Name: הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: למד את שיטת ChIP לניטור שינויים דינמיים במודיפיקציות היסטון במהלך ביטוי גנים מופעל בתאי אדם. הפרוטוקול כולל אינדוקציה באינטרפרון גמא, קרוס-לינקינג, סוניקציה ו-PCR בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת וירג&#39;יניה, אוניברסיטת וירג&#39;יניה Cancer Center ו פ תומאס קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון. אנו מודים E. ג&#39;יימס דרנל מעבדה (אוניברסיטת רוקפלר) רוס רוברט לאב (אוניברסיטת פורדהם) של שורות תאים.

תכנון יום לפני ניסוי השבב המתוכנן, התאים צריכים להיות מתורבת, כך מספר מספיק זמין. נניח כי כל CHIP assay ידרוש ~ 1-1.5 7 x 10 תאים. תמיד מתכנן לעשות הן שליליות (IgG) חיובי (נוגדן היסטון מחבת) בקרות ניסויים כפולים. עצה - עבור תאים 2FTGH, כל CHIP assay דורש על אחד 15 ס"מ צלחת רקמה תרבות ב 80% confluency. חלק 1: הכנת הכרומטין ולבצע CHIP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה התרבות לגרום לתאים של פעמים נדרש עם 20 מ"ל של 10% קוסמי עגל בסרום (CCS) / DMEM המכיל IFN-gamma ב 5 ng / mL. החלף את המדיה על צלחות uninduced עם 20 מ"ל של 10% CCS / DMEM גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף קטר, להוסיף 540 פורמלדהיד 37% μL כדי 20 מ"ל של התקשורת (הריכוז הסופי 1%) בצלחת 15 ס"מ. עצה - צלחת הטיה להוסיף את פורמלדהיד לבריכה מדיה - אז הצלחת רוק להפיץ אותו באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר crosslinking להמשיך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף גליצין ריכוז M 0.125 הסופי להפסיק crosslinking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב אבק התקשורת לשטוף תאים פעם עם פוספט 10 מ"ל קרח קר בופר סליין (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים עם מגרד תא ~ 7 מ"ל PBS ולשלב תאים (מתוך 6 לוחות), אשר טופלו זהים שפופרת 50 מ"ל חרוטי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (Beckman Coutler אלגרה 12-R צנטריפוגה) בסל"ד 1800 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לשאוב PBS. עצה - הצמד להקפיא את התא גלולה אם לעצור פה חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב הצפת 4 מ"ל נפיחות (25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 מ"מ MgCl 2, 10 mM KCl, 0.1% NP40. DTT הוסף 1 מ"מ, מעכבי פרוטאז השלם ומקררים על קרח לפני השימוש) והעברת 15 מ"ל חרוטי צינור. עצה - זה נפח המאגר נפיחות מתאים 6 צלחת איגום (~ 6-9 x 10 7 תאים). חיץ פחות או יותר יכול לשנות את יעילות douncing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית התא על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השעיה ל טרום מקורר 15 מ"ל douncer (ויטון) ו dounce 20 משיכות עם העלי א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת dounced תאים חזרה צינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 5 דקות ב 4 ° C ו להתעלמות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה גרעיני (~ 200 μL מ 6 צלחות) ב 3 מ"ל (15 כרכים גלולה) של הצפת Sonication (50 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, deoxycholate נתרן 0.1%, 0.1% SDS. הוסף מעכבי פרוטאז השלם ומקררים על קרח רק לפני השימוש). עצה - זה נפח המאגר sonication מתאים 6 צלחת איגום (~ 6-9 x 10 7 תאים). חיץ פחות או יותר יכול לשנות את יעילות sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate ההשעיה גרעינים על קרח במשך 10 מחזורים (20 שניות on/40 שניות את / משרעת ההגדרה של 8) באמצעות Sonicator Misonix 3000 מצויד microtip. זה בדרך כלל התוצאות שברי הכרומטין בממוצע 200-1000 bps בגודל. טיפ - מכיוון sonicators ישתנו, את היעילות sonication צריכה להיקבע באופן אמפירי. כדי לעשות זאת, לקחת aliquots של μL 20 sonication לפני ואחרי כל מחזור sonication. מחממים אלה דגימות 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. הוסף חוצץ טעינת ה-DNA ולהפעיל תקן 1% agarose / TBE ג'ל לדמיין שברי DNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת sonicated חומר צינור SS34 צנטריפוגה צנטריפוגה ו 20 דקות ב 4 ° C בסל"ד 13000 ב הרוטור SS34 (Sorvall RC6 פלוס צנטריפוגה) כדי גלולה מה הוא בדרך כלל כמות קטנה של פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות כדי להעביר את supernatant צינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש ברור ידי הוספת הזרע 360 μL סלמון DNA / או חלבון G slurry agarose חרוזים נדנדה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. עצה - צעד זה מקטין את הרעש assay העולה מן הלא ספציפית אירועים מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל"ד 1000 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות גלולה חרוזים agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מראש פינה supernatant אל צינור אחר חרוטי 15 מ"ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את A260 יחידות של הכרומטין מראש פינה את ולהתאים את עוצמת הקול עם הצפת Sonication עד ארבע (4) A260 יחידות (0.2 מ"ג / מ"ל ​​בהנחה A260 1 יחידה = 0.050 מ"ג / מ"ל) עצה - כדי למדוד את A260 יחידות, לדלל 10 μL של הכרומטין מראש פינה ב 190 DDW μL; ספקטרופוטומטר ריק עם חיץ 10 sonication μL ב DDW μL 190. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 75 μL של הכרומטין (ב A260 4 יחידות), כמו לדוגמא קלט ולאחסן ב 20 ° C עד מוכן להפוך crosslinks. עצה - שלב זה הוא קריטי לניתוח נתונים. אל תשכחי לקחת את aliquot קלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הכרומטין מוכנים 1.7 צינורות microfuge מ"ל על ice כמו aliquots 1 מ"ל. עצה - אם לעצור כאן, הצמד להקפיא את הכרומטין מוכן על קרח יבש חנות ב -80 ° C. נ.ב.: הכרומטין מאוחסנים יכול להשפיל, ייצור פחות תוצאות אופטימליות, כך להימנע במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את שבב כיתה נוגדנים דגימות המושרה ואת uninduced סטים כפולים. הוסף IgG (2 מיקרוגרם) והפאן היסטון H3 נוגדן (15 μL) כמו שולט שלילי וחיובי על קבוצות דגימות המושרה ואת uninduced. עצה - כמות הנוגדנים להשתמש צריכה להיקבע באופן אמפירי או לראות גיליון מוצר של הספק בסכומים שהציע. בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם של הנוגדן שבב ציון עובד היטב. הכרך המתאים צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור נוגדנים מסופקים כמו בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק כל צינורות לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> חלק 2: אוספים IMMUNOCOMPLEXES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 60 μL של זרע סלמון דנ"א / חלבון או חלבון G slurry חרוזים agarose לכל הצינורות. השתמש חלבון עצה עבור נוגדנים polyclonal ארנב חלבון G עבור נוגדנים חד שבטיים העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק בבית 4 ° C למשך לפחות 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה immunocomplexes (חרוזים agarose) על ידי microfuging בעדינות בסל"ד 2000 על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את immunocomplexes עם 1 מ"ל של כל אחד Buffers לשטוף הבאים במשך 10 דקות עם נדנדה ב 4 ° C. Microfuge 3 דקות בסל"ד 2000 ב 4 ° C בין לשטוף כל לשאוב supernatant. שמור דגימות מקורר על הקרח. הוסף PMSF רק לפני השימוש. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח לשטוף נמוכה - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח לשטוף גבוהה - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LiCl שטפי - 0.25 מ LiCl, 1% NP-40, deoxycholate סודיום 1%, 1 mM EDTA, 10 mM טריס-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE שטפי - שני רוחצת עם TE הצפת -10 mM טריס-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצפת לשטוף הסופי TE ואל חרוזים, להוסיף 500 הצפת elution μL (50 mM טריס-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, SDS 1%). עצה - הצפת elution צריך להיות מוכן טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לערבב חרוזים agarose ב הצפת elution וחום במשך 30 דקות על 65 ° C. עצה - מערבולת כל צינור לפחות כל 10 דקות במהלך זה 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfuge למשך 30 שניות ב 2000 סל"ד ולהעביר את eluent לצינור microfuge חדש. טיפ - במהלך elution, להפשיר דוגמאות קלט ולהוסיף 500 הצפת elution μL לכל אחד. כלול דגימות אלה בכל הצעדים הולך קדימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 M NaCl לריכוז סופי של 200 מ"מ לכל דגימות מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה (או לפחות 4 שעות). </li></ol> חלק 3: ChIP'd לטהר DNA INPUT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfuge כל הדגימות למשך 30 שניות כדי לאסוף עיבוי על העפעפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1μL של RNAse (10 U / μL) אל צינור כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL 0.5 M EDTA, 40 μL 0.5 M-Cl טריס pH 6.5, 2 μL proteinase K (10 מ"ג / מ"ל) ו לדגור על 45 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. עצה הכינו תערובת אמן ריאגנטים אלה ולהוסיף 52 μL על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנול / כלורופורם / isoamyl לחלץ אלכוהול ולאחר מכן כלורופורם / isoamyl אלכוהול לחלץ את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 הגליקוגן μL (25 מיקרוגרם / μL) ו 0.1 כרכים של pH Na Acetate 3M 5.2 ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> חלק 4: ChIP'd לטהר DNA INPUT המשך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Microfuge עבור מינימום של 20 דקות 13,000 סל"ד ב 4 ° C כדי להאיץ את ה-DNA / גליקוגן כדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם DNA / גליקוגן כדורי עם 1 מ"ל של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש או יבש את כדורי במהירות בצנטריפוגה DNA סאוואנט ואקום מהירות. עצה - אל על יבש את ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DNA / גליקוגן כדוריות בתוך מאגר TE 200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA (1 μL) מוכן כימות באמצעות PCR בזמן אמת. חנות ה-DNA שנותרו ב 20 ° C. עצה - שימוש יותר מ 1 μL של DNA יכולים לעכב את התגובות בזמן אמת PCR, כך הסולם בזהירות. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: שבב קלט דגימות DNA הם לכמת עם Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR המערכת) באמצעות פריימרים ספציפיים מוקד הגן של עניין. Primers כי היעד רצף גנומי ידוע להיות מועשר או חסר את השינויים היסטון להיות assayed יכול לשמש בקרות חיוביות ושליליות גם כן. נתונים מוצג כאחוז קלט. ההליך CHIP צריך להיות לגמרי repeated עם שלושה ביולוגיים משכפל כדי להבטיח שינויים דווח שינויים היסטון הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית. ישנם נושאים חשובים שיש להביא בחשבון בעת ​​שימוש בזמן אמת PCR לכמת DNA, כולל עיצוב פריימר, יעילות ה-PCR, ואת הדרך המתאימה כדי לחשב את אחוז נהלים קלט ונורמליזציה. כאשר פרופיל התפוסה שינוי היסטון ברחבי הגן, את יעילות ה-PCR חייב להיות עקבי בין כל זוגות פריימר. יצרן בזמן אמת, מערכת ה-PCR יכולה לספק את המידע האימונים הדרושים. איור 1 מציג תוצאות נציג של הכרומטין immunoprecipitated במהלך ההפעלה של הגן STAT1 IRF1 9, מופעלות על ידי IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תפוסה של STAT1, RNA פולימראז II ו H3K36me3 היא דינמית במהלך ההפעלה של הגן STAT1 IRF1. (A, B, C) ​​שבב עם α-H3K36me3, α-STAT1 ו α-Pol II של הכרומטין שנאספו תאים 2FTGH המושרה עם IFN-γ במשך 30 דקות (ריבועים אדומים), 1.5 שעות (עיגולים כחולים), 5 שעות ( משולשים ירוקים) או uninduced (יהלומים שחורים). IgG הוא שליטה שלילי (אפור חוצה). (ד) פאן H3 הוא שליטה חיובית ומראה את התפוסה היסטון מול מוקד ב (עיגולים כחולים) המושרה ותנאי uninduced (יהלומים שחורים). לטבול סביב נ"ב -5 בשל דלדול הנוקלאוזום שנמצא באתרים להתחיל שעתוק.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול שבב התווה שימש בהצלחה במעבדה כדי assay יותר מעשרים שינויים היסטון אחרת. בנוסף, יש לנו מאופיין בשינויים התפוסה של גורמי שעתוק, היסטון, שינוי אנזימים, חלבונים המזהים שינויים היסטון ואת השנייה RNA פולימראז מכונות שעתוק, בכמה IFN-γ גנים המושרה. השתמשנו גם את ההליך כדי לאפיין שינויים שינויים היסטון במהלך התמיינות של תא סרטני גזע 10. איכות נתונים CHIP בסופו של דבר תלויה האפקטיביות של הנוגדן משמש ויש...

<table><tbody><tr><td>פורמלדהיד 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם/איסואמיל אלכוהול</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז מיני מלאים</td><td>קבוצת Roche</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגלים קוסמי</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>קבוצת Roche</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>קבוצת Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן של חומצה דאוקסיכולית</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>פנול/כלורופורם/איזואמיל</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>סלקיין פוספט מרוכז (Phosphate Buffered Saline)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינז K (Proteinase K)</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז DNA מזרה של סלמון/פרוטאין A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז עם DNA מזרה של סלמון/Protein G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד RNA פולימראז II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

בתגובה במגוון ligands תאית, STAT (מתמר אותות activator של שעתוק) גורמי תעתוק מגויסים במהירות ממצב רדום בציטופלסמה שלהם על פני הקולטנים בתא שבו הם מופעלים על ידי זרחון על שיירי טירוזין יחיד 1. לאחר מכן הם dimerize ו translocate לגרעין לכונן שעתוק של גני מטרה, להשפיע, צמיחה בידול, הומאוסטזיס ואת התגובה החיסונית. באופן לא מפתיע, בהתחשב מעורבות נרחבת שלהם תהליכים בתא נורמלי, dysregulation של הפונקציה STAT תורם למחלות האדם, במיוחד סרטן מחלות אוטואימוניות 2 ו 3. היא מבוססת היטב כי שעתוק מווסתת על ידי שינויים לתבנית הכרומטין 4,5. שינויים אלה כוללים את הפעילות של ה-ATP תלוי קומפלקסים, כמו גם השינויים היסטון קוולנטיים ו מתילציה בדנ&quot;א 6. בגלל הפעלת STAT של ביטוי גנים הוא גם מהיר חולף, זה דורש מנגנונים ספציפיים עבור התבנית ויסות הכרומטין ב STAT תלויי לוקוסים גן. כדי להגדיר מנגנונים אלה, אנו לאפיין את השינויים היסטון והפעילות האנזימטית שיוצרים אותם לוקוסים גן להגיב איתות STAT. פרוטוקול זה מתאר הכרומטין immunoprecipitation, שיטה כי הוא בעל ערך לחקר STAT איתות הכרומטין ביטוי גנים מופעלים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

בתגובה למגוון ליגנדים חוץ-תאיים, גורמי השעתוק STAT (signal transducer and activator of transcription) מגויסים במהירות...

ניסוי ה-ChIP משמש לניטור שינויים דינמיים במודיפיקציות של היסטונים המתרחשים במהלך ביטוי גנים המופעל על ידי STAT1; בדרך זו ניתן לבחון גם שינויים בתפוסה של פקטורי שעתוק, קומפלקסים של מודיפיקציה של היסטונים ומנגנון השעתוק עצמו. כדי להתחיל את הבדיקה, התאים מושרו על ידי interferon gamma להפעלת סיגנליזציה של STAT1. לאחר מכן מבצעים קישור צולב (cross-linking) של התאים באמצעות formaldehyde ואיסופם. לאחר מכן מבודדים את הגרעינים ומבצעים סוניקציה, הפועלת לשבירת הכרומטין למקטעים של כ-200 עד 1000 זוגות בסיסים. בשלב הבא, מוסיפים נוגדן המכוון לחלבון או למודיפיקציית ההיסטון הרלוונטית, ולאחר מכן משקיעים את האימונו-קומפלקסים.שוטפים את הקומפלקסים האימונולוגיים, מבטלים את הקשרי הצלוב וה-DNA מטוהר. ניתן לקבוע את השינויים במודיפיקציות של ההיסטונים או את גיוס חלבונים לאזורים ספציפיים בגן על בסיס אנליזת quantitative realtime PCR של ה-DNA שהושג בהשקעה אימונולוגית. שלום, שמי לורן בורו מהמעבדה של ד"ר מליסה הנדריקסון וממחלקת הביולוגיה באוניברסיטת וירג'יניה.היום נדגים עבורכם פרוצדורה של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation). אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור מודיפיקציות דינמיות של היסטונים המתרחשות במהלך תמלול במורד השפעת סיגנלינג של STAT1. בואו נתחיל.יום אחד לפני תחילת פרוצדורה זו, תרבתו את התאים כך שמספרם יהיה מספיק עבור שני תאי ה-FTGH המשמשים כאן. הכינו צלחת תרבית רקמות אחת בקוטר 15 סנטימטרים ב-80% confluence עבור כל בדיקת שבב. בכל ניסוי כללו בקרת IgG שלילית, בקרת נוגדן pan histone חיובית וכפילויות.כדי להתחיל בהליך זה, יש להסיר את מצע התרבית. החליפו אותו ב-20 milliliters של DMEM מועשר ב-10% cosmic calf serum המכיל interferon gamma בריכוז של five nanograms per milliliter. כמו כן, החליפו את המצע בצלחות שלא עברו השראה ב-20 milliliters של 10%C-C-S-D-M-E-M.המשך את העבודה במנדף כימיים. הטה את צלחת תרבית הרקמה בגודל 15 סנטימטר והוסף 540 µL של תמיסת formaldehyde בריכוז 37% ל-20 mL של מצע גידול. לאחר מכן, נער את הצלחת בתנועות עדינות כדי לפזר את התמיסה באופן שווה.יש להמתין 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הצלבה. לאחר מכן, יש להוסיף גליצין עד לריכוז סופי של 125 millimolar כדי לעצור את תגובת ההצלבה. יש לשאוב את המצע באמצעות ואקום ולשטוף את התאים פעם אחת עם 10 milliliters של PBS קר קרח בעזרת גורד תאים (cell scrapper), לאסוף את התאים לכ-7 milliliters של PBS ולאחד תאים שעברו טיפול זהה משש צלחות של 15 centimeter לתוך מבחנה קונית של 50 milliliters על קרח.לבסוף, סבבו בצנטריפוגה את התאים שנאספו ב-1,800 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ושאבו את ה-PBS. אם עוצרים בשלב זה, הקפיאו במהירות (snap-freeze) את משקע התאים ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחר קשירה צולבת (cross-linking). השלב הבא הוא הכנת הכרומטין.התחילו בהוספת 1 mM DTT ומעכבי פרוטאז מלאים למסלק נפיחות (swelling buffer) שקולל על קרח. השביו את המשקע משישה צלחות, בתוספת 4 mL של מסלק הנפיחות, והעבירו לשפופרת קונית של 15 mL. שימוש בכמות גדולה או קטנה יותר של מסלק עלול לשנות את יעילות הפירוק.דגרו את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות. עם סיום הדגירה על קרח, העבירו את התרחיף לתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר שקוללה מראש. בצעו 20 תנועות של פיפטור (strokes) באמצעות פיפטה. לאחר הפיפטור, העבירו את התאים בחזרה למבחנה קונית של 15 מיליליטר על קרח, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 2,500 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C והסילו את הנוזל העליון (supernatant), כך שיישאר משק הגרעינים (nuclear pellet).הוסף מעכבי פרוטאזה מלאים לבאפר סוניקציה שקושר על קרח. שש פלטות מניבות כ-200 µL של תשובה של משקע גרעיני. תלה את המשקע ב-15 נפחי משקע או ב-3 mL של באפר הסוניקציה.שימוש בנפח שונה עבור כמות תאים זו עלול לשנות את יעילות הסוניקציה. יש לקבוע את יעילות הסוניקציה מראש עבור האטור (ator) במעבדה שלך. במקרה זה נעשה שימוש ב-Miss Sonic sonicate 3000 המצויד במיקרוצ'יפ.בצע סוניקציה לתליה של הגרעינים על קרח במשך 10 מחזורים, כאשר כל מחזור כולל 20 שניות של פעולה ו-40 שניות של הפסקה, בהגדרת אמפליטודה של שמונה. תהליך זה מביא בדרך כלל ליצירת מקטעי כרומטין באורך ממוצע של 200 עד 1000 זוגות בסיסים עם סיום הסוניקציה. העבר את החומר שעבר סוניקציה לשפופרת צנטריפוגה מסוג SS 34 וסבב בצנטריפוגה במהירות של 13,000 RPM למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.בנתב SS 34 כדי לשקיע את שיירי התאים, שהם בדרך כלל בכמות קטנה. העבר בזהירות את הנוזל העליון למבחנה קונית של 15 milliliter על קרח. המשך לשטיפה כדי להפחית את הרקע מאירועי קישור לא ספציפיים.ראשית, בצעו ניקוי מוקדם (pre-clear) של תכשיר הכרומטין על ידי הוספת 360 µL של תמיסת סלרי (slurry) של חרוזי אגרו (agro beads) עם DNA של זרע סלמון וחלבון A או G, וטלטלו בנסיעה (rocking) בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות לפחות. סבבּו בצנטריפוגה ב-1000 RPM למשך חמש דקות ב-4 °C כדי לשקיע את חרוזי האגרו. לאחר מכן, העבירו את העלייה (supernatant) לאחר הניקוי המוקדם למבחנה קונית אחרת של 15 mL על קרח.בשלב הבא, מדדו את הבליעה באורך גל של 260 ננומטר או את יחידות ה-A 260 של הכרומטין. דללו 10 µL של כרומטין שהוכן מראש ב-190 µL של מים מזוקקים פעמיים. עבור הדגימה הלבנה (blank), ערבבו 10 µL של בופר סוניקציה עם 190 µL של מים מזוקקים פעמיים.כוון את נפח הדגימה עם בופר סוניקציה לארבע יחידות A 260. שמור 75 µL של הכרומטין שעבר ניקוי מקדמי (pre-cleared) בריכוז של ארבע יחידות A 260 כדגימת קלט (input) ואחסן בטמפרטורה של 20°C- עד לביצוע ביטול הקשירה (reverse cross links). זכור כי שלב זה הוא קריטי לצורך ניתוח הנתונים.לכן, אין להזניח את לקיחת מנת הדגימה (aliquot) של הקלט; העבירו את יתרת תכשיר הכרומטין למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר במנות של 1 מיליליטר, על קרח. במידה ועוצרים בשלב זה, הקפיאו במהירות את הכרומטין שהוכן באמצעות קרח יבש ושמרו בטמפרטורה של 80°C-.עם זאת, מכיוון שכרומטין מאוחסן עלול להתפרק, מומלץ להמשיך ל-ip. כעת יש להוסיף את הנוגדנים בדרגת chip למערכי הדגימות המושרות והבלתי-מושרות. באופן כפול.בדרך כלל מיקרוגרם אחד עד שניים של נוגדן עובדים היטב, אך יש לקבוע את הכמות באופן אמפירי מראש. הוסף 2 µg של IgG ו-15 µL של נוגדן pan histone H3 כביקורות שליליות וחיוביות לקבוצות דגימות מושרית (induced) ולא מושרית (uninduced). לאחר מכן, נער את כל המבחנות ברוקר למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C לפני השלב של בידוד הקומפלקסים החיסוניים לאחר דגירה לילית עם הנוגדנים.הוסף 60 µL של תרחיף חרוזי salmon sperm DNA protein A או protein giro לכל המבחנות. קרר בטמפרטורה של 4 °C למשך 60 דקות לפחות, כדי לקשור את הקומפלקסים האימונוגניים לחרוזים.שקיע את התסמיכים האימונולוגיים הקשורים לחרוזי ה-agros על ידי סבוב עדין ב-2000 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ושאב את הנוזל העליון. לאחר מכן בצע סדרת שטיפות בבופר, החל בשטיפה במלח בריכוז נמוך ולאחריה שטיפה במלח בריכוז גבוה. לאחר מכן בצע שטיפה בליתיום כלוריד.ולבסוף, שני שטיפות TE לכל אחד מתמיסות השטיפה. יש להוסיף PMSF רגע לפני השימוש, לשטוף עם 1 ml של תמימות עבור 10 דקות תחת נדנוד ב-4 °C, לסובב במיקרוצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-2000 RPM ב-4 °C ולשאוב את העלייה תוך שמירה על הדגימות קרות על קרח. לאחר הסרת שטיפת תמיסת ה-TE האחרונה, יש להוסיף 500 µL של תמיסת לובל (Lucian buffer) שהוכנה טרי לסוכרות, לערבב באמצעות וורטקס את סוכרות ה-aros בתמיסת הלובל ולחמם למשך 30 דקות ב-65 °C.בצעו ערבול ב-Vortex בכל 10 דקות בזמן אלוציית הדגימות, הפשיתו את דגימות הקלט והוסיפו 500 µL של תמיסת אלוציה לכל אחת מהן. כללו דגימות אלו בכל השלבים הבאים. לאחר סיום האינקובציה של הדגימות בטמפרטורה של 65 °C, בצעו סבב מיקרו-צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-2000 RPM והעבירו את ה-EENT למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה.לבסוף, יש לבצע ביטול של הקשירה הצולבת (reverse cross-linking). הוסף sodium chloride בריכוז של חמישה מולארי לריכוז סופי של 200 millimolar לכל הדגימות, וערבב במכשיר vortex באינקובטור בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך ארבע שעות לפחות ועד ללילה. לאחר ביטול הקשירה הצולבת של הקומפלקסים החיסוניים, ניתן לשחזר את ה-DNA הקשור עם סיום האינקובציה ב-65 degrees Celsius.בצעו סבוב במיקרו-צנטריפוגה לדגימות למשך 30 שניות. כדי לאסוף את המעבשים מהמכסים, הוסיפו מיקרוליטר אחד של RNAs לכל מבחנה והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות; לאחר מכן, בצעו טיפול של RNAs לכל מבחנה באמצעות 10 microliters של 0.5 molar EDTA, 40 microliters של 0.5 molo tris chloride pH 6.5 ושני microliters של proteinase K, או סך הכל 52 microliters מתערובת מאסטר (master mix), והדגירו בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך 60 דקות. בצעו אקסטרקציה לדגימות באמצעות phenol chloroform, iso aile alcohol, ולאחר מכן באמצעות chloroform ISO A my alcohol.כדי להשקיע את ה-DNA, הוסף שתי µL של גליקוגן ו-0.1 נפח של sodium acetate בריכוז 3 M, pH 5.2 לכל דגימה וערבב במערבל Vortex; הוסף 2.5 נפחים של 100% ethanol, ערבב ב-Vortex והדגר בטמפרטורה של 20°C- למשך לילה. הוצא את הדגימות וסבב בצנטריפוגה ב-13,000 RPM למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C.שטפו את כדוריות ה-DNA והגליקוגן ב-1 mL של 70% ethanol וייבשו אותן באוויר או באמצעות צנטריפוגת ואקום מהירה. היזהרו לא לייבש את ה-DNA יתר על המידה. השביו את הכדוריות ב-200 µL של TE buffer וכמתו לא יותר מ-1 µL באמצעות real time.ה-PCR המוצג כאן הוא תוצאה של ניסוי ChIP העוקב אחר הדינמיקה של H3K36me3. במהלך השראת interferon gamma של הגן IRF1, נעשה שימוש בנוגדן ל-H3K36me3 כדי להשקיע כרומטין שנאסף מתאי 2FTGH שהושרעו ב-interferon gamma למשך 30 דקות, 1.5 שעות וחמש שעות, כאשר IgG שימש כביקורת שלילית. התפיסות (occupancy) של STAT1 ושל RNA polymerase II נקבעו גם הן בנקודות זמן אלו.תפוסת ההיסטונים לאורך לוקוס הגן IRF1 נקבעה עבור התנאים שאינם מושריים והתנאים המושרים באמצעות נוגדן pan histone three, המשמש גם כביקורת חיובית. הירידה באזור של 5- זוג בסיסים נובעת מהדלדול של הנוקלאוזומים המצוי באתרים של תחילת שעתוק. כעת הצגנו בפניכם את הפרוצדורה לשיקוע חיסוני של כרומטין.בדיקה זו שימושית לצפייה במודיפיקציות של כרומטין המתרחשות במהלך שעתוק של גנים פעילים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לתכנן את תהליך השבירה (shearing) של הכרומטין שלך עם המדריך לפני תחילת ניסוי ה-chip. כמו כן, זכרו לאסוף את דגימות ה-input שלכם.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

למד את שיטת ChIP לניטור שינויים דינמיים במודיפיקציות היסטון במהלך ביטוי גנים מופעל בתאי אדם. הפרוטוקול כולל אינדוקציה באינטרפרון גמא, קרוס-לינקינג, סוניקציה ו-PCR בזמן אמת.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

גלה סרטונים נוספים