Name: חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: למד הדמיית העברת HIV בין תאי T באמצעות מיקרוסקופיית confocal חיה. שיטה זו מאפשרת לחקור את מנגנוני העברת הנגיף דרך סינפסות וירולוגיות בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סקירה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים, AI074420-02, בורוז Wellcome פרס החוקר, המדען Hirschl קריירה פרסים BKC ועל ידי המרכז NSF עבור Biophotonics מדע וטכנולוגיה, הסכם שיתופית PHY012099, ועל מערכת הבריאות UCD מחקר פרס על TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">הובנר ואח&#39; המדע 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. סקירה תא אל תא התפשטות של HIV תוארה לראשונה באמצעות תאים נגועים ב-HIV Jurkat כמו תאים התורם העיקרי CD4 + T לימפוציטים כמו תאים acceptor 1,2,3. במחקרים אלה, זוהה הנגיף בתאים קבוע באמצעות נוגדן מכתים. כדי לעקוב אחר העברה של הנגיף מתא לתא בתאים חיים, אנו מנצלים שיבוט רקומביננטי, מולקולרית זיהומיות של HIV נקרא HIV-Gag iGFP 4. היא נושאת את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מוכנס לתוך פנימי החלבון Gag בין תחומים MA ו-CA. זה שיבוט מולקולרי של HIV שומרת infectivity ללא צורך וירוס עוזר. חלקיקי הנגיף עשוי שיבוט זה נטענים stoichiometrically עם חלבון פלואורסצנטי ירוק, מתן אות הקרינה חזקה כדי לפקח על הרכבה העברת נגיפיים בין תאים. הפועל בשיתוף עם אינרטי התא מעקב צבעי ניאון, תאים הנמען יכול להיות מופלים מתאי התורם הזנה, המאפשר אחד כדי להמחיש את העברת HIV מתא T נגוע לתא T נגוע 5. היווצרות הסינפסה Virological והעברת נגיף מתא אחד לאחר מכן ניתן לצפות בתאים חיים בזמן שהם בתרבית חדר אטום, הדמיה גז חדיר. (יום 1) 2. הכנה של HIV-Gag iGFP transfected Jurkat תאים T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את CD4 אנושי + T התא קו Jurkat (ATCC, Manassas, VA) על ידי בקפידה שמירה על תאים בריכוז שבין 2 x x 10 5 8 10 5 תאים / מ&quot;ל Jurkat תרבות מדיה (RPMI 1640, 10% בסרום שור עוברית, 100 יחידות / מ&quot;ל ​​פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין). המפתח להצלחה: התרבות של תאים Jurkat בריכוזים עודף של 8 x 10 5 תאים / מ&quot;ל תגרום להפחתת יעילות transfection. הערה: transfection של ה-DNA-Gag iGFP HIV proviral לתאי T, כמתואר להלן, תוצאות בייצור של שכפול הנגיף-המוסמכת הכשל החיסוני האנושי. ככזה, נהלים כל להתבצע רק על ידי אנשי המעבדה הכשרה ברמה biosafety מוסמך 2 + או biosafety ברמה 3 (BL2 + / BL3) תרבות חדרים רקמות. עבודה עם HIV מדבקות מתקני הדמיה חייב להיות מאושר על ידי המשרד המקומי שלך biosafety מוסדיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect Jurkats עם iGFP-Gag ויראלי פלסמיד, HIV בשיטת nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). גלולה 5 x 10 6 תאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 150 x ז לשאוב supernatant לשטוף את התאים פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים (PBS). צנטריפוגה את התאים resuspend את הכדור אל μL של 97 V, טרום חימם פתרון nucleofector המכיל תוספת של היצרן. מוסיפים שלוש μL של רעלן פנימי חינם HIV-Gag iGFP פלסמיד (1 מיקרוגרם / μL) על השעיית התא ומערבבים בעדינות. מעבירים את ההשעיה התא קובט ו nucleofect באמצעות תוכנית ה-S-18. מיד להעביר את התאים מ&quot;ל 3 של prewarmed תרבות התקשורת Jurkat ללא אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין CD4 + תאים יעד סינפסות virological, נקבל אדם בתאי הדם ההיקפיים mononuclear של באפי מעילים באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי Ficoll-Paque (GE Healthcare, אופסלה, שוודיה). תאים מסוג CD4 + T ואז הם נבחרו באופן שלילי באמצעות ערכת בידוד מגנטי חרוז (Miltenyi BIOTEC, אובורן, CA). אלה עשויים להיות מאוחסנים cryogenically ב N2 נוזלי aliquots 5 μL x 6 cells/500 10 של התקשורת הקפאה (90% עוברי DMSO serum/10% שור). CD4 העיקרי מופשר + T תאים בתרבית הם RPMI 10% FBS, בתוספת 10 יחידות / מ&quot;ל ​​של IL-2. </li></ol> (יום 2) 3. שחזור של תאים חיים מ Jurkats transfected עם HIV-Gag iGFP ו מכתים של תאים היעד עם צבעי ניאון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים Jurkat להתאושש transfection למשך הלילה. ואז להסיר את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה על חומר צפיפות hypaque ficoll הדרגתי. לוותר על 1.5 מ&quot;ל של Ficoll-Paque לחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. בעדינות שכבת החומר הזה שיפוע עם Jurkats transfected בנפח 5 מ&quot;ל של RPMI. צנטריפוגה התאים ב XG 400 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם משם. בזהירות להסיר את התאים באמצעות ממשק מדיה / Ficoll בעזרת פיפטה. העברת להם צינור חדש 15 מ&quot;ל חרוטי. לדלל את התאים עם RMPI כדי בהיקף כולל של 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 300 עבור 10 דקות. Resuspend את הכדור בתוך 3 מ&quot;ל של התקשורת Jurkat התרבות 2 ס&quot;מ טוב (6-גם צלחת) ולהחזיר את התאים בתרבית רקמה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבחין בין התאים היעד מתאי התורם בתא תאים ניסויים להעביר לנו prelabel CD4 + תאים היעד עם צבעי ניאון. ראשי CD4 + T תאים מסומנים גםing לפני השימוש. היו לנו מצוין תיוג הצלחה בתאי T עם CellTracker וגם צבעים CellTrace (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). בעוד ריכוז צבע זמני דגירה חייב להיות מותאם בהתאם לצבע מסוים ואת סוג התא המשמש, פרוטוקול נציג להלן. גלולה 4 x 10 6 CD4 + T תאים ראשונית על ידי ספינינג ב XG 400 עבור 10 דקות. לשטוף את התאים עם 5 מ&quot;ל של PBS ו resuspend ב 2 מ&quot;ל של PBS. הוסף CellTracker אורנג&#39; (CMTMR, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לריכוז סופי של 1.5 מיקרומטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסף 8 מ&quot;ל של התקשורת Jurkat מלאה צנטריפוגות ב XG 400 עבור 10 דקות. Resuspend התאים מ&quot;ל 3 של מדיה מלאה בתוספת 10 יחידות / מ&quot;ל ​​של IL-2 ו - מקום לתרבות רקמות חממה לילה. </li></ol> (יום 3) 4. ניטור סלולרי ל-תא העברה של HIV-Gag iGFP באמצעות הדמיה תא חי אנו משתמשים באופן שגרתי HIV-Gag iGFP תאים Jurkat transfected 48 שעות שלאחר transfection. עם זאת, השתמשנו בהצלחה תאים מוקדם ככל 24 שעות, מאוחר ככל 72 שעות שלאחר transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 48 שעות שלאחר transfection, HIV-Gag iGFP Jurkats להביע נספרים, שטף עם CO 2-מדיה עצמאית (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה), ואת resuspended לחיות בתוך תא הדמיה התקשורת (CO 2 תקשורת עצמאית, 10% בסרום שור עוברית, 100 U / mL פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין, 10 יחידות / מ&quot;ל IL-2) בריכוז של 1-3 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לרחוץ resuspend CD4 + יסודי שכותרתו בתאי T בריכוז של 1-3 x 10 7 תאים / מ&quot;ל בתקשורת הדמיה תא חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים HIV-Gag iGFP-transfected Jurkats עם CD4 + T תאים ראשונית ביחס 01:02 או 01:03 ו לטעון לתוך תרבות רקמות מטופלים, גז חדיר, microchamber (Ibidi, ורונה, WI). לדוגמה, שילוב 20 μL של HIV-Gag iGFP Jurkats transfected עם 40 μL של CD4 + יסודי שכותרתו ותאי T. טען 50 μL של תערובת זו לתוך תא Ibidi ולאטום את החדר עם אטמי. אבטח את אטמי ידי לפפה את התקע / ממשק Ibidi קאמרית עם parafilm. </li></ol> 5. שיקולים לפלטפורמות מיקרוסקופיה: ספינינג דיסק confocal הדמיה לאחר טעינת תא הדמיה Ibidi עם תאים, אנחנו מיד לעלות את המכשיר על גבי מיקרוסקופ אופטי הפוכה (iX71 אולימפוס, מרכז עמק, הרשות הפלסטינית). החדר Ibidi יש להעביר המיקרוסקופ רק BL2 + מאומן אנשי המעבדה לובש בגדים בטיחות מתאימים. למרות לחיות תאים הדמיה כלל משתמשת בתאי הדגירה יקר כדי לשמור על יציבה 37 ° C סביבה, זה הושג באמצעות תנור התרמוסטט פשוט וחסכוני (אסי 400, Nevtek, Williamsville, VA) יחד עם טיפ תרמי מסוג T-רכוב ליד המדגם על המשוב הטמפרטורה הנכונה. מצאנו שימוש CO 2-מדיה עצמאית מאפשר לנו לשמור על כדאיות התא גבוהה תוך הימנעות משימוש חדר 2 CO. למאגר פלטפורמה נגד תנודות הטמפרטורה בחדר, כדי לחסום את האור בחדר רקע, גדול שחור תכריכים הוא תלוי על ההתקנה מיקרוסקופ / דוד שלמה ליצירת כיס אוויר מבודד סביב המערכת. זה מצמצם מאוד וריאציה הטמפרטורה להיסחף הקשורים בטמפרטורה הקשורות מדגם, אבל דורש מראש חימום במשך 30 דקות לפני הרכבה המדגם. 6. עיבוד נתונים, רכישת העברת תמונה תמונות נלקחים באמצעות טבילה 60x 1.42 NA שמן אובייקטיבי (UPlanApo N, אולימפוס) כמו הצמצם המספרי גבוה (NA) משפר באופן משמעותי ברזולוציה. כדי ליצור תמונות 3D confocal, סריקה מבוצע על ידי יחידת דיסק ספינינג confocal (CSU-10, Yokagawa, יפן), כי בעת ובעונה אחת משתמשת&gt; 800 הנקודות confocal כדי להגדיל באופן משמעותי את קצב הסריקה. כדי להחמיא המהירות שלו, את CSU-10 הוא זיווג עם מכשיר רגיש מאוד טעונה מצמידים אלקטרונים הכפלה (EMCCD, iXon + 897, אנדור טכנולוגיות, אירלנד) המצלמה כדי לאפשר הדמיה מהר, אור נמוך אשר מפחית הן photobleaching ו phototoxicity. מקור אור פלואורסצנטי הוא רב גל ArKr יון גז לייזר (Innova 70C, קוהרנטית, סנטה קלרה), שבה אורך הגל הרצוי (488 ננומטר) כוח לייזר למדוד ממש לפני המטרה מיקרוסקופ (&lt;1 mW) נבחרים על ידי-acousto אופטיים מתכונן המסנן (AOTF), (אנדור טכנולוגיות). כדי לצמצם עוד יותר photobleaching ולהאריך את זמן הדמיה בסך הכל, AOTF במהירות (מיקרו) סוגר את קרן הלייזר בכל פעם שהמצלמה אינה פעילה (10-20 ms) בעוד תמונה החדשים שנרכשו מועבר מן CCD (15-30 חשיפה ms) למחשב. אור הלייזר מצמידים למערכת דיסק ספינינג באמצעות 405/488/568/647 מרובע הלהקה dichroic במראה (Semrock, רוצ&#39;סטר, ניו יורק). פליטת הקרינה מסונן באמצעות מסנן bandpass 525/50 (Semrock) בתוך גלגל מסנן (מוצרים אלקטרוניים Ludl, הות&#39;ורן, ניו יורק) עלה בetween המצלמה EMCCD ויחידת confocal דיסק מסתובב. חומרה כל ורכישה, לרבות Z-הבמה (Mad העיר Labs, מדיסון, ויסקונסין), נשלטים על ידי תוכנה IQ v1.8 אנדור. כדי למקסם את המהירות של רכישת בסביבות 1.2-1.9 ערימות second תמונה 3D, אנחנו לחתוך את האזור הקלטה של ​​המצלמה של EMCCD מטה לאזור המיידי של התא זוג. יתר על כן, על חשבונו של מידע כלשהו ז&quot;ל, גדול Z-צעד בין 0.45-0.75 מיקרומטר יכול לשמש כדי להאיץ את הרכישה. הדמיה בתנאים אלה יכול להימשך עד 6 שעות - שימוש רצוף קטעים 20-60 דקות - עם photobleaching מינימלית. בסך הכל, כל קטע נתונים בדרך כלל תופסת 5-20 GB של שטח כמו עשרות אלפי תמונות נלקחים. כדי להקל על התחבורה ניתוח של קובצי נתונים גדולים, כל קבוצה הרכישה צריך להיות מפורק וייצא כמו 1 GB קובץ TIFF מגזרים התמונה באמצעות אנדור IQ v1.8 תוכנה. מכאן, הרבה חבילות תוכנה מעולה זמינים עבור ניתוח התמונה, כגון Metamorph, Volocity ו ImageJ (אנו ממליצים וריאציה פיג&#39;י שלה). כאשר שני סמנים ניאון יש מעקב, אנחנו זמנית להקליט את שניהם מבלי להאט הרכישה באמצעות &quot;מצב מסך מפוצל&quot;. הסמנים שניהם שמחים על ידי שני קווים שונים לייזר ArKr בבת אחת (בדרך כלל 488 ו - 568 ננומטר). מוזן ישירות לפני המצלמה EMCCD הוא דימוי ספליטר (OptoSplit השנייה, הגלעד, קנט, בריטניה) המפריד בין שתי תמונות שונות. תמונה כל כך מסוננים באופן עצמאי באמצעות מסנני הקרינה (Semrock) ו מוקרן Side-by-הצד על המצלמה בעת ובעונה אחת ליצור את &quot;מסך מפוצל&quot; אפקט. זה היה אז דורשים חיתוך ידני ושילוב של תמונות מאוחר יותר עיבוד תמונה. 7. שיקולים עבור עיבוד תמונה וניתוח נתונים אנחנו בדרך כלל לבצע ניתוח התמונה עם Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) על מחשבי מקינטוש (אפל, Inc). ספינינג לייזר דיסק תמונות confocal מיקרוסקופיה מותאמים הראשון בעוצמה שלהם לתקן photobleaching, deconvolved אז עם Volocity. מדידות אינטנסיביות ומעקב אחר puncta Gag מבוצע עם מודול כימות Volocity. עבור ערכות תמונה שבה התנועה ביחס סינפסה מראש יצרו צריך להיות מחושב, אלגוריתם מעקב אוטומטי מועסק העוקב על הכפתור הסינפטי לאורך כל רצף. בדיקה ידנית של אזורים של עניין שהוגדר על ידי התוכנה autotracking חייב להתבצע על מנת לאשר כי התוכנה איתר נכונה את האובייקט הרצוי. עבור אובייקטים שבו בניגוד האובייקטים המקיפים חלשה מדי, מעקב ידני עשוי להתבצע על בסיס מסגרת לפי מסגרת. חבילת התוכנה מאפשרת Volocity הייצוא של מיקום XYZ, עוצמת אות משולב בתוך האובייקטים הרצויים. המרחק מן הסינפסה ומהירות של האובייקט מעקב מחושבים על ידי נרמול תנועות למרכז הכפתור הסינפטי. 8. נציג תוצאות בתוך 10 עד 15 דקות של ערבוב אחד צריך להיות מסוגל לדמיין HIV-Gag iGFP תאים Jurkat להביע דבקות CD4 + T תאים העיקרי. הדמיה conjugates אלה, ניתן להעריך את תנועות puncta Gag בתאים נגועים וכן בתאים היעד לאחר synaspe. אפשר לראות את התנועה של puncta Gag-iGFP לתאי יעד קצר לאחר סינפסות נוצרות.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לדמיין את ההעברה של HIV-מתא לתא. מחקרים אחרונים מהמעבדה שלנו ושל אחרים עולה כי זה עשוי להיות מצב השולט של HIV להתפשט בין ותאי T. השיטה המתוארת כאן מעסיקה צורה רקומביננטי של HIV, הנקרא HIV-Gag iGFP, אשר נושאת חלבון מקודד גנטית תג ירוק ניאון ב Gag מבניים הליבה, חלבון. בגלל רמות גבוהות של ה-GFP מיוצר כל חלקיק וירוס, זה שיבוט שכפול-המוסמכות של HIV מאפשר לחוקרים לעקוב אחר חלקיקי נגיף יחיד בזמן אמת. וירוס זה צריך להיות שימושי במיוחד במחקרים הנוגעים להעברת הרכבה תאים תאים של ה-HIV. העברת ה-HIV על ידי העברת תאים התא היעילה ביותר. במהלך השעה שלוש שיתוף תרבות, אנו רואים שגרתי וירוס הועבר 20-30% של תאים T העיקרי להערכת cytometry הזרימה. יעילות דומה נראים איכותית במהלך ההדמיה תא חי. בתאי T שנדבק בנגיף להתחיל להרכיב סינפסות עם נגוע בתאי T העיקרי כמעט מיד לאחר תחילתו של תרבות משותפת. מעניין, לא כל התאים העיקריים T המסוגלים אינטראקציה עם HIV תאים הנגועים Jurkat למרות אינטראקציות בכפייה עם פינצטה לייזר (תצפיות פורסם, ג&#39;נרל מוטורס). HIV-Gag iGFP יהיה ללא ספק להיות שימושי לקביעת תת תא T, כי הם רגישים ביותר להעביר תאים תאים, הן במבחנה in vivo.

<table><tbody><tr><td>תאי T מסוג Jurkat</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שכבות Buffy coat של לוקוציטים מדם מלא</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת נוקלאופיקטור (Nucleofector) ותמיסה V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכות EndoFree Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד HIV Gag-iGFP</td><td>מעבדת צ'ן (Chen Laboratory)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכה לבידוד תאי T מסוג +CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צבעי Celltracker/CellTrace</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-מדיה עצמאית</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי דימות</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך Olympus IX-71</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עדשה אובייקטיבית PlanApo N 1.42NA 60X בשמן</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לייזר גז יוני ArKr מדגם Innova 70C</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יחידת מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקיות מסתובבות מסוג ניפקוב CSU-10</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפחלק קרניים דיכרואי Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן חסימה של 525/50 ננומטר (bandpass filter)</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת iXon+ 897 בעלת התקן צימוד מטען עם הכפלת אלקטרונים (EMCCD)</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר חימום תרמוסטטי ASI 400</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חזותי cell ל-תא העברה של hiv באמצעות המשובטים פלורסנט של hiv מיקרוסקופיה confocal חיים

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

לפי פיוזינג חלבון פלואורסצנטי ירוק לחלבונים האהובים עליהם, ביולוגים עכשיו יש את היכולת ללמוד לחיות תהליכים תאיים מורכבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו. כדי לעקוב אחר תנועות של חלבון הליבה וירוס הכשל החיסוני האנושי במהלך התא אל התא העברת נגיף האיידס, יש לנו GFP-tagged החלבון Gag בהקשר של שיבוט מולקולרי זיהומיות של HIV, הנקרא HIV-Gag iGFP. במחקר זה אנו שיבוט ויראלי באמצעות מיקרוסקופ וידאו confocal. בניסוי דמיינו הבאים, אנו transfect קו התא האנושי T עם HIV-Gag iGFP, ואנו משתמשים נגוע שכותרתו fluorescently CD4 + T תאים לשמש תאים יעד הנגיף. באמצעות תוויות ניאון שונה נוכל לעקוב בקלות ייצור התחבורה נגיפיים על פני מבנים אינטר שנקרא סינפסות virological. פשוט חדיר לתאי הגזים הדמיה מאפשרים לנו להתבונן סינפסות עם מיקרוסקופיה confocal לחיות דקות ימים. גישות אלה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר חלבונים נגיפיים, כאשר הם עוברים בתוך מתא אחד למשנהו.

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

על ידי היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק לחלבונים המועדפים עליהם, ביולוגים מחזיקים כעת ביכולת לחקור תהליכים תאיים מורכבים חיים באמצעות...

נוהל זה משתמש בדימות תאים חיים כדי להמחיש ויזואלית את ההעברה של HIV המסומן ב-GFP דרך סינפסות וירולוגיות בין תאי T של חתולי Jerk המבטאים HIV לבין תאי T ראשוניים שאינם נגועים. בדיקת ההעברה מתא לתא מתחילה בהחדרה (טרנספקציה) של HIV gag GFP לתאי T של חתולי Jerk, שהוא שיבון פלואורסצנטי זיהומי של HIV-1; תאי חתולי ה-Jerk שעברו טרנספקציה מבטאים HIV gag GFP. לאחר מכן, מערבבים את תאי חתולי ה-Jerk עם תאי T ראשוניים שאינם נגועים ומסומנים ב-CMTMRed, ומטעינים אותם לתא דימות שבו ניתן לצפות בהעברה של HIV המסומן ב-GFP דרך הסינפסה הוירולוגית.הנתונים המתקבלים מנותחים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות כדי לחשוף את פרטי העברת HIV דרך סינפסות וירולוגיות של תאי T. שלום, שמי בנג'מין דייל מהמעבדה של בן צ'ן במחלקה לרפואה בבית הספר לרפואה של Mount Sinai. שמי גרג מקנרני מהמעבדה של ד"ר תומאס יוזר במרכז NSF לביופוטוניקה במרכז הרפואי של uc Davis.ואני דיאנה תומפסון, גם מהמעבדה של ד"ר Thomas Huser. היום נדגים לכם פרוצדורה לוויזואליזציה של מעבר תא-לתא של HIV-1 באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. בפרוצדורה זו, תאי Jurkat עוברים טרנספקציה עם שיבוט מולקולרי זיהומי של HIV; רק אנשי מעבדה מיומנים העובדים במעבדה מאושרת לבטיחות ביולוגית.ניתן לבצע את הפרוטוקול המוצג כאן בחדרי תרבית רקמות ברמת ביו-בטיחות 2+ או 3. עבודה עם HIV זיהומי במתקני דימות חייבת להיות מאושרת על ידי המשרד המקומי לבטיחות ביולוגית של המוסד. יש לתחזק את תאי ה-jerk cat שישמשו כתאי תור בריכוז שבין 2×10⁵ ל-8×10⁵ תאים למילליליטר.בתרבית תאי jerk cat, ריכוז תאים במצע העולה על 8×10⁵ תאים למוליליטר גורם לירידה ביעילות הטרנספקציה. כדי להתחיל את הפרוצדורה, בצע טרנספקציה של 5×10⁶ תאי jerk cat עם הפלסמיד הווירוסלי HIV gag IGFP באמצעות שיטת ה-amax nucleofection כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ואפשר לתאים להתאושש למשך הלילה. תאים חד גרעיים של דם היקפי (PBMC) מופקים משכבות buffy coats של דם אנושי מלא באמצעות סבב צנטריפוגה במדרג צפיפות של FICO.תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 מופקים מתאי דם פריפריים חד גרעיים (PBMCs) באמצעות סלקציה שלילית באמצעות קיט לבדילת תאי T חיוביים ל-CD4. תאי ה-T החיוביים ל-CD4 שנבחרו באופן שלילי נאספים מעמודה מגנטית ומגודלים ב-PMI שלנו עם 10% FPS, המועשר ב-10 units/mL של recombinant human IL-2. ניתן גם לחלק את תאי ה-T הראשוניים החיוביים ל-CD4 המבודדים למנות ולהקפיא אותם בעזרת מכלים להקפאה קריוגנית. מכלי ההקפאה מונחים במקפיא של 70°C- למשך שלוש עד ארבע שעות לפחות.לאחר מכן מעבירים את התאים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. כעת, כאשר תאי ה-Jurkat עברו טרנספקציה ותאי ה-T הראשוניים חיוביים ל-CD4 המהווים את היעד בודדו, יש להמשיך לניקוי ולסימון של התאים ביום שאחרי הטרנספקציה. תאי ה-Jurkat מבטאים כעת את מבנה ה-HIV הפלואורסצנטי המדבק.בעת טיפול בדגימות זיהומיות, אנו לובשים חלוק מעבדה עם סגירה קדמית ושני זוגות של כפפות. הסר את השאריות התאיות מהתאים שעברו טרנספקציה באמצעות סבב צנטריפוגה מעל תווך fial high pack density. ראשית, העבר 1.5 milliliters של fial pack לתחתית של מבחנה קונוית בנפח 15 milliliters.לאחר מכן, כסו בעדינות את חומר הגרדיאנט בתאי jerk hat שעברו טרנספקציה בנפח של 5 mL של מדיום PMI שלנו. בנקודה זו, תאי ה-jerk hat שעברו טרנספקציה מסוגלים לייצר HIV זיהומי. לכן, יש לחטא את כל קצות הפ pipette שבאו במגע עם התאים המבטאים HIV בתמיסת אקונומיקה בריכוז 10%.לפני ההשלכה למכל בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית, סגרו את השפופרת במכסה, רססו את החלק החיצוני של השפופרת בתמיסת 70% ethanol ונגבו בעזרת נייר Kim wipe יבש. צנטריפוגו את התאים ב-400 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הבלם (brake) כבוי. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה כדי להוציא בזהירות את התאים מממשק המדיום והעבירו אותם לשפופרת קונית חדשה של 15 milliliter. דללו את התאים במדיום PMI שלנו לנפח כולל של 15 milliliters וצנטריפוגו ב-300 GS למשך 10 דקות.בטמפרטורת החדר, נשעה את המשקע בשלושה מיליליטר של מצע גידול jerk hat ונעבירו לבאר בנפח של שני סנטימטר בלוח של שש בארות. נניח את הלוח באינקובטור לתרביות רקמה עד למועד השימוש למחרת. בערב אותו היום, נסמן את תאי ה-T הראשוניים החיוביים ל-CD4 המשמשים כתאי מטרה, כדי להבדיל בינם לבין תאי התורם. ראשית, נשקיע 4x10⁶ תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 על ידי סבוב ב-400 Gs למשך 10 דקות.לאחר מכן שטפו את התאים עם 5 mL של PBS והשעיו אותם שוב. השעיו את התאים ב-2 mL של PBS, הוסיפו cell tracker orange עד לריכוז סופי של 1.5 µM והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר דקות. עם סיום ההדגרה של התאים, הוסיפו 8 mL של מצע גידול chica מלא וסובבו בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך 10 דקות.יש להשעות מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של מצע גידול מלא המועשר ב-10 units per milliliter של IL two ולהניח באינקובטור לתרביות רקמה למשך הלילה. לאחר הדגירה למשך הלילה, תאי התור ותאי המטרה מוכנים לניסוי העברה מתא לתא. לפני הקמת ניסוי ההעברה מתא לתא, יש להכין את תא הדמיון כדי לבפר את הפלטפורמה מפני תנודות טמפרטורה בחדר.כדי לחסום את אור הרקע בחדר, כיסוי שחור גדול נפרס על פני כל מערך החימום של המיקרוסקופ, ובכך נוצר כיס אוויר מבודד סביב המערכת. תא הדמיה נשמר בטמפרטורה יציבה של 37 °C באמצעות מחמם תרמוסטטי עם קצה תרמוקפל מסוג T המוצב לצד הדגימה לצורך משוב טמפרטורה. יש לחמם מראש למשך 30 דקות לפני הצבת הדגימה.דימות קונפוקאלי עם דיסקה מסתובבת באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך משמש ליצירת תמונות קונפוקאליות תלת-ממדיות של מעבר של HIV מתא לתא. כל החומרה והרכישה, כולל במת Z, נשלטות על ידי תוכנת and or IQ גרסה 1.8. הסריקה מבוצעת על ידי יחידה קונפוקאלית עם דיסקה מסתובבת מדגם CS U 10, המשתמשת בו-זמנית ביותר מ-800 נקודות קונפוקאליות כדי להגביר באופן דרמטי את קצב הסריקה ולהשלים את מהירותה. ה-CS U 10 מצומד למצלמת electron multiplying charged coupled device רגישה ביותר כדי לאפשר דימות מהיר בתנאי תאורה נמוכים, דבר המפחית הן את הפוטו-בליצ'ינג (photobleaching) והן את הפוטו-טוקסיות.מקור אור הפלואורסצנציה הוא לייזר גז יוני ארגון-קריפטון רב-אורכי גל. מסנן אופטי הניתן לכיוונון מסוג AOTF משמש לבחירת אורכי הגל הרצויים, שבמקרה זה הם 488 ננומטר ו-568 ננומטר, תוך בקרה על עוצמתם כדי להפחית עוד יותר פוטובליצ'ינג (photobleaching) ולהאריך את זמן הדימוג. ה-AOTF חוסם במהירות את הלייזר לאחר כל חשיפה של 15 עד 30 מילישנייה כאשר המצלמה אינה רוכשת תמונות, ובכך מונעת חשיפה מיותרת בזמן שהתמונות מועברות ממצלמת ה-E-M-C-C-D למחשב.אור הלייזר מוזן למערכת הדיסקה המסתובבת באמצעות מראת דיכרואי quad band 405 488 560 647; הפליטה הפלואורסצנטית מופרדת לפי אורך גל באמצעות מראת דיכרואי long pass של 560 nanometer עם מפליט תמונה (image splitter). הערוץ הירוק מסונן באמצעות מסנן band pass של 525/50 nanometer והערוץ האדום מסונן באמצעות מסנן band pass של 609/54 nanometer. שני הערוצים מוקרנים זה לצד זה על מצלמת ה-E-M-C-C-D.בזמן שתא הדמיון מתחמם, הכינו את התאים לניסוי העברה מתא לתא. השתמשו ב-hemo cytometer כדי לספור את תאי ה-ette המבטאים HIV gag IGFP. הניחו את ה-hemo cytometer בתוך צלחת פטרי כדי למנוע חשיפה ישירה לתאים המבטאים את הנגיף.שטפו את התאים באמצעות מצע ללא תלות בדו-תחמוצת הפחמן והשביו אותם בתמיסה לדימות תאים חיים בריכוז של 1-3 × 10⁷ תאים למילליליטר. השימוש במצע ללא תלות בדו-תחמוצת הפחמן מבטל את הצורך בתא סביבתי עם דו-תחמוצת הפחמן לצורך הדימות.יש לספור, לשטוף ולתרחף מחדש את תאי ה-T הראשוניים המסומנים החיוביים ל-CD4, כפי שהודגם קודם לכן עבור תאי ה-Jurkat. לאחר מכן, כדי להתחיל את ההעברה מתא לתא, ערבבו 20 µL של תאי Jurkat שעברו טרנספקציה של HIV gag-GFP עם 40 µL של תאי T ראשוניים מסומנים החיוביים ל-CD4, והעמיסו 50 µL לתוך מיקרו-תא EBD חדיר לגז שעבר טיפול לתרבית רקמות. אטמו את התא באמצעות פקקים ואבטחו אותם על ידי עטיפת הממשק בין הפקק לתא ה-EBD ב-Parafilm.נגבו את תא ההדמיה באמצעות מטלית כימית ספוגה ב-70% ethanol והניחו לו להתייבש מעט באוויר בתוך המנדף. העבירו את תא ההדמיה האטום בתוך מכל אטום כדי למנוע חשיפה מקרית. במידה והתא נפל במהלך ההעברה, מיד לאחר טעינת התאיים לתא ההדמיה של ה-IBD, התקינו את המכשיר על המיקרוסקופ.צלם תמונות של זוגות תאים באמצעות עדשת שימור בשמן של 60 x 1.42 NA, שכן מפתח מספרי גבוה משפר משמעותית את הרזולוציה כדי למקסם את מהירות הרכישה עבור ערימות תמונות בתלת-ממד. חתך את אזור ההקלטה של מצלמת ה-EM CD לשטח המיידי של זוג התאים. בנוסף, מדרגת Z גדולה שבין 0.45 ל-0.75 מיקרומטר עשויה גם היא לסייע בהגברת מהירות הרכישה בתנאים אלה.תמונות מוקלטות באופן רציף במרווחים של 20 עד 60 דקות. דימוג חוזר של אותה נקודה בדגימה יכול להימשך עד שש שעות עם פוטובליצ'ינג מינימלי בעת הרכישה. כל מקטע נתונים מורכב מעשרות אלפי תמונות שעשויות לתפוס נפח כולל של 5 עד 20 גיגה-בייט.כדי להקל על ההעברה והניתוח של הקבצים הגדולים, כל קובץ מחולק ומיוצא כסגמנטים של קובץ תמונת TIFF בגודל של ג'יגה-בייט אחד. לניתוח התמונות שהושגו, ניתן להשתמש באחת מתוכנות ניתוח התמונות השונות. עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף לפרטים על ניתוח התמונות, כולל תיקון דהייה של העוצמה (intensity bleach correction) ומעקב אוטומטי וידני אחר gag puncta.בתוך 10 עד 15 דקות מהערבוב, ניתן להבחין בתאי Jerk cat המבטאים HIV gag IGFP נצמדים לתאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 בדימוי. באמצעות קומפלקסים אלה ניתן להעריך את תנועת נקודות ה-gag בתאים מזוהמים וכן בתאי מטרה. לאחר היווצרות הסינפסה, בתוך 30 דקות עד שלוש שעות, ניתן להבחין בתנועה של נקודות gag IG FP לתוך תאי מטרה המסומנים ב-Cell Tracker.הרגע הדגמנו כיצד להמחיש ויזואלית מעבר של HIV מתא לתא בין תאי T. בעת ביצוע הליכים אלו, חשוב מאוד לזכור להקפיד על כל אמצעי הזהירות של רמת ביו-בטיחות 2 פלוס (BSL-2+) או רמת ביו-בטיחות 3 (BSL-3) בעת טיפול בדגימות שנחשפו לתאים המבטאים HIV. כמו כן, זכרו להשתמש בתאי JCA מתוחזקים היטב וב-DNA נקי מאנדוטוקסינים כדי למקסם את הטרנספקציה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

פיתחנו וקטור lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת מגיב, את אלמנט Rev-תגובה (RRE) כי ניתן לווסת את ביטוי הגן הכתב בצורה HIV-1 ו-תאת Rev-מותנה. וקטור מאפשר את זיהוי ספציפי של שכפול HIV בתאים חיים באמצעות ביטוי ה-GFP.

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

מאמר זה מתאר שיטה לחזות היווצרות הסינפסה virological HIV-1 המעטפה הנגרמת על bilayers זכוכית הנתמכים מישוריים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך פנימית (TIRF) השתקפות. השיטה ניתן גם לשלב עם כתמים immunofluorescence לזהות הפעלה חלוקה מחדש של מולקולות איתות המתרחשים במהלך היווצרות ה-HIV-1 המעטפה הנגרמת סינפסה virological.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבו תאים בודדים מנוטרים לאירועים חריפים וזיהום HIV-1 פרודוקטיבי במכשיר ננופלואידי. נתוני דימות מגדירים אינטראקציות של קולטן מארח וירוסים ודינמיקה של מסלולי איתות. זוהי השיטה הראשונה עבור תרבות תא יחיד אורך תפוקה גבוהה ננופלואידית והדמיה ללמוד קינטיקה איתות ואינטראקציות מולקולריות.

אפיון תא יחיד של זרם סידן וזיהום HIV-1 באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית רב-מפרקית

שיטה זו מספקת פרוטוקול נגיש וגמיש להכנת רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) עבור קריוטומוגרפיה תאית באתרה ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM).

הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

למד הדמיית העברת HIV בין תאי T באמצעות מיקרוסקופיית confocal חיה. שיטה זו מאפשרת לחקור את מנגנוני העברת הנגיף דרך סינפסות וירולוגיות בזמן אמת.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

גלה סרטונים נוספים