשים כדי לשחרר O MPS מהממברנות שהופקו. השתמש בבדיקת חלבוני BioRad DC כדי לכמת את ריכוז החלבון בתרחיף הממברנה.תשואת החלבון הכוללת היא בדרך כלל בין 1 ל-1.6 מיליגרם למילליליטר. לאחר קביעת ריכוז החלבון בתכשיר הממברנה, ניתן להפריד את הדגימות במדרג סוכרוז. התחילו בהכנת סדרה של תמיסות סוכרוז ב-EDTA.להכנת מדרגי סוכרוז ליניאריים, השתמשו בפיפט עם נורה כדי להוסיף בשכבות 1.8 milliliters מכל תמיסת סוכרוז אל תוך מבחנות אולטרה-צנטריפוגה מסוג UltraClear בנפח 14 על 95 millimeter, בסדר הבא: 55%, 50%, 45%, 40%, 35% ו-30%. לאחר מכן, הוסיפו בשכבה עליונה 1.5 milligrams של תמיסת השהיה של ממברנות (membrane resus suspension) על גבי כל מדרג. אין להטעין יותר מ-1.7 milliliters של תמיסת השהיה של מממברנות למדרג בודד. שקלו כל מבחנה בנפרד וכווןו בזהירות את המשקל הסופי על ידי הוספה או הסרה של תמיסת השהיה של ממברנות, כך שכל המבחנות ישקלו אותו הדבר. העבירו את מדרגי הסוכרוז לרוטור בעל דליים נתיקים (swinging bucket rotor) מדגם SW 40 TI ובצעו צנטריפוגה ב-256, 000 GS למשך 17 שעות לפחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר 17 שעות של סבב צנטריפוגה, עצור את פעולת הצנטריפוגה והוצא בזהירות את מדרגי הסוכרוז מהרוטור. לאחר מכן, אסוף את הפרקציות. נקה בזהירות את תחתית מבחנת מדרג הסוכרוז באמצעות 70% ethanol.לאחר מכן, נקבו את תחתית המבחנה באמצעות מחט בנחיתה (gauge) 21 ואספו מקטעים עוקבים של 500 µL מהמדרג אל תוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות. יש לאפשר למדרג לטפטף בזרימה מכבידה כדי לא להפריע למדרג הסוכרוז. עם זאת, אם הטפטוף מתחתית מבחנת המדרג נפסק, ניתן להפעיל לחץ קל על החלק העליון של המבחנה באמצעות האצבע.לבסוף, קבע את מקדם השבירה של כל פראקציית גרדיאנט סוכרוז באמצעות רפרקטומטר, וקשור את מקדם השבירה לצפיפות ספציפית בגרמים למילליליטר. העरक את לוקליזציית החלבונים של פראקציות נבחרות מגרדיאנט הסוכרוז באמצעות הפרדה ב-SDS page ואימונו-בלוטינג. להלן אימונו-בלוט של פראקציות מגרדיאנט הסוכרוז ששימש להפרדת הממברנות שהופקו מזן חי של חיסון Freis מלוייס; חלבוני ממבנה חיצוני של Freis, או OMPs, ממוקמים בין צפיפויות של 1.17 ו-1.2 גרמים למילליליטר.בניגוד לכך, חלבונים של הממברנה הפנימית או ips היו ממוקמים בין צפיפויות של 1.13 ו-1.14 גרם למיליליטר. תוצאות דומות התקבלו עבור זן FHU four. הדגמתי כעת כיצד למצות ולבודד שלפוחיות של הממברנה החיצונית של Francis Cellis באמצעות ליזיס אוסמוטי ואולטרסנטריפוגציה במדרג צפיפות של סוכרוז.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בתאי חיידקים בשלבים לוגריתמיים מוקדמים של גדילה כדי לדלל לאט אך בעקביות את תאי החיידקים הללו במים דה-יוניזציה במהלך שלב הגליקו-אוסמוזה, ולהישמר בעת השהיה מחדש (Resuspension) של משקעי ממבנה האולטרסנטריפוגה. בכך מסתיים הליך הפרדת הממברנות שלנו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים העתידיים שלכם.

method-for-the-isolation-of-francisella-tularensis-outer-membranes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Cian, M. B. et al., הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם-שליליים לשברי ממברנה פנימיים וחיצוניים עם התאמות טכניות עבור Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההפרדה של חלקי הממברנה הפנימית והחיצונית של חיידקים גראם-שליליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. שברי הממברנה מטוהרים ומאוחסנים בטמפרטורות נמוכות לניתוח ממוקד של רכיבים ספציפיים לממברנה.

הפרדת שברי הממברנה הפנימית והחיצונית של חיידקים גרם שליליים

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

מקור: יונג, א. ל. ואחרים. וזיקולות ממברנה חיצונית של Legionella pneumophila: בידוד וניתוח הפוטנציאל הפרו-דלקתי שלהן על מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)הסרטון הזה מדגים את הבידוד של וזיקולות ממברנה חיצונית (OMVs) מ-Legionella pneumophila באמצעות צנטריפוגציה סדרתית, סינון סטרילי ואולטרה-צנטריפוגה. ה-OMVs המטוהרים, המועשרים בחלבוני ממברנה וליפופוליסכרידים, מתאימים למחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

בידוד מבוסס אולטרה-צנטריפוגציה של וזיקולות ממברנה חיצונית של Legionella pneumophila

פרוטוקול זה מתאר intratracheal ההזרקות של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis. הליך זה מחקה ריאתי החשיפה של בני אדם סוכן biothreat פוטנציאל זה יכול לשמש כדי לבדוק את החיסון והיעילות הטיפולית נגד tularemia ריאתי.

Intratracheal חיסון של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis

שיטה זו מספקת מסגרת ללימוד שילוב של חומצות שומן אקסוגני ממקורות מארחים מורכבים לקרומים חיידקיים, בעיקר סטייהילוקוקוס. כדי להשיג זאת, פרוטוקולים עבור העשרת ליפופרוטאין חלקיקים מחלמון ביצת עוף ובעקבות הפרופיל חומצות שומן לאחר מכן של פוספוליפידים חיידקיים ניצול ספקטרומטר מסה מתוארים.

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

חיידקים גראם שליליים מייצרים שתי ממברנות בעלי הפרדה. הקרום החיצוני מחולק מהקרום הפנימי על ידי פריפלמטר ושכבת פטיפדוגליקן. היכולת לבודד את הbilayers כפול של חיידקים אלה היה קריטי להבנת הפיזיולוגיה שלהם פתוגנזה.

הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

פרוטוקול זה מפריד בין חלבוני דופן התא והממברנה הבלתי מסיסים לשברים פשוטים (1-5 חלבונים) באמצעות מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF) המבוסס על נקודה איזואלקטרית, ואחריו הפרדה לפי משקל מולקולרי. ניתן להשתמש בשברים המתקבלים ישירות לניתוח אימונולוגי ופרוטאומי ללא טיהור נוסף.

הפרדה ופיצול של חלבוני דופן התא וקרום התא מ-Mycobacterium tuberculosis לניתוח חלבונים במורד הזרם

למד שיטת בידוד של קרומים חיצוניים מ-Francisella tularensis באמצעות ליזה אוסמוטית ואולטרה-צנטריפוגה במדרגת סוכרוז. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח חלבוני קרום חיצוני וחקר מנגנוני פתוגניות.

שיטת בידוד של Francisella tularensis הקרומים החיצוניים

גלה סרטונים נוספים