הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

בחולים מבוגרים שנדבקו ב-HIV דלקת עצבית מפריעה לאיתות סינפטי תקין מה שמוביל לליקויים נוירו-קוגניטיביים הכוללים קשיים בהפשטה, שטף מילולי, למידת קשב, מידע חדש וזיכרון. HIV גורם להפרשת מולקולות דלקתיות, שיכולות לחקות את התפקוד הסינפטי הנראה בחולים עם HIV כאן. עכברים בוגרים המבטאים GFP בתאים חד-גרעיניים, כולל מיקרוגליה, משמשים לחקירת דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV באמצעות מיקרוסקופ גולגולת דק שני פוטונים.

ניתן לדמות את התגובות של מיקרוגליה לאחר הזרקת טאט in vivo. התמונות המתקבלות מדגימות קיצור ועיבוי של תהליכי מיקרוגליה והיווצרות מבנים דמויי פגוציטית, כמו גם סחר מונוציטים היקפיים בכלי מיקרו מוחיים. היי, אני דן מרקר מהמעבדה של האריס גלברד והמרכז להתפתחות עצבית ומחלות באוניברסיטת רוצ'סטר.

היי, אני EF Trombley מהמעבדה של Esca במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר. היי, אני שיין לואו, גם הוא ממעבדת אלבס. היום נראה לכם הליך להדמיית שני פוטונים באמצעות הכנת גולגולת דקה.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור דלקת עצבית כרונית. אז בואו נתחיל בניסוי המוצג כאן. נעשה שימוש ב- OT express GFP בשושלות תאים חד-גרעיניים כולל מיקרוגליה.

ניתן להשתמש בזנים שונים של עכברים כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. התחל להכין פנטניל, מידזולם מיין עכבר מורדם לניתוח. ראשית, ודא שהחיה כבר לא מגיבה לגירויים כואבים כמו צביטת זנב.

הנח את החיה על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה. לאחר מכן כסו את עיני החיה במשחת עיניים מגן כדי לשמור על לחות העיניים. כל המכשירים הכירורגיים היו צריכים לעבור חיטוי או עיקור עם מעקר חרוזי זכוכית כדי לחטא עוד יותר את המכשירים על ידי השרייתם באתנול 70%.

בעזרת מספריים, הסר את השיער מהקרקפת של בעל החיים, ולאחר מכן חטא את האזור באמצעות תמיסת יוד 10% פובידון ואתנול 70%. התחל את הניתוח באמצעות מספריים קטנים לביצוע חתך בקו האמצע בקרקפת, החל מארבעה עד חמישה מילימטרים, ללב לגולגולת והתקדם קדימה לקדמת העיניים. חתך זה צריך להיות ארוך מספיק כדי שהעור לא יפריע להדבקת הצלחת המייצבת את ראש העכבר במהלך הדמיית שני פוטונים.

לאחר מכן, מרחו 100% אתנול את צמר גפן סטרילי כדי לייבש את הממברנות על גבי הגולגולת. מגרדים אותם בעזרת פינצטה עדינה. אם הממברנות לא יוסרו, חיבור לוחית הראש יהיה לא יציב.

תחת טווח ניתוח, זהה את האזור שיש לדלל. הימנע מאזורי עניין הממוקמים ישירות מעל תפרי הגולגולת מכיוון שהגולגולת פחות יציבה באזורים אלה ומתחת לכלי דם גדולים וקרומי המוח יפריעו להדמיה הנשלחת לחלון הצפייה באזור העניין. ואז שוב, בעזרת צמר גפן, נסה שוב את הגולגולת באמצעות תמיסה של 10% של כלוריד ברזל.

הניחו שכבה דקה של קשר הפרמה, תשע 10 דבק סביב שולי חלון הצפייה מתחת ללוחית הראש. לאחר מכן הניחו את הצלחת מעל אזור העניין בגולגולת החיה בלחץ קל כדי לחבר את הדבק. מרחו כמות קטנה של אקריליק סביב קצה חלון הצפייה בעזרת מזרק.

לבסוף, מרחו כמות קטנה של Tite 4 54 על שולי חלון הצפייה. למניעת נזילות. הברג את לוחית הראש למחזיק החיה ובדוק את היציבות תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי בדיקה קלה עם זוג מלקחיים, לא אמורה להיות תנועה של הגולגולת ביחס ללוחית הראש.

הניחו טיפת מלח על חלון הצפייה כדי להבטיח שאין נזילות לקראת דילול. יבש את הגולגולת באמצעות שילוב של צמר גפן סטרילי ואוויר דחוס. דק את הגולגולת באמצעות מקדח IRF 0 0 7 במקדחה מיקרו עד שתיים.

ב-4,000 סל"ד. התחל בעדינות רבה לדלל אזור עגול בקוטר של שניים עד 2.5 מילימטרים. השתמש רק בתנועות גורפות קלות כמעט במקביל לגולגולת.

אין להשתמש בלחץ ישיר כלפי מטה. הפסק לקדוח כל 20 עד 30 שניות כדי להסיר אבק עצם באמצעות האוויר הדחוס. הפסקות אלה בקידוחים מאפשרות לגולגולת להתקרר כך שלא ייגרם נזק הנגרם מחום לרקמת המוח הבסיסית.

ככל שהקידוח מתקדם, שימו לב למעבר לשכבת העצם הקוצנית הלחה יותר הנקראת דיפלו. לאחר שמגיעים לשכבה זו, יש לנקוט משנה זהירות עם המקדחה. מדי פעם בדוק את דקיקות הגולגולת על ידי הנחת מי מלח על האזור הדק וצפייה תחת טווח הניתוח.

מי מלח יאפשרו עוד יותר פיזור חום. ככל שהגולגולת מדוללת, כלי דם קטנים יותר נראים לעין. השתמש במיקרו-להב דנטלי כדי להשיג את הדילול הסופי מתחת למי מלח.

המיקרו-להב מספק משוב מישוש הרבה יותר על יציבות הגולגולת. זה מאפשר תכשירים דקים בהרבה מאשר עם המקדחה בלבד. עובי הגולגולת האופטימלי להדמיה הוא 10 עד 30 מיקרומטר.

כל תהליך הדילול אורך בדרך כלל בין 15 ל-30 דקות. בדוק את דקיקות הגולגולת תחת אפי פלואורסצנטי מספר פעמים תוך כדי יצירת חלון גולגולת דק. החדות והעומק של מיקרוגליה וכלי הדם הנראים לעין נותנים אינדיקציה טובה מתי החלון מוכן להדמיה.

לאחר שהחלון מוכן, השתמש בפיפטה מזכוכית בקוטר מילימטר אחד כדי להניח טיפה קטנה של דבק אקרילי Cy על אזור הגולגולת הדק ולהוריד עליו בזהירות פיסת זכוכית כיסוי. לאחר מכן לחץ בעדינות על הגולגולת כדי לסחוט את כל הדבק העודף, הימנע מהיווצרות בועות בינה לבין זכוכית הכיסוי, שעלולה לחסום את הנוף. לאחר הייבוש, השתמש במיקרו-להב כדי להסיר בזהירות את כל הדבק שנותר על גבי זכוכית הכיסוי כהכנה להדמיית שני פוטונים.

כסו את חלון קליפת המוח הדק של הגולגולת במי מלח ואתרו את אזור העניין תחת אפי פלואורסצנטי. כדי לאפשר הדמיה עוקבת של האזור, צלם תמונה באמצעות מצלמת צילום להדמיה. מוצג כאן נעשה שימוש בשני מיקרוסקופ צילום בהתאמה אישית עם לייזר ti ספיר המכוון ל -920 ננומטר.

הקרינה מזוהה על ידי שימוש בצינור מכפיל צילום או PMT במצב זיהוי שדה שלם ומסנן פליטה 5 81 80. נעשה שימוש בעדשת טבילה במים פי 20 לאורך כל סשן ההדמיה. הגדר את התפוקה המקסימלית של עוצמת הלייזר של המטרה בין 50 ל-65 מילי-וואט.

לאחר מכן, בחר אזור עניין בשכבה קליפת המוח אחת או שתיים עד 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הקליפה. כדי להקל על הדמיה מחדש, צלם תמונות של אותו שדה ראייה ב-x אחד בזום דיגיטלי של שניים x ושלושה x. כלי דם יכולים לשמש כציוני דרך כדי למצוא בקלות את אותו שדה ראייה במהלך מפגשי ההדמיה הבאים.

תחת זום של שלושה x, רכוש מספר Zacks עם 80 עד 90 צעדי Z כל אחד וצעד של 0.69 מיקרומטר כל חמש דקות למשך עד 30 דקות. זה מאפשר דגימה טובה של מורפולוגיה והתנהגות מיקרוגליה לאורך זמן בין רכישות של זקס, לוודא את רמת המלח ועומק ההרדמה. במידת הצורך, ניתן לתת מנת דחף של שליש מהמינון המקורי של קוקטייל ההרדמה במהלך ההליך כדי למנוע שקיעת טאט על המזרק והמחט במהלך ימי ההזרקה לפני ההזרקה.

סילדל את הציפוי הפנימי של מחט בגודל 35 ומזרק מיקרו נפח של 10 מיקרוליטר על ידי משיכת תמיסת הגודל עד שהיא ממלאת גם את המחט וגם את המזרק. הניחו לתמיסה לשבת חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז רוקנו את התמיסה מהמזרק, הסירו את הבוכנה ואפשרו למזרק ולמחט להתייבש לחלוטין. לבסוף, שטפו היטב את המזרק והמחט במים נטולי יונים.

לאחר המבודד, ניתן להשתמש במזרק ובמחט במשך יותר משישה חודשים לפני שיהיה צורך בקידוד מחדש. ביום ההזרקה, הניחו טיפה קטנה של תמיסת TAT על מגלשת זכוכית מבודדת. בעזרת קצה פיפטה סיליקון, טען את כמות התמיסה הרצויה למזרק נפח המיקרו מטיפה זו.

בעזרת מקדחה, בצע קרניוטומיה קטנה בקוטר 0.5 מילימטרים, או שלושה מילימטר רוסטרלי או לרוחב לחלון קליפת המוח הדק של הגולגולת שבו התקבלו שתי תמונות פוטון. כדי להשיג זאת, דק בזהירות את הגולגולת. לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים חדים כדי להסיר את שכבת העצם הדקה.

השתמש במניפולטור מיקרו כדי ליישר את המחט והמזרק בגודל 35 עם הגולגולת. לאחר מכן קדם בזהירות את המחט לעומק של 700 עד 900 מיקרומטר מתחת לפני הקליפה. ספק שלושה מיקרוליטר במהירות של 80 ננוליטר לדקה באמצעות משאבת מזרק הנשלטת על ידי מיקרו-מעבד.

איור זה מציג מיקרוגליה עם תווית GFP המומחשת עם הדמיית שני פוטונים לאחר השתלת חלון קליפת המוח הדק של הגולגולת, כ-50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הקליפה. שני חלקי הפוטונים הבודדים שצולמו ביום האפס, 15 עד 30 דקות לאחר השתלת החלון הדק של קליפת הגולגולת, כמו גם אלה שצולמו שבעה ו-17 ימים לאחר מכן, מדגימים כי החלונות נשארים נקיים בעוד שמיקרוגליה נשארת מופעלת בהיעדר עלבונות דלקתיים. זה מדגיש את התועלת של שיטה זו לחקירת אינטראקציות נורמליות ודלקתיות בין תאי אפקטור חיסוני וסוגי תאים עצביים אחרים.

in vivo הקרנות Z שנלקחו שש ו-24 שעות לאחר הזרקת הרעלן העצבי של HIV TAT הראו שינויים מורפולוגיים ניכרים של מיקרוגליה מופעלת. הדגמה נוספת של יכולתנו לחקור שינויים מורפולוגיים של מיקרוגליה בזמן אמת במודלים חריפים וכרוניים של דלקת עצבית. זה עתה הראינו לך כיצד להכין חלון גולגולת דק ולהשתמש בו כדי לחקור דלקת עצבית בעת ביצוע הליך זה.

חשוב לזכור לקחת את הזמן בעת הטיפול בגולגולת כדי למנוע כל נזק שנגרם מהתכשיר עצמו. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.