Name: איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (MEAs) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: למדו כיצד לגדל, להקליט ולגרות רשתות נוירונים על מערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs) לחקר פעילות רשתית ועיבוד מידע במעבדה. הפרוטוקול מספק מודל מבוקר ללמידה וזיכרון בתרבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי הקבוצה פוטר למתן הערות שלא יסולא בפז על פרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי מלגה הכשרה קלינית מחקר מן האקדמיה האמריקאית לנוירולוגיה קרן אל CMH, מלגה מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) כדי היודנראט (GM08169 ), מענק מ-NIH המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NS054809), ל &#39;רות Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס על היודנראט (NS060392), EFRI NSF מענק (0,836,017), פרס קרן קולטר Translational מחקר, וכן מלגת מחקר translational אל היודנראט (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH אין לחשוף.<br /&gt; היודנראט ו SMP משולמים עבור יועצים AXION Biosystems.<br /&gt; דמי הגשת ועיבוד תשלומים וידאו לכתבה זו ווידאו מומנו באדיבות על ידי Multi-Channel מערכות.

פרוטוקול זה מציג הנחיות כיצד לשמור על תרבות רשתות נוירונים על אלקטרודות מיקרו מערכים כמו גם היכרות עם הקלטה מ ומגרה רשתות נוירונים. חלק מהבעיות הנפוצות יותר כאשר הקלטה של ​​MEAs נדונו גם בסעיף MEA בעיות. ישנן וריאציות מזדמנים בפרוטוקול כפי שנדונו במהלך ולעיתים קרובות שינויים אלה מנוצלים כדי לייעל את התנאים הספציפיים הנדרשים על ידי עיצובים ניסיוניים מסוימים. למרות הקלטה מערכת מגרה המובא כאן מורכב מנהג שלנו נועד NeuroRighter 15 עם preamp MCS, ישנם מספר רב של מערכות אחרות שיכולות לספק ממשק עם רשתות נוירונים. בחירת ההתקנה מסוים יהיה תלוי על הצרכים הספציפיים ניסיוני. הקלטה פשטני ודוגמאות גירוי נמסרו בפרוטוקול זה אולם אלה תרבויות על MEAs יכול לשמש כדי לספק תובנה שאלות מורכבות לגבי הפעילות הסינפטית וקישוריות רשת נוירונים. כאמור, העבודה השוטפת היא ניצול בטכנולוגיה זו כדי ללמוד תהליכים כמו פלסטיות הסלולר, פיתוח excitotoxicity ו ניוון מוחיים. 6-10 לדוגמה, פרסום האחרונות במעבדה שלנו הראה המטרה לשחזור מכוון למידה במבחנה עם גירוי בזמן אמת לולאה סגורה בתגובה לפעילות השוטפת רשת נוירונים 3. למרות תרבויות MEA לעיתים קרובות בררנית ועדין, בזכות הפשטות והנגישות שלהם (לעומת בעלי חיים שלמים), הם מספקים מודל רב עוצמה ללימוד הפעילות העצבית ברמת הרשת.

ספקי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנויה גבי הבקבוק מסנן (150 מ&quot;ל, 0.2μm גודל הנקבוביות; Nalgene # 565-0020) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום עובריים 18 מתוזמן בהריון חולדה נקבה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microelectrode מערכים (ראה תיאור בפרוטוקול, B1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך microelectrode העפעפיים (ראה תיאור בפרוטוקול, B3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ניילון מסננת (40μm, BD פלקון, # 352340) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליפרופילן חרוטי בקבוקונים (סטרילי, 15 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליסטירן פטרי מנות (סטרילי, 35mm ו 100x15mm) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet טיפים (סטרילי, 20μl, 200μl ו 1000μl) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipets סרולוגית (5 מ&quot;ל) </li></ul> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטיחות ביולוגית ארון / זרימה למינרית ברדס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא נגד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים הביתור, מלקחיים (עיקור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ במנדף זרימה למינרית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחשב כף יד חשמלי pipetman </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemacytometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Isofluorane וגז קאמרית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ אור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחשב כף יד pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEA מערכת הקלטה (ראו תיאור, D1 פרוטוקול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכרסמים גיליוטינה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tri-גז חממה (ראה תיאור בפרוטוקול, B15) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרמוס עם aspirator מצורף מכסה המנוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה (35-37 ° C) </li></ul> פתרונות ריאגנטים: BSA פתרון: הפוך את BSA 5% שנאגרו (Sigma A-9418) ב פוספט pH 7.4 מלוחים ולסנן ב 0.2μm. פתרון זה יכול להיות מוכן מראש ומאוחסנים ב 4 ° C למשך מספר חודשים. תא בינוני: שלב 90 בינוני שונה מ&quot;ל Dulbecco של הנשר (אירווין מדעי 9024), 10 מ&quot;ל סוס בסרום (Gibco 16,050), pyruvate נתרן 1ml (100mm, Gibco 11,360), 250 GlutaMAX μl (Gibco 35,050), ואינסולין (הריכוז הסופי 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, סיגמא I-5500) ואז לעבור חם 0.2 מיקרומטר filter.22 ו לאזן את המדיום הסלולרי בחממה לפני השימוש. Dissection פתרון להכנת פתרון papain: 23 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> Dissection פתרון (100 מ&quot;ל המלאי) </td><td> מערבבים לפי הסדר, 0.22 מיקרומטר לסנן ולאחסן ב 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> רכיב </td><td> נפח מ&quot;ל </td><td> הריכוז הסופי (מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> פעמיים מים מזוקקים </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0.58 </td><td> 5.8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0.025 </td><td> 0.25 mM </td></tr><tr><td> 0.5 מ HEPES </td><td> 0.32 </td><td> 1.6 mM </td></tr><tr><td> פנול אדום 0.5% </td><td> 0.2 </td><td> (0.001%) </td></tr><tr><td> 0.1 N NaOH </td><td> 0.2 </td><td> 0.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 0.1 מ &#39;חומצה Kynurenic </td><td> 1.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ APV </td><td> 1.0 </td><td> 0.05 mM </td></tr></table> פתרון זה יכול להיות מוכן מראש ומאוחסנים ב 4 ° C למשך מספר חודשים. DNAse אני: Invitrogen (# 18047019). Aliquots 50μl הם פלאש קפוא המאוחסן ב -80 ° C. Aliquot הוא מופשר בשכונה זרימה למינרית לפני תחילת תהליך ניתוק התא. האנק של פתרון מאוזן מלח: סיגמא (# 4891). פתרון 1X מוכן deionized במים, מסונן סטרילי בבית 0.2μm ומאוחסנים ב 4 ° C. פתרון שינה: הכן ביום של culturing. שלב 98 מ&quot;ל L-15 בינוני (Invitrogen 11,415) עם תוספת 2 B-27 מ&quot;ל (50X, Invitrogen # 17504) ולסנן ב 0.2 מיקרומטר. Laminin פתרון: הכן ביום של culturing. מדולל 20μl של laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) ב בינוני 980 תא μl ריכוז סופי של 0.02mg/ml. 20 aliquots μl של laminin (1mg/ml) מאוחסנים ב -80 ° C ו מופשר רק לפני השימוש. הפשרה צריכה להתרחש על גבי ספסל ולא באמבט מים מהיר מפשיר לפעמים יכול להוביל gelling של laminin. פתרון Papain: 23 10 מ&quot;ל חם של פתרון דיסקציה (לעיל) על 30-32 ° C. הוספת 200 יחידות papain (Sigma P-4762) ו 1.6 מ&quot;ג L-ציסטאין (Sigma C-7880). התאם ל-pH 7.4 עם כ - 14 μl של 0.1 N NaOH. לדגור כ 30 דקות עד CL הפתרוןהאוזניים, מסנן 0.2 מיקרומטר, להקפיא פלאש עם חנקן נוזלי ב 2 aliquots מ&quot;ל 15 מ&quot;ל בקבוקונים סטריליים פוליפרופילן חרוטי ולאחסן ב -80 ° C. הפשירי aliquot ב 35-37 מעלות צלזיוס לפני תחילת הפרוטוקול. Polyethyleneimine (PEI) פתרון: 13 100 μl של PEI (50% w / v, Sigma P-3143) הוא מדולל 100 חיץ נתרן borate מ&quot;ל (0.1 מ-pH 8.4, סיגמא B-9876) לצורך ריכוז סופי של 0.05% w / v. סינון סטרילי ב 0.2 מיקרומטר. זה יכול להיות מוכן מראש ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. מים סטריליים דה מיונן: החיטוי ולאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש. טריפסין (0.25% עם EDTA, Gibco 25,200): Aliquots 1ml הם פלאש קפוא המאוחסן ב -80 ° C. Aliquots הם הפשירו את אמבטיה 35-37 מעלות צלזיוס המים לפני השימוש.

איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (meas)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

במשך המאה שעברה, מדעני מוח רבים ברחבי העולם הקדישו את חייהם כדי להבין איך רשתות נוירונים לעבוד ומדוע הם מפסיקים לעבוד במחלות שונות. מחקרים כללו תצפית neuropathological, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תיוג גנטית, הקלטה תאיים הן נוירונים ניתק וההכנות פרוסה. פרוטוקול זה דן אחר הטכנולוגיה, הכוללת גידול תרביות נוירונים ניתק על מיקרו אלקטרודה arrays (המכונה גם רב אלקטרודה arrays, MEAs). ישנם יתרונות מרובים באמצעות מערכת זו על פני טכנולוגיות אחרות. תרבויות העצבית ניתק על MEAs לספק מודל פשוט יותר שבו פעילות הרשת ניתן להשפיע עם רצפים גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודות מרובים של המערך. כי הרשת היא קטנה, ההשפעה של גירוי מוגבל לאזורים הנצפה, וזה לא המקרה ההכנות ללא שינוי. התאים גדלים בשכבה ביצוע שינויים במורפולוגיה קל לעקוב עם שיטות הדמיה שונות. לבסוף, על תרבויות MEAs יכולים לשרוד במשך למעלה משנה במבחנה אשר מסירה את כל המגבלות זמן ברורה הטבועה culturing עם טכניקות אחרות. 1 המעבדה שלנו ואחרים ברחבי העולם הם ניצול הטכנולוגיה הזו לשאול שאלות חשובות לגבי רשתות נוירונים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ חשמלית מגרה תרבויות על MEAs. ברשתות במבחנה לספק אמצעי פיזיולוגית לשאול שאלות רלוונטיות על הרשת ורמות הסלולר המובילה להבנה טובה יותר של המוח לתפקד תפקוד לקוי.

פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ - ו - גירוי חשמלי תרבויות על MEAs.<em&gt; במבחנה</em&gt; רשתות לספק אמצעי פיזיולוגית לשאול שאלות רלוונטיות על הרשת ורמות הסלולר המובילה להבנה טובה יותר של תפקוד המוח וכשל.

איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (MEAs)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא תרבית, תיעוד וגירוי רשתות עצביות על מערכי מיקרו אלקטרודות. זה מושג על ידי הכנת ריאגנטים ומערכי מיקרו אלקטרודות לתרבית. השלב השני של ההליך הוא ניתוק נוירונים בקליפת המוח מעובר חולדה ביום 18.השלב השלישי של ההליך הוא צלחת נוירונים על מערכי מיקרואלקטרודות ותרבית למשך שבועיים-שלושה. השלב האחרון של ההליך הוא התנסות ברשתות העצביות באמצעות גירוי והקלטה ממערכי המיקרואלקטרודות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פעילות ספונטנית ומעוררת גירוי ברשתות עצביות עם תוכנת הקלטה וגירוי באמצעות תרבית תאים קפדנית על מערכי מיקרואלקטרודות.שלום, אני פרופסור סטיב פוטר. אני מנהל המעבדה להנדסת מוח במחלקת התרבות להנדסה ביו-רפואית בג'ורג'יה טק. המחלקה הזו משותפת עם בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי.ואני צ'אד היילס, פוסט-דוקטורנט במעבדה של ד"ר פוטר. אני גם עמית קוגניטיבי התנהגותי במחלקה לנוירולוגיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. היום אנו הולכים להראות לכם כיצד לתרבית ולטפל בתאי עצב על מערכי אלקטרודות מרובות.כאלה. אנו משתמשים בהם כדי לחקור למידה וזיכרון במבחנה ועיבוד מידע ברשת. אז בואו נתחיל במנדף זרימה למינרית, התחל להכין את מערך המיקרו אלקטרודות של המערכות הרב-ערוציות או פיפטה MEA 100 מיקרוליטר של פוליאתילן אמין למרכז MEA נקי וסטרילי המונח בצלחת פטרי של 100 מילימטר כדי למנוע נזק לאלקטרודות.לעולם אל תיגע בחפצים מוצקים במשטח המזרח התיכון ואפריקה. כיסה קלות את המנה במכסה סטרילי המצויד בקרום טפלון חדיר גז ודגירה במכסה המנוע למשך 30 דקות. מכסה קרום הטפלון מספק חילופי גזים עם אידוי מינימלי ויכולת תרבית בסביבות לחות נמוכות יותר.הלחות הנמוכה יותר מאפשרת שימוש באלקטרוניקה עדינה בחממה ומפחיתה את שיעורי הזיהום. שאפו את ה-PEI, שטפו את ה-MEA שלוש פעמים עם מיליליטר עד שניים של מים סטריליים נטולי יונים. הניחו להם להתייבש כשהמכסה סגור במכסה המנוע למשך 30 דקות לפחות או עד שהם יבשים לחלוטין.השלם דיסוציאציה של נוירונים בקליפת המוח E 18 כמתואר בחלק הטקסט של פרוטוקול זה. מסננים את התאים לאחר הסינון. העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והביאו את נפח מתלה התא לארבעה מיליליטר עם מדיום התא בזהירות.שכבה של 500 מיקרוליטר של תמיסת BSA 5% מתחת לצנטריפוגת תרחיף התא ב-200 Gs למשך שש דקות. בזמן שהתאים מסתובבים, בדקו שה-MEA יבש לחלוטין. פיפטה בזהירות 20 מיקרוליטר של תמיסת למינציה למרכז ה- MEA.הימנע מהכנסת בועות אוויר וודא שכל האלקטרודות מכוסות. הנח בעדינות את מכסה הטפלון על ה-MEA כדי למנוע אידוי של הלמינין. ה-MEA צריך להיות על משטח שטוח לחלוטין בעת הנחת המכסה.אחרת, הלחץ עלול לסדוק את תחתית הזכוכית של המערך. דגרו את המנה בחום של 35 עד 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, 9% חמצן ו-65% לחות למשך 20 דקות. כעת העבירו את התאים המסתובבים למכסה המנוע.כדור תא צריך להיות גלוי בתחתית הצינור. הסר ושמור את הסופרנטנט במקרה של כדורים לא שלמים. השעו בעדינות את הגלולה.ספרו את מספר התאים ב -10 מיקרוליטר של המתלה על ציטומטר המו ודללו את התרחיף לריכוז הרצוי. בדרך כלל 1000 עד 3000 תאים למיקרוליטר עם מדיום תא. לאחר השלמת הדגירה של הלמינציה של המערך, שאפו את הטיפה מיד.פיפטה 15 עד 20 מיקרוליטר של מתלה התא מעל האזור המצופה למינציה של ה-MEA. מכסים את התבשיל במכסה הטפלון ומכניסים לחממה למשך 30 דקות. תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה, בדוק את המנה כדי לוודא שהתאים נדבקו ומכסים את כל האלקטרודות.אם הכיסוי אינו שלם, הוסף תאים נוספים ודגירה מחדש. הציפו לאט את המנה במיליליטר אחד של מדיום תאים מאוזן מחומם. החזירו את מכסה הטפלון והחזירו את המנה לחממה למשך 24 שעות.למחרת. תחת מיקרוסקופ ניגוד הפאזה, בדוק שהתאים המתורבתים נדבקים ושכמות הפסולת ומוות התאים מוגבלת עם טיפול והזנה נאותים. כפי שמוסבר בטקסט הנלווה, נוירונים שגודלו בדרך זו יכולים לשרוד יותר משנה.לאחר שבועיים-שלושה, התרביות הגיעו למצב יציב של פעילות וניתן להקליט אותן מהסרטון הזה ידגים כעת הקלטה עם תוכנית הכותב הנוירולוגי בהתאמה אישית. העבירו את המנה לחממת ההקלטה שוב בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, 9% חמצן ו-65% לחות. כדי לשמור על טמפרטורה ו-pH אידיאליים, בעת הזזת המנה, נשא אותה במקביל לקרקע והימנע מתנועות מהירות שעלולות לעקור את התאים מהמצע.הרם את ה-MEA מהצלחת והנח אותו במערכות הרב-ערוציות. הקלטת מגבר Preem, תוך הקפדה על התאמה נכונה של הקרקע הפנימית עם הארקת מגבר Preem. המגבר המקדים יושב על מכשיר פרווה, המתפקד לפיזור חום כמתואר בטקסט הנלווה כאן, המגבר המקדים הועבר מהחממה.עדיף להראות ישיבה נכונה של המנה. השתמש במגבון רטוב באתנול 70% כדי לנקות את המגעים סביב היקף המערך. ודא שה-MEA יושב כהלכה, נמוך יותר ונעל את המכסה.השתמש במקלון צמר גפן כדי ליישר את המגעים של המערך במידת הצורך. ב-neuro writer, בחר הגדרות המתאימות לניסוי. יש להפוך את מתג ההקלטה כלפי מעלה.כדי לכתוב את הנתונים לקובץ, לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל בהקלטה. מסך הספייק יציג כעת עקבות רצים של פעילות ורעשי רקע עם פוטנציאל פעולה ופרצי פעילות מדי פעם. אם אלקטרודה מציגה יותר מדי רעש, ייתכן שיש סיכה לא מיושרת על מכסה המגבר המקדים, חתיכת אשפה קטנה, טיפת מדיום, משטח אלקטרודה מושפל או קרום שקוף חופף מהמכסה המשבש את המגע.בדוק את סיכת המגע והתאם בעזרת צמר גפן ספוג באתנול 70% במידת הצורך. לחץ על לשונית צורת הגל של הספייק כדי לשנות את תצוגת המסך למצב זיהוי ספייק שבו פוטנציאל הפעולה מוצגים בחלונות סטטיים באורך שלוש אלפיות השנייה. כדי לעורר את הרשת העצבית ב- MEA אמן את אלגוריתם הסלפה תחת לשונית הגדרות ההקלטה כדי להגביל את חפץ הגירוי, הפעל את salpa בכרטיסיית ההגדרות המקוונת.לאחר תחילת ההקלטה, לחץ על הכרטיסייה STEM כדי להגדיר פרדיגמת גירוי מתאימה לשימוש בתוכנית הלולאה הפתוחה כדי לעורר אלקטרודה אחת ולצפות בתגובות במנה. בחר את ההגדרות המתאימות בקטע הלולאה הפתוחה ולאחר מכן לחץ על התחל. הצג תגובות באופן חזותי בכרטיסייה הראשית של Spikes ובכרטיסייה Spike Wave Forms.סרט זה מתאר התפתחות ביום מבחנה שבעה נוירונים ותאי גליה כשהם גדלים ויוצרים רשת מחוברת על MEA עבור מיקרו אלקטרודות נראות. זוהי עלילת רסטר של שתי דקות של פעילות ספונטנית מרשת עצבית. כל נקודה שחורה מייצגת פוטנציאל פעולה.שני פרצי פעילות מסומנים בחצים הכחולים. התגובה על פני מספר אלקטרודות היא פונקציה של קישוריות הרשת. הנה תרשים רסטר של 16 שניות של פעילות מעוררת גירוי.כוכבים אדומים מייצגים גירויים. החצים האדומים מראים חמישה גירויים שגרמו בהצלחה להתפרצויות של פעילות סינפטית על פני אלקטרודות מרובות. לפעמים גירוי לא מניב פרץ.כאן בחץ הכחול, זה עתה הראינו לכם כיצד להקליט ולעורר רשתות עצביות על מערכי מיקרו-אלקטרודות. כנראה שהדבר החשוב ביותר לדאוג לגביו הוא למנוע מהתרביות להידבק ולהפחית את האידוי. אם משתמשים במכסים עם ממברנות חדירות למחצה כאלה, הם אטומים ומונעים אידוי וזיהום, וייתכן שתוכלו לתרבית את התרביות במשך חודשים, אולי אפילו יותר משנה.אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

how-to-culture-record-stimulate-neuronal-networks-on-micro-electrode

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דרך חזקים כדי ללמוד מפולות העצבית, כלומר בקנה מידה משתנה במרחב ובזמן פרצי פעילות, מעיד על דינמיקה מצב קריטי בקליפת המוח. מפולות לצאת באופן ספונטני בפיתוח בשכבות השטחיות של קליפת תרבותי המאפשר לטווח ארוך מדידות של הפעילות עם מערכים מישוריים משולב רב אלקטרודה (MEA) בתנאים מבוקרים בדיוק.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

סרטון זה מדגים את התפתחותה של תרבית עצבית תלת-ממדית המשולבת למערך מיקרואלקטרודות מישורי עם נוירונים בהיפוקמפוס. תאי העצב המבודדים יוצרים רשת דו-ממדית על האזור הפעיל של מערך המיקרואלקטרודות ונצמדים למיקרו-כדוריות זכוכית בצלחת מרובת בארות עם החדרת קרום. כאשר מעבירים את המיקרו-כדוריות מצופות הנוירונים האלה לאלקטרודה, הן מתארגנות לרשת עצבית תלת-ממדית מקושרת.

בניית רשתות נוירונים תלת-ממדיות המצומדות למערכי מיקרו-אלקטרודות

הסרטון מדגים כיצד להשתמש במערך מיקרואלקטרודות (MEA) כדי להקליט את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של תאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פעילות אלקטרופיזיולוגית מ-MEA רב-באר המכיל תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים נרשמת כדי לזהות פוטנציאלי פעולה מתאי עצב מרובים ברשת, מה שמאשר את ההתמיינות המוצלחת של hiPSCs לנוירונים.

מדידת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של רשתות נוירונים באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות

סרטון זה מדגים הקלטה של פעילות עצבית ספונטנית ותלויית גירוי מתרביות נוירון גנגליון ספירלי ראשוני (SGN) במערך מרובה אלקטרודות (MEA). זה כרוך בשטיפה והכנה של MEA, רישום פעילות עצבית ספונטנית, והפעלת גירויים חשמליים מבוקרים כדי לזהות פעילות עצבית תלוית גירוי.

ניתוח הפעילות העצבית בתאי עצב ראשוניים של גנגליון ספירלי מורין באמצעות מערכים מרובי אלקטרודות

סרטון זה מציג הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתרביות אורגנוטיפיות של פרוסות חוט השדרה, שצולמו באמצעות מערך מרובה אלקטרודות או מכשיר MEA. הקלטות אלה מעריכות התחדשות עצבית בין הפרוסות. הפעילות החשמלית המסונכרנת שנצפתה מאשרת רגנרציה עצבית מוצלחת.

רישומים אלקטרופיזיולוגיים להערכת התחדשות עצבית בפרוסות חוט שדרה בתרבית משותפת

סרטון זה מדגים את הליך השימוש במערך רב-אלקטרודות (MEA) למדידת פיזיולוגיה סינפטית בספירות קוקולטורה תלת-ממדיות. שיטה זו מאפשרת להבין את הדינמיקה של הרשת העצבית ואת פעילות פרץ הרשת הסינפטית בתוך הספירות התלת-ממדיות.

שימוש במערכים מרובי אלקטרודות למדידת פיזיולוגיה סינפטית בספירות קוקולטורה תלת-ממדית

סרטון זה מדגים הקמת תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים להקלטת פעילות הרשת העצבית. עם ביסוס התרבות המשותפת של נוירונים מוטוריים ואסטרוציטים על לוח MEA (Multi-electrode Array – Multi-Electrode Array – MEA), הפעילות החשמלית הקצבית הסינכרונית של הרשת העצבית נרשמה באופן חוץ-תאי באמצעות MEA.

רישום הפעילות האלקטרופיזיולוגית של הרשת העצבית בתרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים

בעבודה זו, מודל ניסיוני חדשני שבו תרביות עצביות תלת-ממדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs) presented. 3D רשתות נבנות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית שעליהם גדלים נוירונים ויוצרים מבנים תלת-ממדיים המחוברים זה לזה.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נוירונים של גנגליון ספירלי עכברי ראשוני על מערכי אלקטרודות מרובים כדי לחקור פרופילי תגובה עצבית ולייעל את פרמטרי הגירוי. מחקרים כאלה נועדו לשפר את ממשק הנוירו-אלקטרודה של שתלי שבלול כדי להועיל לשמיעה אצל מטופלים כמו גם לצריכת האנרגיה של המכשיר.

ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות

תאים עצביים עכבר מתורבת על מערכים אלקטרודה רב להציג עלייה בתגובה בעקבות גירוי חשמלי. פרוטוקול זה מדגים כיצד נוירונים תרבות, כיצד להקליט פעילות, וכיצד להקים פרוטוקול להכשיר את הרשתות להגיב על דפוסי גירוי.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

למדו כיצד לגדל, להקליט ולגרות רשתות נוירונים על מערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs) לחקר פעילות רשתית ועיבוד מידע במעבדה. הפרוטוקול מספק מודל מבוקר ללמידה וזיכרון בתרבית.

איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (MEAs)

גלה סרטונים נוספים