Name: הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: למדו שיטת חלון גולגולת דק לדימוי מיקרוגליה בעכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים מורפולוגיים בתגובה לדלקת עצבית כרונית ולחלבון HIV-1 Tat לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אמילי א קלי לעיצוב צלחת ראש. אנו אסירי תודה על התמיכה של פרסים NIH כדי חג: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 ואת התמיכה הנדיבה של קרן Waasdorp Pediatric Neurology ג&#39;פרי שבלעדיו עבודה זה לא היה אפשרי. AKM ממומן על ידי NIH (EY019277), וייטהול קרן, פ אלפרד סלואן קרן פרס קריירה במדעי ביו מן הקרן Wellcome בורוז. MET ממומנת על ידי de la משוכלל ונדיר Fonds en סנטה du קוויבק (FRSQ) בפרס אימון דוקטורט. DFM הוא חניך בתוכנית הכשרה רפואית המדען, שמומן על ידי NIH GM07356 T32 ו T32 AI049815.

1. הכנת בעלי חיים עבור הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים שלנו, אנו משתמשים מבוגרים CR CX 3 1 עכברים GFP / + המבטאים GFP ב שושלות תאים mononuclear, כולל microglia. 4 זנים שונים של עכברים יכול לשמש כדי לענות על הצרכים של פרוייקט ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל של שלוש תרופות בהיקף של 0.05 מ"ג / ק"ג פנטניל, 5.0 מ"ג / ק"ג Midazolam, ו 0.5 מ"ג / ק"ג Medetomidine. 5 הכנה כירורגי TSCW מתחיל אחרי החיה כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון כמו קמצוץ הזנב. במהלך הניתוח והדמיה, אנחנו ממשיכים את החיה על כרית חימום כדי למנוע שלאחר ההרדמה היפותרמיה. במידת הצורך, במינון של המאיץ שליש מנה המקורי של קוקטייל ההרדמה יכולה להינתן כדי לשחזר את המטוס המקורי הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי העיניים של החיה במשחה עיניים הגנה כדי לשמור על עיניים לחות במהלך ההרדמה, אשר מדכא את רפלקס מצמוץ של החיה. הסר את השיער מהקרקפת של החיה באמצעות סכין גילוח, מספריים, מספריים, או בשיטות כימיות. לחטא את הקרקפת בעזרת 10% povidone-יוד פתרון אתנול 70%. כל מכשירי ניתוח צריך להיות autoclaved, מעוקר עם מעקר חרוזי זכוכית, או לחטא עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע של הקרקפת בעזרת מספריים קטנים, החל מ 4-5 הזנב לגולגולת וקידום קדימה הקדמי של העיניים. חשוב כי חתך זה יהיה מספיק זמן, כי העור לא יפריע הדבקה הצלחת ראש המשמש לייצב את הראש במהלך עכבר שני הפוטונים הדמיה (איור 1). זהה את האזור להיות דליל תחת בהיקף לנתח. הימנע תחומי עניין ממוקם ישירות מעל התפרים הגולגולת, כמו הגולגולת היא יציבה פחות באזורים אלה שבבסיס כלי גדול קרומי המוח יפריע הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל אתנול 100% ואחריו פתרון 10% כלור וברזל במקלון צמר גפן סטרילי לייבש את קרום על גבי הגולגולת לגרד אותם באמצעות פינצטה קנס או סכין גילוח. אי להסיר את התוצאות ממברנות ב מצורף ראש יציב צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שכבה דקה של דבק 910 Permabond מסביב לקצוות של חלון הצפייה מתחת לצלחת את הראש. מניחים את צלחת ראש מצופה דבק על פני שטח של הריבית על הגולגולת של החיה עם לחץ קל (איור 1). חשוב כי את הצלחת ראש מודבק רק לעצם הגולגולת. כל העור או הקרומים כי הם לכודים בין צלחת את הראש ואת הגולגולת תקטין את יציבות הקשר. למרוח כמות קטנה של Acrylate סביב החלון צפייה באמצעות מזרק באופן מיידי את הדבק האג"ח. לבסוף, להחיל כמות קטנה של Loctite 454 את הקצוות של חלון הצפייה כדי למנוע הדלפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג את הצלחת ראש לבעל החי (איור 1) לבדוק את היציבות של צלחת ראש תחת בהיקף לנתיחה על ידי חיטוט קל עם זוג מלקחיים. לא צריך להיות שום תנועה של הגולגולת ביחס צלחת את הראש. מניחים טיפת מלח על חלון הצפייה על מנת להבטיח שאין נזילות. </li></ol> 2. הכנת חלון גולגולת דליל קליפתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת דליל הגולגולת, לייבש את הגולגולת באמצעות שילוב של צמר גפן סטרילי אוויר דחוס. אנו דק בתחילה את הגולגולת עם קצת לקדוח סטרילי 007 IRF בתרגיל Microtorque השנייה להגדיר 4000 סל"ד. בעדינות רבה, להתחיל דליל בקוטר 2-2.5 מ"מ באזור מעגלי של הגולגולת. השתמש בתנועות גורף האור היחיד כמעט מקבילים הגולגולת; להשתמש שום לחץ כלפי מטה ישיר. עצור קידוח כל 20-30 שניות כדי להסיר אבק העצם באמצעות אוויר דחוס. אלו הפסקות לאפשר קידוח בגולגולת להתקרר כך שאין נזק חום הנגרמת על רקמת המוח הבסיסית. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו קידוח מתקדמת, להבחין במעבר לשכבה moister העצם הספוגית (כלומר "diploe"). ברגע זה שכבת הוא הגיע, זהירות נוספת עם המקדחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם לבדוק את הרזון של הגולגולת על ידי הצבת מלוחים מעל האזור דליל וצפייה מתחת למשטח הביתור. תמיסת מלח יהיה עוד יותר לאפשר פיזור חום. כמו הגולגולת הוא דליל, vasculature קטן הופך לגלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microblade שיניים סטרילי כדי להשיג את סופי דליל תחת מלוחים, כמו microblade מספק משוב משושי הרבה יותר על היציבות של הגולגולת. זה מאפשר ההכנות הרבה יותר רזה עם המקדחה לבד. מניסיוננו, עובי הגולגולת האופטימלי הוא 10-30 מיקרומטר. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לבדוק את הרזון של הגולגולת תחת מספר פעמים epifluorescence במהלך הניסיונות הראשונים בקבלת חלון גולגולת דקה. חדות ועומק microglia גלוי vasculature לתת אינדיקציה טובה לגבי מועד חלון מוכן הדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלון מוכן, דבק פיסת מחוייט מלבני # 0 coverglass wi ה ממד של פחות מ 2 מ"מ בכל צד מעל החלון. שימוש בקוטר 1.0 מ"מ טפטפת זכוכית, מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate באזור הגולגולת דליל בזהירות למטה חתיכה קטנה של coverslip, ולאחר מכן לחצו בעדינות על הגולגולת לסחוט סכום עודף של דבק. חשוב כדי למנוע היווצרות בועה בין הזכוכית דבק מאז אוויר לכוד תגרום באזור שמתחת להיות אטום אופטית. דבק cyanoacrylate משמש משום שהיא נשארת שקופה כאשר יבש גם מונע עצם לצמיחה מחודשת קרום שמירה על הגולגולת מתחת לחלון דק ושקוף. אם יש דבק על גבי זכוכית המכסה, השתמש microblade כדי להסיר בזהירות את זה פעם אחת את הזכוכית המכסה נמצאת במקום ודבק יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משכך כאבים (למשל, עצירות 2 מ"ג / ק"ג תת cutaneously) ניתנת מיד לאחר הניתוח מחדש מנוהל על סימנים של כאב, כולל רצון לזוז, לאכול או לשתות, איבוד משקל, ריור, piloerection, קולות הנשימה, וכו ' </li></ol> 3. שני הפוטונים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת הדמיה two-פוטון, לכסות את TSCW עם מלוחים ולאתר את שטח של עניין תחת epifluorescence (איור 2). כדי לאפשר הדמיה עוקבות של האזור, לצלם באמצעות מצלמה הצילום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה two-פוטון, אנו משתמשים מחוייט שני הפוטונים מיקרוסקופ 6 עם טי: ספיר לייזר מכוון 920 ננומטר. Fluorescence מזוהה באמצעות צינור מכפיל במצב כל שדה זיהוי מסנן 580/180 פליטה. 20X מים טבילה העדשה (0.95 NA) משמש לאורך כל הפגישה הדמיה. התפוקה המקסימלית של כוח לייזר נגד מטרה מוגדרת בין 50 ל 65 mW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור של אינטרס שכבות בקליפת המוח I או II (עד 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial). כדי להקל מחדש הדמיה, לצלם תמונות של אותו שדה הראייה ב 1X, 2X, ו זום דיגיטלי 3X. כלי דם יכול לשמש ציוני דרך למצוא בקלות את אותו שדה הראייה במהלך הפגישות הדמיה הבאים. תחת זום של 3X, מספר Z-ערימות עם 80-90 Z-צעדים בערימה כל צעד 0.69 מיקרומטר ניתן לרכוש כל 5 דקות עד 30 דקות, אשר מאפשרת דגימה טובה של מורפולוגיה התנהגות microglial ולאורך זמן ( איור 3). בין הרכישות של Z-ערימות, יש לוודא את רמת מלח מעל TSCW, כמו גם עומק של החיה של הרדמה. </li></ol> 4. הזרקת רעלן עצבי HIV-1, תאת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, silanize הציפוי הפנימי של מחט מד 35 ו - 10 μL מזרק Microvolume למנוע בתצהיר תאת. משוך את הפתרון silanizing (Sigmacote) עד שהוא ממלא הן את מחט המזרק. אפשר פתרון לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. רוקן את הפתרון מן המזרק, להסיר את הבוכנה, ולאפשר את המזרק ואת המחט להתייבש לחלוטין. לבסוף, לשטוף את המזרק ואת המחט היטב במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע קטן 0.5 מ"מ craniotomy בקוטר או 3 מ"מ מקורי או לרוחב TSCW שבה שני פוטונים התמונות הושגו בעזרת קצת תרגיל קטן ובזהירות דליל הגולגולת עד בזוג מלקחיים עם קצוות חדים ניתן להסיר את שכבת דליל של עצם משם בקלות. אנו משתמשים 10 μL מזרק Microvolume מצויד מחט מד 35 נשלט על ידי משאבה Ultramicropump מזרק III רכוב על micromanipulator 3-ציר ואחרי הזדנבות את קצה המחט craniotomy, הוא מתקדם בזהירות עד לעומק של 700-900 מיקרומטר להלן השטח שבו pial 3 μL תאת 1-72 (או אחרים הפרו דלקתיות) או מלח (או הרכב שליטה) מועבר על 80 NL / min. </li></ol> 5. בעלי חיים והשיכון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים להיות צילמו מספר פעמים ביום אחד, לכסות את השטח הפתוח של הגולגולת בתערובת של משחה עיניים ו וזלין כדי למנוע סבל או נזק הגולגולת בין המפגשים הדמיה. נתק את גשר תמיכה של הצלחת ראש קטן (ראה איור 1B) והמקום חיה בכלוב מחומם עם אוכל נגיש ומים. כל החיות הם ישוכנו ביחידים לאחר הניתוח בכל עת. לאחר פגישות עבור הדמיה חיה מלאים עבור יום נתון, להסיר בזהירות את כל הראש הצלחת לתפור את העור בחזרה מעל הגולגולת עם # 6 או תפר קטן. שוב, בית החיות ביחידות עם מזון ומים נגיש בקלות בין ימי הניסוי. בדוק את החיות יומי עבור כל סימני מתח, כאב או דלקת. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ייצוב של חיה עבור ניתוח שני הפוטונים הדמיה (א) ו צלחת ראש העיצוב (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. GFP שכותרתו דמיינו microglia עם epifluorescence. jove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. GFP-שכותרתו microglia דמיינו עם הדמיה שני הפוטונים לאחר ההשתלה של TSCW, כ 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial. הסינגל שני הפוטונים קטעים שצולמו 15-30 דקות לאחר ההשתלה של TSCW (יום 0), כמו גם 7 ו 17 ימים מאוחר יותר, להוכיח כי חלונות תישאר ברורה תוך microglia להישאר מובטל בהיעדרו של עלבונות דלקתיות. Z-תחזיות לקחת 6 ו - 24 שעות לאחר הזרקת רעלן עצבי מידה HIV שינויים מורפולוגיים תערוכה מרשימה של הפעלת שריר כלשהו. בר קנה מידה: 10 מיקרומטר.

<ol><li>Mostany, R., &amp, P. ortera-C. ailliau, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., &amp, Y. uste, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li>
<li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22A+review.+J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li>
<li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp, B. alcerzyk, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li>
<li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp, Q. uinlan, M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li>
<li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp, U. pender, B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li>
<li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp, M. cA. rthur, C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain%3A+correlations+with+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יש קונצנזוס הולך וגדל כי המצע האמיתי של HIV-1 הגירעונות הקשורים נוירוקוגניטיבי (יד) הוא הרס של האדריכלות הסינפטי, שנגרם ככל הנראה על ידי תומכי מתווכים דלקתיים שוחרר מבית HIV-1 phagocytes mononuclear נגועים. הפעלת Microglial, תאים ענק multinucleated ו דבקת בשל היפרטרופיה astrocytic נחשבים סימני ההיכר ספציפי של הידבקות ב-HIV-1 ו דלקת של מערכת העצבים המרכזית 7. לעומת זאת, חומרת המחלה הנוירולוגית premortem כבר בקורלציה עם הפסד של מורכבות הסינפטי, כמו גם נטל macrophage ב CNS 8,9,10,11. עם זאת, אינטראקציות בין דינמי microglia, מקרופאגים חדירה הפריפריה, ואת הנוירונים בחולים עם היד פשוט לא יכול להיות המודל באמצעות עיבוד סטטי קונבנציונאלי המתקבלים ללימודים immunocytochemical קונבנציונאלי. מחקרים שנעשו לאחרונה ממעבדות שלנו הראו כי לפחות חלק מהם יחסי הגומלין בין התאים mononuclear ונוירונים הפריפריה מרכזי יכול להיות המודל בחלקו על ידי הזרקת stereotactic של חלבון ה-HIV-1 תאת 1-72 לתוך המוח parenchyma (Lu, דה מרקר, Tremblay, צ&#39;י, ו גלברד, נתונים שלא פורסמו). לכן החלטנו ליישם בתחום ההדמיה vivo פוטון שניים לבחון את יחסי הגומלין בין הנגזרות מונוציטים מקרופאגים, תושב microglia הנוירונים במוח, במודל חיה צייתן קטן עבור neuroAIDS. בעוד ההכנות הגולגולת פתוחים או דליל, גולגולת להרשות לעצמם בדיקה בודדת של ארכיטקטורה קליפת המוח לתקופה קצרה של זמן (שעות), החוקרים מעוניינים במהלך זמן של אירועים subacute לא יכול להשתמש אלה ההכנות ללא artifactually הפעלת microglia / macrophage עקב מניפולציה כירורגית של החלון calvarial. כאן אנו מדגימים דרך פשוטה לעקוף את המגבלה הדביק פיסה זעירה של coverslip זכוכית מעל האזור הגולגולת דליל מניעת calvarium מתוך התחדשות TSCW כמו גם שמירה על שקיפות עבור ≥ 3 שבועות. בנוסף, אנו מראים כי טכניקה זו מאפשרת לנו לפקח על התנהגותם של מונוציטים היקפי להיכנס microvasculature מוחין וכן המוח תושב microglia בתגובה הזרקת stereotactic של HIV תאת 1-72 בקליפת המוח של עכברים הטרוזיגוטיים CR CX 3 1 / GFP ( כדי לזהות תאים של שושלת mononuclear). טכניקה זו יכולה בקלות להיות מותאם לשימוש על עכברים עם רקע גנטי שונה, למשל, אנו משתמשים באופן שגרתי הטרוזיגוטיים CR CX 3 1 / X-GFP Thy-1 YFP 12 עכברים לחקור את יחסי הגומלין בין הנגזרות מונוציטים מקרופאגים, תושב microglia המוח נוירונים במודלים vivo של neuroinflammation רלוונטי ביד. הכנה TSCW שלנו מאפשר לחוקרים ללמוד תאים תאים אינטראקציות בין הפריפריה CNS שעלולות להתרחש על פני תקופות של שבועות, שבו חיה ניתן הדמיה פעמים לפני ואחרי הטיפול הניסיוני. לפיכך, כל בעל חיים יכול לשמש מלאה משלה. אזהרה אחת עבור דגם זה TSCW הוא התאים היעד תחת חקירה צריך להיות מהונדסים גנטית כדי לבטא חלבוני ניאון משופרת (eXFP) או להיות מתויג עם פלורסנט לצבוע ללא הפרה מכניות של calvarium, וכי הביטוי eXFP חייבים להיות חזקים מספיק כדי לאפשר ארכיטקטורה הסלולר להיות דמיינו לאחר פגישות הדמיה חוזרות ונשנות על פני תקופה של שבועות.

<table><tbody><tr><td>פנטניל ציטרט</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מידזולאם הידרוכלוריד</td><td>Baxter International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדטומדין הידרוכלוריד (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משטחי חימום</td><td>מעבר לחום הגוף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משחה עינית של טוברמיצין ודקסמתזון (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פובידון-יוד 10%</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פריקה כלוריד 10%</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>מתיל ציאנואקרילט 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קשירה צולבת של חומר לשיבוב שיניים TEETS, מתיל מתקרילט</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת ידית Microtorque II</td><td>הערכות של Pearson</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>מקדחים IRF 007</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרו מתכופף של Norland ברדיוס מלא</td><td>סלבין דנטל (Salvin Dental)</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>ציאנואקרילט</td><td>הדבק המהיר המקורי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מס' 0</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;מזרק לנפחים קטנים (Microvolume syringe)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>מחט NanoFil בכיליב 35 (35 gauge)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>טחנת כדורים, מקדחי קרבייד #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת כושר הכפלה פוטואלקטרי (Photomultiplier tube) </td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>לייזר Ti:Sapphire מדגם Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia murine של מודלים של neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

באופן מסורתי במדעי המוח, in vivo two הדמיה פוטון Murine של מערכת העצבים המרכזית יש מעורבים גם את השימוש 1,2 הגולגולת פתוחים או דליל, גולגולת 3 ההכנות. בעוד טכניקה הגולגולת פתוח הוא מאוד תכליתי, זה אינו אופטימלי לחקר microglia כי הוא פולשני ועלול לגרום ההפעלה microglial. למרות הגישה דליל, הגולגולת היא פולשנית, חזר מחדש דליל של הגולגולת נדרש הדמיה כרונית מגבירה את הסיכון של פגיעה ברקמות ההפעלה microglial ומאפשרת מספר מוגבל של הפעלות הדמיה. כאן אנו מציגים שיטה כרונית גולגולת דקה חלון לניטור microglia Murine in vivo על פני תקופה ממושכת של זמן באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. אנו מדגימים כיצד להכין יציבה, נגיש, דילל-הגולגולת חלון קליפת המוח (TSCW) עם coverslip זכוכית apposed שנותר שקוף במהלך שלושה שבועות של התבוננות לסירוגין. זו הכנה TSCW הרבה יותר אינרטי immunologically ביחס ההפעלה microglial מאשר craniotomy לפתוח או גולגולת חזר דליל מאפשר מספר שרירותי של הפעלות הדמיה במהלך פרק זמן של שבועות. אנחנו מכינים TSCW ב 3 CR CX-GFP 1 / 4 + עכברים לדמיין microglia עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת כדי ≤ 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial. כמו כן, אנו מראים כי זו הכנה ניתן להשתמש בשילוב עם זריקות המוח stereotactic של החלבון HIV-1 neurotoxic תאת, סמוך TSCW, אשר מסוגל גרימת microgliosis עמיד. לכן, שיטה זו שימושית מאוד לבחינת שינויים במורפולוגיה תנועתיות microglial ועם הזמן במוח החיים דגמים של הפרעת Associated נוירוקוגניטיבי HIV (יד) ומחלות ניווניות אחרות עם מרכיב neuroinflammatory.

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת מונוציטים<em&gt; In vivo</em&gt; במשך שעות, ימים או שבועות באמצעות מיקרוסקופ transcranial שני הפוטונים. אנו מדגימים כיצד להכין חלון דליל-הגולגולת המאפשר תצפית לסירוגין של microglia שקט כי יכול להיות מופעל על ידי הזרקת stereotactic צמוד של HIV-1 חלבון הרגולציה תאת.

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

באופן מסורתי במדעי העצבים, דימות דו-פוטוני in vivo של מערכת העצבים המרכזית בעכברים כלל שימוש בגולגולת פתוחה1,2 או...

במטופלים מבוגרים שנדבקו ב-HIV, דלקת נוירולוגית (neuroinflammation) מפריעה לאותות סינפטיים תקינים, מה שמוביל לליקויים נוירו-קוגניטיביים הכוללים קשיים בהפשטה, שטף מילולי, קשב, למידה של מידע חדש וזיכרון. HIV-1 tat גורם להפרשה של מולקולות דלקתיות, אשר יכולות לחקות את הדיספונקציה הסינפטית הנצפית במטופלים עם HIV. עכברים בוגרים המבטאים GFP בתאים חד-גרעיניים, כולל מיקרוגליה, משמשים לחקירת דלקת נוירולוגית המושרית על ידי HIV-1 tat באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולה דרך גולגולת דקה (thin skull two photon microscopy).ניתן לדמות ב-in vivo את תגובות המיקרוגליה לאחר הזרקה של tat. התמונות המתקבלות מדגימות קיצור והעבה של שלוחות המיקרוגליה ויצירה של מבנים דמויי כוס פגוציטית, וכן תנועה של מונוציטים פריפריים בכלי דם מיקרו-מוחיים. שלום, אני דן מרקר מהמעבדה של האריס גלברד ומהמרכז לפיתוח ומחלות עצביות באוניברסיטת רוצ'סטר.שלום, אני EF Trombley ממעבדת Esca במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר. שלום, אני Shain Luu, גם אני ממעבדת Albas. היום נדגים לכם פרוצדורה לדימות דו-פוטוני באמצעות הכנת גולגולת דקה.אנו משתמשים בנוהל זה כדי לחקור דלקת עצבית כרונית. לכן, נתחיל בניסוי המוצג כאן, שבו נעשה שימוש ב-OT המבטא GFP בשורות תאים מונונוקלאריים, כולל מיקרוגליה.ניתן להשתמש בזני עכברים שונים כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. התחילו בהכנת עכבר שהורדם באמצעות fentanyl ו-midazolam לניתוח. ראשית, ודאו שהבעל לא מגיב יותר לגירויים כואבים, כגון צביטה בזנב.הנח את בעל החיים על פד חימום כדי למנוע היפותרמיה לאחר ההרדמה. לאחר מכן, כסה את עיני בעל החיים במשחה אופתלמית מגינה כדי לשמור על לחות העיניים. יש לוודא שכל כלי הניתוח עברו עיקור באוטוקלאב או במכשיר עיקור בחרוש זכוכית; חטא את הכלים באופן נוסף על ידי השריה ב-70% ethanol.הסר בעזרת מספריים את הפרווה מקרקופת החיה, ולאחר מכן חטא את האזור באמצעות תמיסת פובידון יוד 10% ואתנול 70%. התחל את הניתוח באמצעות מספריים קטנים ליצירת חתך בקו האמצע של הקרקפת, החל מארבעה עד חמישה מילימטרים קודמלית לגולגולת והתקדמות קדימה עד לחלק הקדמי של העיניים. חתך זה צריך להיות ארוך מספיק כדי שהעור לא יפריע להדבקת הפלטה המייצבת את ראש העכבר במהלך דימות בדו-פוטונים.בשלב הבא, מרח 100% ethanol באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים כדי לייבש את הקרומים שעל גבי הגולגולת. גרד אותם בעזרת פינצטה עדינה. אם הקרומים לא יוסרו, קיבוע לוחית הראש לא יהיה יציב.תחת מיקרוסקופ סטריאו, זהו את האזור שיידלל. הימנע מאזורי עניין הממוקמים ישירות מעל תפרים גולגולתיים, שכן הגולגולת פחות יציבה באזורים אלו, וכלי דם גדולים וקרומי המוח שמתחתיהם יפריעו לדימות שיישלח לחלון הצפייה באזור העניין. לאחר מכן, שוב, באמצעות מקל צמר גפן, נסה להדלל את הגולגולת שוב באמצעות תמיסה של 10% של ferric chloride.מרחו שכבה דקה של דבק perma bond, nine 10 מסביב לקצוות של חלון התצפית מתחת ללוחית הראש. לאחר מכן, הניחו את הלוחית מעל אזור העניין בגולגולת בעל החיים תוך הפעלת לחץ קל כדי להדביק את הדבק. מרחו כמות קטנה של אקריליק מסביב לקצה חלון התצפית באמצעות מזרק.לבסוף, מרחו כמות קטנה של Tite 4 54 לקצוות של חלון התצפית כדי למנוע דליפות. הבריגו את לוחית הראש למחזיק החיה ובדקו את היציבות תחת מיקרוסקופ דיסקציה; על ידי בדיקה קלה עם פינצטה, לא צריכה להיות תנועה של הגולגולת ביחס ללוחית הראש.הנח טיפה של תמיסת סלין על חלון התצפית כדי לוודא שאין דליפות כהכנה לדילול. ייבש את הגולגולת באמצעות שילוב של מקלוני צמר גפן סטריליים ואוויר דחוס. דלל את הגולגולת באמצעות מקדח IRF 0 0 7 במקדחה מיקרו-टू (micro to two drill).ב-4,000 RPM. התחלו לדקק בעדינות רבה שטח מעגלי בקוטר של 2 עד 2.5 מילימטרים. השתמשו אך ורק בתנועות sweeping קלות, כמעט מקבילות לגולגולת.אין להפעיל לחץ ישיר כלפי מטה. יש להפסיק את הקידוח מדי 20 עד 30 שניות כדי להסיר עפר עצם באמצעות אוויר דחוס. הפסקות קידוח אלו מאפשרות לגולגולת להתקרר, ובכך מונעות נזק לרקמת המוח שמתחתיה כתוצאה מחום.בעוד הקידוח מתקדם, שימו לב למעבר לשכבת העצם הספוגית והלחה יותר הנקראת ה-Diplo. ברגע שהגעתם לשכבה זו, הפעילו זהירות יתרה עם המקדח. בדקו מדי פעם את עובי הגולגולת על ידי הנחת תמיסת סלין מעל האזור הדק והסתכלות תחת מיקרוסקופ דיסקציה.מילית סלין תסייע בנוסף בפיזור החום. ככל שהגולגולת נהיית דקה יותר, כלי דם קטנים יותר הופכים לנראים. השתמשו בלהב דנטלי מיקרוסקופי כדי להשיג את הדילול הסופי תחת סלין.המיקרו-להב (microblade) מספק משוב תחושתי רב יותר לגבי יציבות הגולגולת. הדבר מאפשר הכנות דקיקות הרבה יותר מאשר שימוש במקדח לבדו. עובי הגולגולת האופטימלי לצורך דימות הוא 10 עד 30 micrometers.תהליך הדילול כולו אורך בדרך כלל בין 15 ל-30 דקות. יש לבדוק את עובי הגולגולת תחת פלואורסצנציית epi מספר פעמים במהלך יצירת חלון הגולגולת הדק. מידת החדות והעומק של המיקרוגליה וכלי הדם הנראים מהוות אינדיקציה טובה לכך שהחלון מוכן לדימוי.לאחר שהחלון מוכן, השתמשו בפיפטת זכוכית בקוטר 1 mm כדי להניח טיפה קטנה של דבק אקרילי Cy על אזור הגולגולת הדק, והנחילו בזהירות חתיכת זכוכית כיסוי מעליה. לאחר מכן, לחצו בעדינות על הגולגולת כדי לסחוט שאריות דבק, תוך הימנעות מיצירת בועות בין הגולגולת לזכוכית הכיסוי, שכן אלו עלולות להפריע לשדה הראייה. לאחר הייבוש, השתמשו בלהב מיקרוסקופי כדי להסיר בזהירות כל שארית דבק שנותרה על זכוכית הכיסוי כהכנה לדימות דו-פוטוני.כסו את חלון קליפת הגולגולת הדקה בתמיסת סלין ואתרו את אזור העניין תחת פלואורסצנציית epi. כדי לאפשר דימות עתידי של האזור, צלמו תמונה באמצעות מצלמה פוטוגרפית לדימות. מוצג כאן שימוש במיקרוסקופ פוטו-דו-פוטוני בהתאמה אישית עם לייזר טי-ספיר (ti sapphire) המכוון ל-920 nanometers.הפלואורסצנציה מזוהה באמצעות שפופרת מכפיל פוטונים (PMT) במצב זיהוי שדה מלא ובמסנן פליטה של 5 81 80. במהלך כל סשן ההדמיה נעשה שימוש בעדשת טבילה במים 20x. הגדירו את תפוקת הספק הלייזר המקסימלית של העדשה בין 50 ל-65 milliwatts.בשלב הבא, בחרו אזור עניין בשכבה קורטיקלית אחת או שתיים, עד עומק של 150 micrometers מתחת לפני השטח של הקליפה. כדי להקל על צילום חוזר, צלמו את אותו שדה ראייה בזום דיגיטלי של one x, two x ו-three x. כלי דם יכולים לשמש כנקודות ציון כדי למצוא בקלות את אותו שדה ראייה במהלך מפגשי דימוג עוקבים.תחת הגדלה של three x, רכשו מספר Zacks עם 80 עד 90 Z steps כל אחד וצעד של 0.69 micrometer כל חמש דקות למשך עד 30 דקות. דבר זה מאפשר דגימה טובה של המורפולוגיה וההתנהגות של המיקרוגליה לאורך זמן בין רכישות של Zacks; ודאו את מפלס הסליין ואת עומק ההרדמה. במידת הצורך, ניתן לתת מנת דחף של שליש מהמנה המקורית של תערובת חומרי ההרדמה במהלך הפרוצדורה כדי למנוע שקיעת tat על המזרק והמחט במהלך ההזרקה, ימים לפני ההזרקה.בצעו סילילוז (Siloization) לדיפון הפנימי של מחט בכיול 35 ושל מזרק לנפחים קטנים של 10 microliter על ידי שאיבת תמיסת מימדית (sizing solution) עד למילוי מלא של המחט והמזרק. השאירו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן רוקנו את התמיסה מהמזרק, הסירו את הבוכנה והניחו למזרק ולמחט להתייבש לחלוטין. לבסוף, שטפו את המזרק ואת המחט ביסודיות במים דה-יוניזציה (deionized water).לאחר הסיליקוזציה, ניתן להשתמש במזרק ובמחט במשך יותר משישה חודשים לפני שיהיה צורך בכיול מחדש. ביום ההזרקה, יש להניח טיפה קטנה של תמיסת ה-TAT על תגית זכוכית שעברה סיליקוזציה. בעזרת טיפ פפית סיליקוני, טענו את הכמות הרצויה של התמיסה אל תוך מזרק המיקרו-נפח מתוך טיפה זו.באמצעות מקדח, בצעו קרניוטומיה קטנה בקוטר 0.5 מילימטרים, במרחק של שלושה מילימטרים באופן רוסטרלי או לטרלי לחלון הקורטקס הדק בגולגולת שבו התקבלו תמונות הדו-פוטון. כדי לבצע זאת, דללו את הגולגולת בזהירות. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה חדה כדי להסיר את שכבת העצם הדקה.השתמש במיקרו-מניפולטור כדי ליישר את המחט במידה 35 ואת המזרק עם ה-craniotomy. לאחר מכן, הנח את המחט בזהירות לעומק של 700 עד 900 micrometers מתחת לפני השטח של הקליפה. הזרק three microliters בקצב של 80 nanoliters לדקה באמצעות משאבת מזרקים הנשלטת על ידי מיקרו-מעבד.איור זה מציג מיקרוגליה המסומנת ב-GFP אשר הודגמו באמצעות דימיון דו-פוטוני לאחר השתלת חלון קורטיקלי של גולגולת דקה, בעומק של כ-50 micrometers מתחת לפני השטח של הקליפה. חתכים דו-פוטוניים בודדים שנלקחו ביום אפס, 15 עד 30 דקות לאחר השתלת החלון הקורטיקלי של הגולגולת הדקה, כמו גם אלו שנלקחו שבעה ו-17 ימים מאוחר יותר, מדגימים כי החלונות נותרים שקופים בעוד שהמיקרוגליה נשארת פעילה בהיעדר פגיעות דלקתיות. הדבר מדגיש את התועלת של שיטה זו לחקירת אינטראקציות נורמליות ודלקתיות בין תאי אפקטור חיסוניים לסוגים אחרים של תאים עצביים.בבדיקה in vivo, היטלי Z שתועדו שש ו-24 שעות לאחר הזרקה של הנוירוטוקסין TAT של HIV מראים שינויים מורפולוגיים בולטים של מיקרוגליה מופעלת. הדבר מדגים עוד את יכולתנו לחקור שינויים מורפולוגיים של מיקרוגליה בזמן אמת במודלים אקוטיים וכרוניים של נוירו-דלקת. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין חלון גולגולת דק ולהשתמש בו למחקר של נוירו-דלקת בעת ביצוע פרוצדורה זו.חשוב לזכור להקדיש את הזמן הדרוש בעת הטיפול בגולגולת כדי למנוע נזקים שעלולים להיגרם כתוצאה מתהליך ההכנה עצמו. זהו כל התהליך. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

מקור: Kamei, R., et. al., In vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את תהליך ההתקנה וההדמיה של מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס CA1 (Cornu ammonis 1) ובפיתול המשונן, מה שמבטיח יישור אופטי אופטי והערכת שלמות מבנית.

הדמיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

למדו שיטת חלון גולגולת דק לדימוי מיקרוגליה בעכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים מורפולוגיים בתגובה לדלקת עצבית כרונית ולחלבון HIV-1 Tat לאורך זמן.

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

גלה סרטונים נוספים