חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים
7 באוקטובר 2010
ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.
נוהל זה משתמש בדימות תאים חיים כדי להדמין את מעבר ה-HIV המסומן ב-GFP דרך סינפסות וירולוגיות בין תאי T של חתולי jerk המבטאים HIV לבין תאי T ראשוניים שאינם נגועים. בדיקת המעבר מתא לתא מתחילה בהחדרה (transfection) של HIV gag GFP, שיב פלואורסצנטי זיהומי של HIV-1, לתוך תאי T של חתולי jerk, כך שתאי חתולי ה-jerk המוחדרים יבטאו את HIV gag GFP. לאחר מכן, מערבבים את תאי חתולי ה-jerk עם תאי T ראשוניים שאינם נגועים ומסומנים ב-CMTMRed, וטוענים אותם לתא דימות שבו ניתן לצפות במעבר ה-HIV המסומן ב-GFP דרך הסינפסה הוירולוגית.
הנתונים שהתקבלו מנותחים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות כדי לחשוף את פרטי העברת ה-HIV דרך סינפסות וירואלוגיות של תאי T. שלום, שמי בנימין דייל מהמעבדה של בן צ'ן במחלקה לרפואה בבית הספר לרפואה מאונט סיני. שמי גרג מקנרני מהמעבדה של ד"ר תומאס יוזר במרכז NSF לביופוטוניקה במרכז הרפואי של uc Davis.
ואני דיאנה תומפסון, גם אני מהמעבדה של ד"ר תומס היוסר. היום נדגים לכם פרוצדורה להדמיית העברה של HIV-1 מתא לתא באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. בפרוצדורה זו, תאי Jurkat עוברים טרנספקציה עם שיבט מולקולרי זיהומי של HIV; הפעולה תבוצע אך ורק על ידי אנשי מעבדה מיומנים הפועלים במעבדה לבטיחות ביולוגית מאושרת.
ניתן לבצע את הפרוטוקול המוצג כאן בחדרי תרבית רקמה ברמת בטיחות ביולוגית 2+ או רמה 3. עבודה עם HIV זיהומי במתקני דימות מחייבת אישור של המשרד המקומי לבטיחות ביולוגית במוסד. יש להחזיק את תאי ה-jerk cat שישמשו כתאי תורם בריכוז שבין 2×10⁵ ל-8×10⁵ תאים למילליטר.
בתרבית תאי jerk cat, ריכוז תאים במצע העולה על 8 × 10⁵ תאים למילליליטר גורם לירידה ביעילות הטרנספקציה. כדי להתחיל את הפרוצדורה, בצע טרנספקציה ל-5 × 10⁶ תאי jerk cat עם הפלסמיד הוויראלי, HIV gag IGFP, באמצעות שיטת ה-amax nucleofection כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ואפשר לתאים להתאושש במהלך הלילה. תאי דם פריפריאליים מונונוקלאריים מבודלים משכבות ה-buffy coat של דם אנושי מלא באמצעות סנטריפוגציה במדרג צפיפות FICO.
תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 מופקים מתאי דם פריפריאליים מונונוקליאריים באמצעות ברירה שלילית (negative selection) בעזרת ערכה לבדילת תאי T חיוביים ל-CD4. תאי ה-T החיוביים ל-CD4 שנבחרו בברירה שלילית נאספים מעמודה מגנטית ומגודלים במצע PMI עם 10% FPS, המועשר ב-10 units per milliliter של recombinant human IL-2. ניתן גם לחלק את תאי ה-T הראשוניים החיוביים ל-CD4 המבודדים למנובות ולהקפיאם בעזרת מכלים להקפאה קריוגנית. מכלי ההקפאה מוcephalים במקפיא של 70- מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות לפחות.
לאחר מכן מעבירים את התאים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. כעת, לאחר שהתאי ה-Jurkat עברו טרנספקציה ותאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 שהם תאי המטרה בודדו, יש להמשיך לניקוי ולסימון של התאים ביום שלאחר הטרנספקציה. תאי ה-Jurkat מבטאים כעת את מבנה ה-HIV הפלואורסצנטי המדבק.
בעת טיפול בדגימות זיהומיות, אנו לובשים חלוק מעבדה עם סגירה קדמית ושני זוגות של כפפות. הסר את השאריות התאיות מהתאים שעברו טרנספקציה באמצעות סנטריפוגציה על מצע fial high pack density. ראשית, העבר 1.5 milliliters של fial pack לתחתית של מבחנה קונית בנפח 15 milliliters.
לאחר מכן, כסו בעדינות את חומר המדרג (gradient material) בתאי jerk hat שעברו טרנספקציה בנפח של 5 mL של מדיום PMI. בשלב זה, תאי ה-jerk hat שעברו טרנספקציה מסוגלים לייצר HIV זיהומי. לכן, יש לחטא את כל טיפי הפפיט שבאו במגע עם התאים המבטאים HIV באמצעות תמיסת הלבנה בריכוז 10%.
לפני ההשלכה למכל בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית, סגרו את השפופרת במכסה, רססו את החלק החיצוני של השפופרת בתמיסת 70% ethanol ונגבו אותה באמצעות נייר Kim wipe יבש. צנטריפוגו את התאים ב-400 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלימה. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה כדי להוציא בזהירות את התאי מנקודת הממשק עם המדיום והעבירו אותם לשפופרת קונית חדשה של 15 milliliter. דללו את התאים במדיום PMI שלנו לנפח כולל של 15 milliliters וצנטריפוגו ב-300 GS למשך 10 דקות.
בטמפרטורת החדר נשעה את המשקע בשלושה מיליליטרים של מצע תרבית jerk hat ונעבירו לבאר של 2 סנטימטר בלוח של שש בארות. נניח את הלוח באינקובטור לתרביות רקמה עד למועד השימוש למחרת. בערב אותו היום, נסמן את תאי ה-T הראשוניים החיוביים ל-CD4 המשמשים כתאי מטרה, כדי להבדיל בינם לבין תאי התורם. ראשית, נשקיע 4×10⁶ תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 על ידי סבב של 400 Gs למשך 10 דקות.
לאחר מכן, שטפו את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS והשעיו אותם מחדש. השעיו את התאים בשני מיליליטר של PBS, הוסיפו cell tracker orange עד לריכוז סופי של 1.5 micromolar והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למספר דקות. בסיום ההדגרה, הוסיפו שמונה מיליליטר של מצע גידול chica מלא וסובבו בצנטריפוגה ב- 400 Gs למשך 10 דקות.
שששוב את התאים בשלושה מיליליטרים של מצע גידול מלא המועשר ב-10 units per milliliter של IL two והנח באינקובטור לתרביות רקמה למשך הלילה. לאחר דגירה של לילה, תאי התורק ותאי המטרה מוכנים לניסוי העברה מתא לתא. לפני הקמת ניסוי ההעברה מתא לתא, הכן את תא ההדמיה כדי לבצור את הפלטפורמה מפני תנודות טמפרטורה בחדר.
כדי לחסום את תאורת הרקע בחדר, כיסוי שחור גדול מונח מעל כל מערך החימום של המיקרוסקופ, ובכך נוצר כיס אוויר מבודד סביב המערכת. תא הדמיות מוחזק בטמפרטורה יציבה של 37 degrees Celsius באמצעות מחמם תרמוסטטי עם קצה תרמוקפל מסוג T הממוקם לצד הדגימה לצורך משוב טמפרטורה. יש לחמם מראש למשך 30 דקות לפני התקנת הדגימה.
דימות קונפוקאלי בשיטת דיסק מסתובב באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך משמש ליצירת תמונות קונפוקאליות בתלת-ממד של מעבר HIV מתא לתא. כל החומרה והרכישה, כולל במה Z, נשלטות על ידי תוכנת IQ גרסה 1.8. הסריקה מבוצעת על ידי יחידה קונפוקאלית של דיסק מסתובב מדגם CS U 10, המשתמשת בו-סימולטנית ביותר מ-800 נקודות קונפוקאליות כדי להגביר משמעותית את קצב הסריקה ולהשלים את מהירותה. ה-CS U 10 מצומד למצלמת EMCCD (electron multiplying charged coupled device) בעלת רגישות גבוהה המאפשרת דימות מהיר בתנאי תאורה נמוכים, דבר המפחית הן פוטובליצ'ינג (photobleaching) והן פוטוטוקסיות.
מקור אור הפלואורסצנציה הוא לייזר גז ארגון-קריפטון יוני רב-אורכי גל. מסנן אופטי ניתן לכיוון מסוג And or Oko, או A OTF, משמש לבחירת אורכי הגל הרצויים, שהם במקרה זה 488 nanometers ו-568 nanometers, תוך בקרת העוצמה שלהם כדי להפחית עוד יותר פוטובליצ'ינג (photobleaching) ולהאריך את זמן הדימוי. ה-A OTF סוגר במהירות את הלייזר לאחר כל חשיפה של 15 עד 30 millisecond כאשר המצלמה אינה קולטת תמונות, ובכך מונעת חשיפה מיותרת בזמן שהתמונות מועברות ממצלמת ה-E-M-C-C-D למחשב.
אור הלייזר משולב במערכת הדיסקים המסתובבים באמצעות מראת דיכרואיקה רב-פס (quad band) של 405, 488, 568 ו-47 ננומטר. הפליטה הפלואורסצנטית מופרדת לפי אורך גל באמצעות מראת דיכרואיקה למעבר אור ארוך (long pass) של 560 ננומטר עם מפיל גומלין של תמונה (image splitter). הערוץ הירוק מסונן באמצעות מסנן מעבר פס (band pass) של 525/50 ננומטר והערוץ האדום מסונן באמצעות מסנן מעבר פס של 609/54 ננומטר. שני הערוצים מוקרנים זה לצד זה על גבי מצלמת ה-E-M-C-C-D.
בזמן שסדרת ההדמיה מתחממת, הכינו את התאים לניסוי העברה של תא לתא. השתמשו ב-hemocytometer כדי לספור את תאי ה-ette המבטאים את HIV gag IGFP. הניחו את ה-hemocytometer בתוך צלחת פטרי כדי למנוע חשיפה ישירה לתאים המבטאים את הווירוס.
שטפו את התאים במצע שאינו תלוי פחמן דו-חמצני והשעיקו אותם מחדש במצע לדימוי תאים חיים בריכוז של 1-3 × 10⁷ תאים למילליליטר. השימוש במצע שאינו תלוי פחמן דו-חמצני מבטל את הצורך בתא סביבתי עם פחמן דו-חמצני. לצורך דימוי.
יש לספור, לשטוף ולסבב מחדש את תאי ה-T הראשוניים המסומנים והחיוביים ל-CD4, כפי שהודגם עבור תאי ה-Jurkat. לאחר מכן, יש להתחיל בהעברה בין תאים: ערבב 20 µL של תאי Jurkat שעברו טרנספקציה של HIV gag-GFP עם 40 µL של תאי T ראשוניים מסומנים וחיוביים ל-CD4, והטען 50 µL לתוך תא מיקרו-EBD חדיר לגז שעבר טיפול לתרבית רקמות. יש לסגור את התא באמצעות פקקים ולהבטיח את קיבועם על ידי עטיפת הממשק בין הפקק לתא ה-EBD בפרפילם (Parafilm).
נגבו את תא ההדמיה באמצעות מטלית כימית ספוגה ב-70% ethanol והניחו לו להתייבש מעט באוויר בתוך המנדף. העבירו את תא ההדמיה האטום בתוך מכל אטום כדי למנוע חשיפה מקרית. במידה והתא הופל במהלך ההובלה, מיד לאחר טעינת תא ההדמיה של ה-IBD בתאים, הרכיבו את המכשיר על המיקרוסקופ.
דגמו תמונות של זוגות תאים באמצעות עדשת שמן עם הגברה של 60 x 1.42 NA, שכן המפתח המספרי הגבוה משפר משמעותית את הרזולוציה כדי למקסם את מהירות הרכישה של ערימות תמונות בתלת-מימד. חתכו את אזור ההקלטה של מצלמת ה-EM CD כך שיתמקד באזור המיידי של זוג התאים. בנוסף, קפיצת Z גדולה שבין 0.45 ל-0.75 micrometers עשויה לסייע בהגברת מהירות הרכישה בתנאים אלו.
תמונות מוקלטות באופן רציף במרווחי זמן של 20 עד 60 דקות. דימות חוזר של אותה נקודה בדגימה יכול להימשך עד שש שעות עם פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching) מינימלי בעת הרכישה. כל מקטע נתונים מורכב מעשרות אלפי תמונות שעשויות לתפוס נפח כולל של 5 עד 20 gigabytes.
כדי להקל על ההסעה והניתוח של הקבצים הגדולים, כל קובץ פועל לפי פירוק וייצוא כסגמנטים של קובצי תמונה בפורמט TIFF בנפח של ג'יגה-בייט אחד. כדי לנתח את התמונות שנרכשו, השתמשו באחת מתוכנות ניתוח התמונות השונות. עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף לפרטים על ניתוח התמונות, כולל תיקון דהייה של עוצמה (intensity bleach correction) ומעקב אוטומטי וידני של נקודות (puncta) של gag.
בתוך 10 עד 15 דקות מהערבוב, ניתן להבחין בתאי jerk cat המבטאים HIV gag IGFP נצמדים לתאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4 בדימות. באמצעות קומפלקסים אלו ניתן להעריך את תנועת נקודות ה-gag בתאים נגועים וכן בתאי מטרה. לאחר יצירת הסינפסה, בתוך 30 דקות עד שלוש שעות, ניתן להבחין בתנועה של נקודות gag IG FP אל תוך תאי מטרה המסומנים ב-cell tracker.
הראינו לכם כיצד להמחיש ויזואלית העברה של HIV מתא לתא בין תאי T. בעת ביצוע הליכים אלה, חשוב מאוד לזכור להקפיד על כל אמצעי הזהירות של רמת בטיחות ביולוגית 2+ או רמת בטיחות ביולוגית 3 בעת טיפול בדגימות שנחשפו לתאים המבטאים HIV. כמו כן, זכרו להשתמש בתאי JCA מתוחזקים היטב וב-DNA נקי מאנדוטוקסינים כדי למקסם את התעתוק.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
ניסוי חזותי זה מדגים את השימוש בשיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV לצורך דימוי קונפוקאלי של תאים חיים. הפרוצדורה מתמקדת בהדמיה של העברת HIV המסומן ב-GFP דרך סינפסות וירוסולוגיות בין תאי T מסוג Jurkat המבטאים HIV לבין תאי T ראשוניים שאינם נגועים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- וירולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- טכניקות של דימות תאים חיים הן חיוניות למחקר של העברה ויראלית.
- המנגנון של HIV להעברה מתא לתא הוא קריטי להבנת הפתוגנזה שלו.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של אינטראקציות תאיות.
- שיטות טרנספקציה משמשות להחדרת סמנים פלואורסצנטיים לתאים.
מטרת המחקר
- להדמיות של מעבר HIV בין תאי T.
- לניתוח הדינמיקה של העברת HIV דרך סינפסות וירוסים.
- לספק פרוטוקול למחקרים לצורך שחזור תהליך הדימוי.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאי T מסוג jerk CAT באמצעות שיבט HIV פלואורסצנטי מידבק.
- בידוד וסימון של תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית עם דיסק מסתובב לצורך הדמיה.
- ניתוח של נתוני הדמיה באמצעות כלי תוכנה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מעבר HIV המסומן ב-GFP.
- תצפית מפורטת על היווצרות סינפסה וירולוגית.
- ניתוח כמותי של יעילות מעבר HIV.
- תובנות לגבי מנגנוני ההעברה של HIV מתא לתא.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה לצפייה בהעברת HIV.
- הממצאים תורמים להבנת הפתוגנזה של HIV.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למחקרים נוספים בתהליכי הדבקה נגיפית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של מעבר HIV מתא לתא באמצעות שיבוטים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה קונפוקלית חיה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות אנטי-ויראליות, על ידי תצפית ישירה על דינמיקה של חלבונים ויראליים בסינפסים וירולוגיים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים באמצעות כימות יעילות ההעברה וזיהוי אינטראקציות מאחסן-פתוגן הקריטיות להתערבות טיפולית. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לסריקת מעכבי כניסה והרכבה, בהלימה לצרכי תיקוף מודלים פרה-קליניים במחקר הפתוגנזה של HIV.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ישירה על הובלת חלבון ה-Gag של HIV דרך סינפסות וירולוגיות, לצורך תיקוף השערות מכניסטיות לגבי העברה מתא לתא.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים של יעילות ההעברה הוויראלית לצורך הערכת מעורבות המטרה במערכות של סריקת מעכבים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתוני דימוי סטנדרטיים וניתנים לשחזור כדי לתמוך בפיתוח בדיקות עבור תרכובות החוסמות יצירת סינפסה נגיפית או מעבר חלבונים.
- ערך תפעולי: משתמש בתאים חדירים לגז ובקרת טמפרטורה יציבה כדי לאפשר דימוי חי ארוך טווח לצורך ניתוח קינטי של השפעות מעכבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה לבחינת הפתוגנזה של HIV בתאי T ראשוניים, ובכך תומך בהתאמת סמנים ביולוגיים לעיכוב ההדבקה.
- ערך תפעולי: מסייע בהמשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות ויזואליזציה של השפעות תרופות על התפשטות נגיפית במודלים של תאים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת תוצאות כמותיות המבוססות על ויזואליזציה של מעבר HIV, המנחות החלטות של go/no-go לגבי מעכבי חדירה והרכבה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של דינמיקה של חלבונים ויראליים ובבירור מסלולים בסינפסה הווירולוגית.
- סריקה: מספק מערכות ביולוגיות סטנדרטיות, מוכנות לבדיקה, עם תגי פלואורסצנציה להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מעקב מבוסס עוצמה של נקודות Gag וניתוח אוטומטי/ידני להשוואת שיעורי העברה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות שימוש בתאי T CD4+ ראשוניים ובתנאי דימוג רלוונטיים פיזיולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמת דימוג לשימוש חוזר למחקרי העברה ויראלית מתא לתא במגוון פתוגנים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהדבקה ב-HIV על ידי אספקת רזולוציה מרחבית-זמנית של תנועת חלבונים ויראליים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של טרנספקציה, סימון והכנת תאי בידוד.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go באמצעות אספקת ראיות ויזואליות ישירות למודולציה של המטרה בהפצה ויראלית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרופות אנטי-ויראליות מותאם סיכון, בהתבסס על עיכוב מוכח של מעבר מתא לתא במודלים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי תאים חיים, וירולוגיה ונהלי בטיחות ביולוגית ברמה 2+/3 לטיפול בתאים המבטאים HIV.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית עם דיסק מסתובב (spinning disc), מצלמת EM-CCD, כיוון לייזר ובקרה סביבתית לדימוי בטמפרטורה של 37°C.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של תהליכי הכנת תאים, סימון פלואורסצנטי וניתוח תמונות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי תאים שונים או למבנים ויראליים שונים, תוך שמירה על דיוק הוויזואליזציה של הסינפסים.
- מוגבל על ידי סיכוני פוטובליצ'ינג (הלבנה פוטוכימית) ופוטוטוקסיות במהלך דימוי ממושך, אשר מופחתו על ידי שימוש במצלמת EM-CCD בעוצמת אור נמוכה ובסגירת תריס הלייזר.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:55
Introduction
0:00
Title
1:26
Preparing the Donor (Jurkat) and Target (Primary) CD4+ T cells
3:47
Cleaning Up the Donor Cells and Labeling the Target Cells
12:02
Representative Images of Cell-to-cell Transfer of HIV
12:29
Conclusion
6:36
Monitor Cell-to-cell Transfer of HIV Gag-iGFP Using Live Cell Transfer
