הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation
19 בספטמבר 2010
אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת מונוציטים In vivo במשך שעות, ימים או שבועות באמצעות מיקרוסקופ transcranial שני הפוטונים. אנו מדגימים כיצד להכין חלון דליל-הגולגולת המאפשר תצפית לסירוגין של microglia שקט כי יכול להיות מופעל על ידי הזרקת stereotactic צמוד של HIV-1 חלבון הרגולציה תאת.
במטופלים מבוגרים שנדבקו ב-HIV, דלקת נוירולוגית (neuroinflammation) מפריעה לאותות סינפטיים תקינים, מה שמוביל לליקויים נוירו-קוגניטיביים הכוללים קשיים בהפשטה, שטף מילולי, קשב, למידה של מידע חדש וזיכרון. HIV-1 tat גורם להפרשה של מולקולות דלקתיות, אשר יכולות לחקות את הדיספונקציה הסינפטית הנצפית במטופלים עם HIV. עכברים בוגרים המבטאים GFP בתאים חד-גרעיניים, כולל מיקרוגליה, משמשים לחקירת דלקת נוירולוגית המושרית על ידי HIV-1 tat באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולה דרך גולגולת דקה (thin skull two photon microscopy).
ניתן לדמות ב-in vivo את תגובות המיקרוגליה לאחר הזרקה של tat. התמונות המתקבלות מדגימות קיצור והעבה של שלוחות המיקרוגליה ויצירה של מבנים דמויי כוס פגוציטית, וכן תנועה של מונוציטים פריפריים בכלי דם מיקרו-מוחיים. שלום, אני דן מרקר מהמעבדה של האריס גלברד ומהמרכז לפיתוח ומחלות עצביות באוניברסיטת רוצ'סטר.
שלום, אני EF Trombley ממעבדת Esca במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר. שלום, אני Shain Luu, גם אני ממעבדת Albas. היום נדגים לכם פרוצדורה לדימות דו-פוטוני באמצעות הכנת גולגולת דקה.
אנו משתמשים בנוהל זה כדי לחקור דלקת עצבית כרונית. לכן, נתחיל בניסוי המוצג כאן, שבו נעשה שימוש ב-OT המבטא GFP בשורות תאים מונונוקלאריים, כולל מיקרוגליה.
ניתן להשתמש בזני עכברים שונים כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. התחילו בהכנת עכבר שהורדם באמצעות fentanyl ו-midazolam לניתוח. ראשית, ודאו שהבעל לא מגיב יותר לגירויים כואבים, כגון צביטה בזנב.
הנח את בעל החיים על פד חימום כדי למנוע היפותרמיה לאחר ההרדמה. לאחר מכן, כסה את עיני בעל החיים במשחה אופתלמית מגינה כדי לשמור על לחות העיניים. יש לוודא שכל כלי הניתוח עברו עיקור באוטוקלאב או במכשיר עיקור בחרוש זכוכית; חטא את הכלים באופן נוסף על ידי השריה ב-70% ethanol.
הסר בעזרת מספריים את הפרווה מקרקופת החיה, ולאחר מכן חטא את האזור באמצעות תמיסת פובידון יוד 10% ואתנול 70%. התחל את הניתוח באמצעות מספריים קטנים ליצירת חתך בקו האמצע של הקרקפת, החל מארבעה עד חמישה מילימטרים קודמלית לגולגולת והתקדמות קדימה עד לחלק הקדמי של העיניים. חתך זה צריך להיות ארוך מספיק כדי שהעור לא יפריע להדבקת הפלטה המייצבת את ראש העכבר במהלך דימות בדו-פוטונים.
בשלב הבא, מרח 100% ethanol באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים כדי לייבש את הקרומים שעל גבי הגולגולת. גרד אותם בעזרת פינצטה עדינה. אם הקרומים לא יוסרו, קיבוע לוחית הראש לא יהיה יציב.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, זהו את האזור שיידלל. הימנע מאזורי עניין הממוקמים ישירות מעל תפרים גולגולתיים, שכן הגולגולת פחות יציבה באזורים אלו, וכלי דם גדולים וקרומי המוח שמתחתיהם יפריעו לדימות שיישלח לחלון הצפייה באזור העניין. לאחר מכן, שוב, באמצעות מקל צמר גפן, נסה להדלל את הגולגולת שוב באמצעות תמיסה של 10% של ferric chloride.
מרחו שכבה דקה של דבק perma bond, nine 10 מסביב לקצוות של חלון התצפית מתחת ללוחית הראש. לאחר מכן, הניחו את הלוחית מעל אזור העניין בגולגולת בעל החיים תוך הפעלת לחץ קל כדי להדביק את הדבק. מרחו כמות קטנה של אקריליק מסביב לקצה חלון התצפית באמצעות מזרק.
לבסוף, מרחו כמות קטנה של Tite 4 54 לקצוות של חלון התצפית כדי למנוע דליפות. הבריגו את לוחית הראש למחזיק החיה ובדקו את היציבות תחת מיקרוסקופ דיסקציה; על ידי בדיקה קלה עם פינצטה, לא צריכה להיות תנועה של הגולגולת ביחס ללוחית הראש.
הנח טיפה של תמיסת סלין על חלון התצפית כדי לוודא שאין דליפות כהכנה לדילול. ייבש את הגולגולת באמצעות שילוב של מקלוני צמר גפן סטריליים ואוויר דחוס. דלל את הגולגולת באמצעות מקדח IRF 0 0 7 במקדחה מיקרו-टू (micro to two drill).
ב-4,000 RPM. התחלו לדקק בעדינות רבה שטח מעגלי בקוטר של 2 עד 2.5 מילימטרים. השתמשו אך ורק בתנועות sweeping קלות, כמעט מקבילות לגולגולת.
אין להפעיל לחץ ישיר כלפי מטה. יש להפסיק את הקידוח מדי 20 עד 30 שניות כדי להסיר עפר עצם באמצעות אוויר דחוס. הפסקות קידוח אלו מאפשרות לגולגולת להתקרר, ובכך מונעות נזק לרקמת המוח שמתחתיה כתוצאה מחום.
בעוד הקידוח מתקדם, שימו לב למעבר לשכבת העצם הספוגית והלחה יותר הנקראת ה-Diplo. ברגע שהגעתם לשכבה זו, הפעילו זהירות יתרה עם המקדח. בדקו מדי פעם את עובי הגולגולת על ידי הנחת תמיסת סלין מעל האזור הדק והסתכלות תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
מילית סלין תסייע בנוסף בפיזור החום. ככל שהגולגולת נהיית דקה יותר, כלי דם קטנים יותר הופכים לנראים. השתמשו בלהב דנטלי מיקרוסקופי כדי להשיג את הדילול הסופי תחת סלין.
המיקרו-להב (microblade) מספק משוב תחושתי רב יותר לגבי יציבות הגולגולת. הדבר מאפשר הכנות דקיקות הרבה יותר מאשר שימוש במקדח לבדו. עובי הגולגולת האופטימלי לצורך דימות הוא 10 עד 30 micrometers.
תהליך הדילול כולו אורך בדרך כלל בין 15 ל-30 דקות. יש לבדוק את עובי הגולגולת תחת פלואורסצנציית epi מספר פעמים במהלך יצירת חלון הגולגולת הדק. מידת החדות והעומק של המיקרוגליה וכלי הדם הנראים מהוות אינדיקציה טובה לכך שהחלון מוכן לדימוי.
לאחר שהחלון מוכן, השתמשו בפיפטת זכוכית בקוטר 1 mm כדי להניח טיפה קטנה של דבק אקרילי Cy על אזור הגולגולת הדק, והנחילו בזהירות חתיכת זכוכית כיסוי מעליה. לאחר מכן, לחצו בעדינות על הגולגולת כדי לסחוט שאריות דבק, תוך הימנעות מיצירת בועות בין הגולגולת לזכוכית הכיסוי, שכן אלו עלולות להפריע לשדה הראייה. לאחר הייבוש, השתמשו בלהב מיקרוסקופי כדי להסיר בזהירות כל שארית דבק שנותרה על זכוכית הכיסוי כהכנה לדימות דו-פוטוני.
כסו את חלון קליפת הגולגולת הדקה בתמיסת סלין ואתרו את אזור העניין תחת פלואורסצנציית epi. כדי לאפשר דימות עתידי של האזור, צלמו תמונה באמצעות מצלמה פוטוגרפית לדימות. מוצג כאן שימוש במיקרוסקופ פוטו-דו-פוטוני בהתאמה אישית עם לייזר טי-ספיר (ti sapphire) המכוון ל-920 nanometers.
הפלואורסצנציה מזוהה באמצעות שפופרת מכפיל פוטונים (PMT) במצב זיהוי שדה מלא ובמסנן פליטה של 5 81 80. במהלך כל סשן ההדמיה נעשה שימוש בעדשת טבילה במים 20x. הגדירו את תפוקת הספק הלייזר המקסימלית של העדשה בין 50 ל-65 milliwatts.
בשלב הבא, בחרו אזור עניין בשכבה קורטיקלית אחת או שתיים, עד עומק של 150 micrometers מתחת לפני השטח של הקליפה. כדי להקל על צילום חוזר, צלמו את אותו שדה ראייה בזום דיגיטלי של one x, two x ו-three x. כלי דם יכולים לשמש כנקודות ציון כדי למצוא בקלות את אותו שדה ראייה במהלך מפגשי דימוג עוקבים.
תחת הגדלה של three x, רכשו מספר Zacks עם 80 עד 90 Z steps כל אחד וצעד של 0.69 micrometer כל חמש דקות למשך עד 30 דקות. דבר זה מאפשר דגימה טובה של המורפולוגיה וההתנהגות של המיקרוגליה לאורך זמן בין רכישות של Zacks; ודאו את מפלס הסליין ואת עומק ההרדמה. במידת הצורך, ניתן לתת מנת דחף של שליש מהמנה המקורית של תערובת חומרי ההרדמה במהלך הפרוצדורה כדי למנוע שקיעת tat על המזרק והמחט במהלך ההזרקה, ימים לפני ההזרקה.
בצעו סילילוז (Siloization) לדיפון הפנימי של מחט בכיול 35 ושל מזרק לנפחים קטנים של 10 microliter על ידי שאיבת תמיסת מימדית (sizing solution) עד למילוי מלא של המחט והמזרק. השאירו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן רוקנו את התמיסה מהמזרק, הסירו את הבוכנה והניחו למזרק ולמחט להתייבש לחלוטין. לבסוף, שטפו את המזרק ואת המחט ביסודיות במים דה-יוניזציה (deionized water).
לאחר הסיליקוזציה, ניתן להשתמש במזרק ובמחט במשך יותר משישה חודשים לפני שיהיה צורך בכיול מחדש. ביום ההזרקה, יש להניח טיפה קטנה של תמיסת ה-TAT על תגית זכוכית שעברה סיליקוזציה. בעזרת טיפ פפית סיליקוני, טענו את הכמות הרצויה של התמיסה אל תוך מזרק המיקרו-נפח מתוך טיפה זו.
באמצעות מקדח, בצעו קרניוטומיה קטנה בקוטר 0.5 מילימטרים, במרחק של שלושה מילימטרים באופן רוסטרלי או לטרלי לחלון הקורטקס הדק בגולגולת שבו התקבלו תמונות הדו-פוטון. כדי לבצע זאת, דללו את הגולגולת בזהירות. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה חדה כדי להסיר את שכבת העצם הדקה.
השתמש במיקרו-מניפולטור כדי ליישר את המחט במידה 35 ואת המזרק עם ה-craniotomy. לאחר מכן, הנח את המחט בזהירות לעומק של 700 עד 900 micrometers מתחת לפני השטח של הקליפה. הזרק three microliters בקצב של 80 nanoliters לדקה באמצעות משאבת מזרקים הנשלטת על ידי מיקרו-מעבד.
איור זה מציג מיקרוגליה המסומנת ב-GFP אשר הודגמו באמצעות דימיון דו-פוטוני לאחר השתלת חלון קורטיקלי של גולגולת דקה, בעומק של כ-50 micrometers מתחת לפני השטח של הקליפה. חתכים דו-פוטוניים בודדים שנלקחו ביום אפס, 15 עד 30 דקות לאחר השתלת החלון הקורטיקלי של הגולגולת הדקה, כמו גם אלו שנלקחו שבעה ו-17 ימים מאוחר יותר, מדגימים כי החלונות נותרים שקופים בעוד שהמיקרוגליה נשארת פעילה בהיעדר פגיעות דלקתיות. הדבר מדגיש את התועלת של שיטה זו לחקירת אינטראקציות נורמליות ודלקתיות בין תאי אפקטור חיסוניים לסוגים אחרים של תאים עצביים.
בבדיקה in vivo, היטלי Z שתועדו שש ו-24 שעות לאחר הזרקה של הנוירוטוקסין TAT של HIV מראים שינויים מורפולוגיים בולטים של מיקרוגליה מופעלת. הדבר מדגים עוד את יכולתנו לחקור שינויים מורפולוגיים של מיקרוגליה בזמן אמת במודלים אקוטיים וכרוניים של נוירו-דלקת. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין חלון גולגולת דק ולהשתמש בו למחקר של נוירו-דלקת בעת ביצוע פרוצדורה זו.
חשוב לזכור להקדיש את הזמן הדרוש בעת הטיפול בגולגולת כדי למנוע נזקים שעלולים להיגרם כתוצאה מתהליך ההכנה עצמו. זהו כל התהליך. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לוויזואליזציה in vivo של מיקרוגליה ומונוציטים במחזור הדם בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית טרנסקרניאלית. הטכניקה מאפשרת תצפית על הפעלת מיקרוגליה בתגובה לחלבון הבקרה Tat של HIV-1 לאורך תקופות ממושכות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- מיקרוסקופיה
רקע
- זיהום ב-HIV קשור לדלקת נוירולוגית (neuroinflammation) ולליקויים קוגניטיביים.
- מיקרוגליה ממלאת תפקיד מכריע בתגובה החיסונית של המוח.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית טרנסקרניאלית מאפשרת דימות של תאי מוח בזמן אמת.
- חלבון HIV-1 Tat משרה תגובות דלקתיות במוח.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לצפייה בהתנהגות מיקרוגליה in vivo.
- הערכת ההשפעות של HIV-1 Tat על הפעלת מיקרוגליה.
- אספקת תובנות לגבי המכניזמים של דלקת נוירונית (neuroinflammation).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של חלון בגולגולת מודקקת לצורך דימוי.
- שימוש בעכברים בוגרים המבטאים GFP בתאים חד-גרעיים.
- מיקרוסקופיית פוטונים כפולה טרנס-קרניאלית לדימוי תגובות של מיקרוגליה.
- הזרקה של HIV-1 Tat להשראת נוירו-דלקת.
תוצאות עיקריות
- תהליכי מיקרוגליה הראו שינויים מורפולוגיים משמעותיים לאחר הזרקת Tat.
- מבנים דמויי גביע פגוציטריים נצפו במיקרוגליה מופעלת.
- נצפתה נדידה של מונוציטים פריפריים בכלי דם מיקרוסקופיים מוחיים.
- השיטה אפשרה תצפית ממושכת על דינמיקה תאית.
מסקנות
- הכנת הגולגולת המודקה יעילה עבור דימוי in vivo של מיקרוגליה.
- HIV-1 Tat גורם לשינויים בולטים במורפולוגיה ובהתנהגות של מיקרוגליה.
- טכניקה זו יכולה לשפר את ההבנה של תהליכים נוירו-דלקתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת דימיון כרוני ומינימלית-פולשני של דינמיקת מיקרוגליה in vivo, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית במחקר של דלקות עצביות, שבה גישות מסורתיות גורמות להפעלות מטעות. על ידי אספקת חלון דימיון יציב למשך שבועות, היא תומכת בהערכה אורכית של מעורבות המטרה ובסריקה פנוטיפית במודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים. הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי בהפחתת סיכונים פרה-קלינית, בכך שהיא מאפשרת קריאות כמותיות חוזרות של מורפולוגיה וניידות של מיקרוגליה ללא ארטיפקטים כירורגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של תגובות מיקרוגליאליות לחלבונים נוירוטוקסיים כגון Tat בזמן אמת.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מעקב ארוך טווח אחר מורפולוגיה וניידות של מיקרוגליה במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות מושגעות תרופות לבין ארטיפקטים הקשורים לפרוצדורה במודלים של דלקת נוירונלית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך דימות כמותי של מצבי הפעלה של מיקרוגליה.
- ערך תפעולי: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות סשנים של דימות יציבים וחזרתיים לאורך שבועות, ובכך מפחית את השונות בסריקת תרכובות.
- قابליות הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה להערכת תרכובות מרובות או הפרעות גנטיות באותה קוהורט של בעלי חיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מדמה הפרעה נוירו-קוגניטיבית הקשורה ל-HIV ומחלות נוירו-דגנרטיביות אחרות בעלות מרכיבים נוירו-דלקתיים באמצעות מערכות רלוונטיות למחלה.
- תיקוף פרה-קליני: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מתן אפשרות לתצפית כרונית על שינויים במיקרוגליה בתגובה לגירויים דלקתיים.
- התאמת ביומרקרים: מקשר בין פנוטיפים של מיקרוגליה הנגזרים מדימות לבין תוצאות תפקודיות, ובכך תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת הערכה איטרטיבית של מודולטורים של מיקרוגליה בהקשרים של דלקת עצבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות דימות של דינמיקת תהליכי מיקרוגליה ויצירת כוס פגוציטוזה in vivo.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון ניידות מיקרוגליה, עובי תהליכים ופעילות פגוציטית, לצורך השוואת תרכובות.
- אנליזה: מאפשרת ניתוח סטטיסטי של Z-stacks בשיטת time-lapse לכימות מצבי הפעלה של מיקרוגליה ושינויים מורפולוגיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דימות מיקרוגליה למודלים של מחלות נוירודגנרטיביות, ובכך תומכת בהמשכיות פרה-קלינית ב-HAND ובהפרעות קשורות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר למחקרי נוירו-דלקת כרונית על פני מספר זרועות ניסוייות ונקודות זמן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקריו של שפעול מיקרוגליה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות הכנת חלון יציב וכרוני.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים אורך, נקיים מארטיפקטים, על מודולציה של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לנוגדי דלקת עצבית בהתבסס על נקודות סיום של דימות עמיות וכמותיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקטי בעכברים, הכנת חלון גולגולת ומיקרוסקופיה בעלת שני פוטונים.
- תלוי במכשור מדויק הכולל מקדחים מיקרוסקופיים, מזרקים עם ציפוי סיליקון ולייזרים מסוג Ti:sapphire מכווננים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח עומק עקיקה עקבי של הגולגולת (10–30 μm) ופרמטרי הדמיה אחידים לאורך הסשנים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על זני עכברים שונים או מודלים של מחלות מעבר ל-CX3CR1 GFP/+.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בניהול קפדני של ההרדמה ומניעת לחץ ישיר כלפי מטה במהלך דילול הגולגולת כדי למנוע נזק לרקמה.
