Name: IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: למד את שיטת IP-FCM לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון תוך שימוש בחרוזים מצופים נוגדנים וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש ללא צורך בהנדסה גנטית או בדגימות גדולות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הנשרים פרס החדשנות (הוראת אחוות הנשרים) ועל ידי קרן מאיו.

** וידאו פרוטוקול זה מבוסס על פרסום משויך 1: רגישות גבוהה לזיהוי ניתוח כמותי של חלבונים אינטראקציות יליד מתחמי multiprotein ידי cytometry הזרימה. אדם ג'Schrum, דיאנה גיל, איליין פ Dopfer, דוד ל 'Wiest, לורנס א Turka, וולפגנג WA Schamel, אד פאלמר. STKE המדע של 2007 (389): pl2, 5 ביוני 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">אנא לחץ כאן כדי לראות פרסום זה</a> . טרם החל, הכן את הפתרונות הבאים במלאי מימיות: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> MES הצפת צימוד: </td><td> חנות של 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6.0 </td><td> 50 מ"מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> מרווה / חסימה / Storage (QBS) חוצץ: </td><td> חנות ב -4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> 0.02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM חוצץ: </td><td> חנות ב -4 ° C </td></tr><tr><td> טריס, pH 7.4 </td><td> 50 מ"מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 מ"מ </td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> 0.02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> הכן מיד לפני השימוש: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> להמיס 50 מ"ג / מ"ל ​​אבקה EDAC הצפת זיווגים MES </td></tr><tr><td> Digitonin פתרון (2% w / v): </td><td> ממיסים אבקת digitonin ב DH 2 O על ידי חימום ל 95 מעלות אז הקירור 5min על הקרח </td></tr><tr><td> תמוגה חוצץ: </td><td></td></tr><tr><td> טריס, pH 7.4 </td><td> 50 מ"מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 מ"מ </td></tr><tr><td> Digitonin פתרון </td><td> 1% </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז </td><td> 1x </td></tr><tr><td> שמור על הקרח </td><td></td></tr></tbody></table> 1. צימוד של MAB כדי חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של חרוזים מן המניות שנרכשו על ידי דילול ב PBS ועוד היד נטויה עם hemacytometer. התחל עם דילול 1:10000 של חרוזים עבור סופרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 18 x 10 6 חרוזים לתוך צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 2 עד 3 פעמים ב הצפת 0.5-1.0 זיווגים MES מ"ל, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הצפת 50 MES μL זיווגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת קבוצות carboxyl על החרוזים על ידי הוספת 20 μL של המוכן טרי EDAC-MES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות במשך 15 דקות במהירות של 25 ° C באופן ידני על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים מופעל 2 עד 3 פעמים ב 0.5-1.0 מ"ל PBS, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend החרוזים מופעל 50 PBS μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של MAB IP (בריכוז מ"ג / מ"ל ​​0.2-1.0 המלאי) לפתרון חרוז הופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 3 עד 4 שעות ב 25 ° C על ידי הנחת הצינור על שייקר רוטט. Shake מספיק כדי למנוע התיישבות של החרוזים על החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף MAB מצמידים חרוזים 2 עד 3 פעמים ב 0.5-1.0 מ"ל PBS, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הצפת 100 QBS μL. אלה יכולים להיות מאוחסנים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיית חרוזים היטב, לדלל 1:200-1:10,000 ב PBS ולספור עם hemacytometer. הריכוז חייב להיות נמדד עבור כל אצווה preparative, כך מספר חרוזים השתמשו בניסוי ה-IP או כל הנפתח ניתן לשלוט באופן מדויק. </li></ol> 2. פוסט גרעיני lysate הכנה Ip השיטה תמוגה ותנאי תמוגה האופטימלי יהיה תלוי בסוג התא חלבונים אינטראקציות נבדקות. מספר פרוטוקולים קיימים יכול להיות שונה עבור היישום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse 20 x 10 6 "קטן" תאים, כגון לימפוציטים, או 5 x 10 6 "גדול" תאים, כגון מקרופאגים או תאים סרטניים, במאגר תמוגה μL 100 טרי צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge עבור 20min על הקרח. סולם נפח תמוגה כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר גרעינים ופסולת הסלולר מסיסים, בצנטריפוגה lysate ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 x 10 x 5-2.5 10 5 מב-בשילוב חרוזים lysate הבהיר, pipetting בעדינות לתערובת. היקף מינימלי אנו משתמשים כדילבצע IP אחת היא 5 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על אנכי מסתובב 4 שעות גלגל לילה בחדר קר. הגדר מהירות מספיק כדי למנוע את החרוזים מן ההתיישבות. זה מקובל נוזלי של בנפח נמוך כתובות IP להישאר בתחתית הצינור במהלך סיבוב. </li></ol> 3. גשוש של חלבון ביד שנתפסו עם Fluorochrome-מצומדות נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים IP פעמיים ב mL 0.2-1.0 קר כקרח הצפת FCM, centrifuging ב g 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 100 μL μL הצפת ו aliquot 20 FCM לתוך כל חמש או יותר 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge או בארות צלחת ארובה התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף fluorochrome-מצומדות מבז על דגימות. בצע FCM את הכתם על פי ההוראות של היצרן או על פי ריכוזי נקבעים אמפירית. כנקודת מוצא, להוסיף 0.2-1 μL של פתרון נוגדן המניות (ב 0.2-1.0 מ"ג / מ"ל) לכל צינורית או היטב, דגירה 40 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נחקר חרוזים ב 1.5-מ"ל צינורות פעמיים בתוך מאגר 1.0 קר כקרח FCM מ"ל, centrifuging ב g 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאחר כל שטיפה. בעדינות להסיר את supernatant אחרי כל שטיפה, נזהרת שלא להפריע את החרוזים. עבור צלחת ארובה התחתונה, לשטוף פעמיים עם 0.2 מ"ל קר כקרח הצפת FCM, centrifuging ב 1000g במשך 5 דקות ב 4 ° C אחרי כל שטיפה. Pipettor רב שימושית בשלב זה. כדי להסיר supernatant מן החרוזים בצלחת ארובה התחתונה, "קפיצי" הצלחת פעם אחת, ואז, בעודו הפוך, כתם כל נוטף מקצות את הבארות. נפח שיורית היטב כל, המכיל את החרוזים, יהיה כ - 20 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הצפת 200 FCM μL לדגימה. העברה צינורות FACS שכותרתו. דוגמאות מוכנים כעת עבור FCM. </li></ol> 4. FCM רכישה חרוזים CML המתואר בפרוטוקול זה 3-5 מיקרומטר קוטר, כמחצית קוטר של לימפוציטים עכבר שקט. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את פיזור ידני קדימה (FSC) לזכות המגבר ואת פיזור לוואי (SSC) מתח כדי האוכלוסייה של אירועים חרוז לרשום על סולם. חרוזים IP הפרט צריך להקים האוכלוסייה באשכולות הדוקה אחת. הגדרות והשער צריך להיות כוללים כפילויות חרוז ופסולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני חרוזים ריצה או סטנדרטים חרוז, להסיר את הבלימה אגל שרוול העוטף את כניסת מדגם על cytometers כמה. אפשר נוזל נדן לטפטף בין הדגימות, כמו זו תנקה את כניסת ולמנוע חרוזים מלהיות נישא על מדגם אחד למשנהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חרוזים ללא תווית, פקד השליליות של הקרינה, וחלקיקים Rainbow כיול (RCPs), שליטה חיובית של הקרינה, כדי להתאים את ההגדרות כך ששני הקצוות הקרינה שלילי וחיובי להופיע בו זמנית על ציר ה-x יומן בקנה מידה. הדבר מבטיח כי הקרינה מן דגימות הניסוי יהיה גם על הסולם. שים לב RCPs הם קטנים יותר מאשר את החרוזים CML, כך FSC ופרמטרים SSC, כמו גם עמדת השער, ייתכן שיהיה צורך לשנות באופן זמני עבור מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור ללא תווית, חרוז הגדרות כיול פעם עם RCPs תושלם. אם רק אחד פלורסנט בדיקה לדגימה משמש, שום פיצוי הקרינה הוא הכרחי. באופן כללי, אנו בדיקה מתחמי multiprotein עם אחד fluorochrome-מצומדות MAB לדגימה FCM, ואנחנו בוחנים שותפים אינטראקציה מרובים מכתים דגימות חרוז במקביל מבז ספציפית עבור יחידות משנה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת ולשמור הקרינה קבצי הנתונים. ניתוח יכול להתבצע באמצעות זרימת cytometry תוכנה כגון CellQuest, FlowJo, או CFlow. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. IP-FCM מורכבים TCR/CD3 multiprotein. בתאי T מהלחץ עכבר BALB / c היו lysed digitonin ב 1%, ואת lysate היה נתון IP-FCM באמצעות אנטי CD3ε חרוזים. מתחמי שנתפסו הכילו כמויות משמעותיות של TCR-β (אזור סגול) ושיתוף הקשורים CD3-ε (ירוק), אך קרוב לרמות הרקע (שהוגדר על ידי החללית אימונוגלובולינים רלוונטי, ורוד זכר) של חלבונים אחרים כגון Thy1.2, CD45, או H-2K (ד) (חום, כתום, כחול עקבות, בהתאמה). ראה תוצאות דומות שפורסמו בעבר 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

מידע על חלבונים אינטראקציות רלוונטי במיוחד בניתוח של תהליכים תאיים רבים כגון התמרה האות, התבגרות השושלת, תא מחזור התקדמות, ומפלים אפופטוזיס. IP-FCM מספק דרך מהירה, כמותית, ורגיש כדי לבחון את האינטראקציה של חלבונים להגדיר חברי מתחמי multiprotein ב קונפורמציה האם שלהם. יכול להיות בשילוב חרוזים ו מודגרות עם lysates תא יום אחד יכול להיות נחקר ונותחו למחרת. תבנית 96, גם צלחת מאפשר מספר גדול של דגימות כדי להיות מנותח בו זמנית כדי לספק יעילות איסוף נתונים למטרות סטטיסטיות או ההקרנה. שימוש בסטנדרטים חרוז ניאון, מספר חלבונים שנתפסו על ידי כל חרוז ניתן להעריך. מקור החומר מעט מאוד צורך ללכוד זיהוי, כך דגימות מוגבל analytes נדיר עדיין יכול להיות מנותח עבור אינטראקציות מרובות. למרות IP-FCM אינו מחייב הנדסה גנטית, epitope תיוג, denaturation, או חוץ גופית ערבוב של חלבונים בסביבה לא פיזיולוגיים, זה יכול להיות יחד עם אלה וטכניקות אחרות, מה שהופך אותו כלי רב ערך ונגיש עם תחולה ל מערכות ביולוגיות רבות. פתרון בעיות: רבים IP-FCM ניסויים ליצור אינטראקציה מועילה נתונים חלבון הפעם הראשונה שהם ניסו. עם זאת, אופטימיזציה של FCM-IP יכולה לשפר נטיה נוגדנים חרוזים, ללכוד חלבון מורכב, מחייב בדיקה ניאון. היעילות של נטיה נוגדן ה-IP ניתן לקבוע על ידי חיטוט בשילוב חרוזים ישירות עם נוגדנים נגד אימונוגלובולינים. אם יעילות זו היא נמוכה, להגדיל את הריכוז של נוגדנים במהלך התגובה צימוד יכולים להרשות נוגדנים IP יותר לצרף כל חרוז. זה יכול להגדיל את קיבולת המחייב של אצווה חרוז IP, וכתוצאה מכך ללכוד זיהוי משופרת של analytes. אחרים ראשוני אמין מולקולות המכילות (למשל טריס, שור אלבומין) לא צריך להיות נוכח במהלך התגובה צימוד, כמו אלה יכולים להתחרות עבור MAB מצורף חרוז לגרום צימוד נמוך מב. אם נטיה של MAB כדי חרוזים מוכיח בעייתית מסיבות אחרות, חרוזים יכול להיות במקום מצמידים את avidin / streptavidin, ונוגדנים biotinylated יכול להיות לאחר מכן לא קוולנטית כבול המשמש immunprecipitation. למרות נטיה נוגדן טוב, זיהוי ראשוני של הקרינה חרוז הקשורים עלולה להיות נמוכה. לכידת ראשית, מורכב כשלעצמו עשוי להיות נמוך. מכיוון IP-FCM תלויה בריכוז של analytes, להגדיל את מספר התאים lysed לכל יחידת נפח תמוגה יכולים להגדיל ללכוד זיהוי אנליטי ו. בנוסף, ללכוד יכול להיות משופרת על ידי הפחתת מספר חרוזים IP מודגרות עם lysate, אשר מפיצה את מתחמי שנתפסו ברחבי חרוזים פחות, וכתוצאה מכך הקרינה הממוצעת עלתה ל חרוז כאשר נחקר. שנית, יתכן כי גישה של הנוגדן בדיקה של מתחמי שנתפסו מתעכבת sterically על ידי הנוגדן immunoprecipitating. במקרה זה, הבעיה ניתן לטפל באמצעות נוגדנים שונים כדי ללכוד ו / או בדיקה.

<table><tbody><tr><td>חרוזי לטקס פוליסטירן ממודפים בקבוצת קרבוקסילט (CML) (5mm ללא חומר פעיל שטח)</td><td>ריאגנט</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>יש להוסיף ב-4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>חלקיקי כיול רב-צבעיים (Rainbow Calibration Particles)</td><td>ריאגנט</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>יש להוסיף ב-4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>יש להוסיף ב-20&amp;#x00B0;C- בתנאי ייבוש.</td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז לשימוש כללי, המכילה AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, ו-Leupeptin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>יש להכין תמיסת מלאי 100x ב-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. יש לחלק לאליקוטים ולאחסן ב-20&amp;#x00B0;C-. יש לטפל עם כפפות.</td></tr><tr><td>פלטות PCR, 96 בארות 0.2mL, טבעיות, קמין גבוה</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>לשימוש במקום מבחנות מיקרו-צנטריפוגה במהלך צביעת FCM</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation זוהה על ידי cytometry זרימה (IP-FCM) הוא שיטה יעילה לגילוי וכימות חלבונים אינטראקציות. העיקרון הבסיסי משתרע של כריך ELISA, שבה אנליטי העיקרי בשבי ניתן לאתר יחד עם מולקולות אחרות הקשורות פיזית בתוך מתחמי multiprotein. ההליך כרוך צימוד קוולנטי של microbeads לטקס קלקר עם immunoprecipitating נוגדנים חד שבטיים (מב) ספציפיים לחלבון של עניין, דוגרים אלה חרוזים עם lysates תא, חיטוט קומפלקסים חלבונים שנתפסו עם fluorochrome-מצומדות בדיקות, וניתוח חרוז הקשורים הקרינה על ידי cytometry הזרימה. IP-FCM הוא רגיש ביותר, מאפשר ניתוח של חלבונים במצב הטבעי שלהם (לא מפוגל), וכן ניתנת לניתוח או חצי כמותי או כמותי. כפי יתרונות נוספים, IP-FCM לא דורש הנדסה גנטית או ציוד מיוחד, מלבד cytometer זרימה, וזה ניתן להתאים בקלות עבור תפוקה גבוהה יישומים.

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

אימונו-פרסיפיטציה המזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה (IP-FCM) היא שיטה יעילה לזיהוי וכימות של אינטראקציות בין חלבונים. ה...

בניסויי IP FCM, קומפלקסים של חלבונים נלכדים על חרוצים במטרה לזהות ולחקור את החלבונים השונים המקיימים אינטראקציה ביניהם. ראשית, נוגדן המשקיע חיסונית (immunoprecipitating antibody) הספציפי לחלבון הנחקר מקושר קוולנטית לחרוצי לטקס פוליסטירן. כשלב שני, חרוצים אלו מדגירים עם ליזאטים של תאים, מה שמאפשר לחלבון הספציפי ולחלבונים המקיימים איתו אינטראקציה להיקשר לחרוצים.החרוזים יחד עם החלבונים שנלכדו נשטפים ולאחר מכן נסמנים עם נוגדים מסומנים פלואורסצנטית הספציפיים למולקולות שונות שעשויות להיות קשורות לחלבון שעבר אימונו-פרסיפיטציה. לבסוף, החרוזים המסומנים פלואורסצנטית נסרקים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע אילו חלבונים נוכחים ואילו חסרים בקומפלקסים שנלכדו. היתרונות של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון אימונו-פרסיפיטציה ולאחריה וסטן-בלוטינג, הם היכולת של I-P-F-C-M לאפשר הערכה של אינטראקציות חלבון-חלבון במצבם הטבעי ללא צורך בהנדסה גנטית או בגדלי דגימה גדולים.שיטת I-P-F-C-M יכולה להניב יחס אות לרעש גבוה גם כאשר זמין כמות קטנה מאוד של חומר ביולוגי לניתוח, שכן ניתן לבצעה עם נפחים קטנים וריכוזים נמוכים של אנליטים. כדי להתחיל בהליך זה, הכין את התמיסות הבאות: תמיסת MES לצימוד, תמיסת כיבוי חסימה לאחסון, המקוצרת כ-QBS, ותמיסה לציטומטריית זרימה או תמיסת FCM. קבע את ריכוז חרוזי הלטקס מפוליסטירן המשומשים במודפי קרבוקסילאט, או חרוזי CML, על ידי דילול ב-PBS וספירה באמצעות המוציטומטר.לאחר קביעת ריכוז החרוזים, העבירו בעזרת פיפטה 18 × 10⁶ חרוזים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter. שטפו את החרוזים שתיים עד שלוש פעמים ב-0.5 עד 1 milliliter של MES coupling buffer באמצעות צנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בצעו זאת לאחר כל שטיפה בעוד החרוזים נמצאים בצנטריפוגה.הכינו תמיפת MES buffer עם e dac טרייה לשימוש בהפעלה של החרוזיים. עם סיום השטיפות, שמרו את התמיפה בטמפרטורת החדר או על קרח. לאחר השטיפה האחרונה, השעו את החרוזיים ב-50 µL של תמיפת הקישור MES coupling buffer.לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של EEC MES לתשועת החרוצים. כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל שעל החרוצים, ערבבו בעדינות בטמפרטורת החדר באמצעות פיפוט ידני רצוף למעלה ולמטה במשך 15 דקות. למרות ששלב זה דורש עבודה מאומצת, שיטת ערבוב זו נותנת את התוצאות הטובות ביותר לאחר הערבוב.שטפו את החרוזיים המופעלים פעמיים עד שלוש פעמים ב-0.5 עד 1 מיליליטר של PBS באמצעות Centrifusion ב-20,000 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר כל שטיפה, ולאחר השטיפה הסופית, השעו שוב את החרוזיים המופעלים ב-50 µL של PBS כדי להצמיד את הנוגדן של ה-IP לחרוזיים. הוסיפו 50 µL של הנוגדן המונוקלונאלי של ה-IP מריכוז מלאי שבין 0.2 ל-1 mg/mL.ודאו שאין נוכחות של מולקולות המכילות אמין ראשוני מלבד הנוגדן. מולקולות המכילות אמין אלו, כגון tris או bovine serum albumin, מתחרות עם הנוגדן על הקישור לחרוזים. ערבבו את תרחיף הנוגדן והחרוזים על שייקר רוטט למשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר.נערו מספיק כדי למנוע שקיעה של החרוצים בתחתית המבחנה. לאחר הקישור, שטפו את חרוצי ה-antibody cod שתיים עד שלוש פעמים ב-0.5 עד 1 מיליליטר של PBS על ידי צנטריפוגה ב-20,000 ×g.המתנה לשקיעה בכוח הכבידה למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר לאחר כל שטיפה. לבסוף, השעה מחדש את החרוזים ב-100 microliters של תמיסת QBS. ניתן לבדוק את הקישור של נוגדנים מונוקלוונליים לחרוזי CML על ידי צביעת החרוזים בנוגדנים המש conjugated פלואורסצנטים נגד IgG.בעקבות ניתוח FCM, ניתן לאחסן את החרוזיים המצופים בנוגדן החד-שבתי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בניסוי IP. ראשית, השעו את החרוזיים היטב בדילול של 1:200 עד 1:10,000 ב-PBS וספרו אותם באמצעות המוציטומטר (hemocytometer). יש למדוד את הריכוז עבור כל סדרת הכנה, כדי שניתן יהיה לשלוט במדויק במספר החרוזיים המשמשים בכל ניסוי IP.בשלב הבא, הכין תמיסת dig טרייה במים בריכוז של 2% משקל לנפח. חמם ל-95 degrees Celsius למשך חמש דקות. לאחר מכן קרר על קרח.דללו, המסו בריכוז של 1% weight per volume בבופר ליזיס שהוכן טרי, ושמרו על קרח. קבעו את מספר התאים לליזיס באמצעות הטבלה המוצגת כקו מנחה. עם זאת, מספר התאים הנדרש תלוי בחלבון הנבדק ויש לקבעו באופן אמפירי.כאן נעשה שימוש ב-30 $\times$ 10⁶ תאים משורת תאי גידול לימפוקיטיים קטנים. העבירו את הנפח הנדרש של תרחיף התאים לפרועת צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. השקיעו את התאים ב-20,000 $\times$g.סבב בcenterY (Gravity) למשך 30 שניות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ושאיפה של המצע. הוסף את הכמות המתאימה של בופר ליזיס (lysis buffer) שהוכן טרי למשקע, וערבב בעדינות על ידי פיפוט למעלה ולמטה.לאחר מכן, השאירו את התאים להשכבה למשך 20 דקות על קרח. שימו לב כי בהתאם לסוג התא ולאינטראקציות בין החלבונים הנלמדות, תנאי ליזיס התאים עשויים להשתנות ויש לקבוע אותם באופן אמפירי כדי לוודא שהליזיס הושלם. הסירו את הגרעינים ואת השאריות התאיות הבלתי מסיסות על ידי סבב צנטריפוגה של הליזאט ב-20,000 ×g.הפסידו בכבידה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. שמרו על ה-SNA והשליכו את המשקע כדי לקשור את חלבון המטרה לחרוזי הציפוי באנטי-גוף. הוסיפו בעזרת פיפטור עדין 50,000 עד 250,000 חרוזים המשורשרים לאנטי-גוף מונוקלונלי לליזאט המזוקק.הנפח המינימלי של ליזאט המשמש עבור IP בודד הוא 5 µL. יש להניח את הליזאט המזוכל ותערובת החרוזיים על גלגל סיבוב אנכי למשך ארבע שעות או למשך הלילה בחדר קירור, במהירות מספקת למניעת שקיעת החרוזים לתחתית; הנוזל עשוי להישאר בתחתית המבחנה במהלך הסיבוב. לאחר קישור חלבון המטרה לנוגדן ה-IP.המשיכו לסימון פלואורסצנטי של הקומפלקס האימונולוגי. שטפו את חרוזי ה-IP פעמיים במילליטר אחד של באפר FCM קר, על ידי סבב צנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר כל שטיפה, השעו את החרוזים ב-100 µL של באפר FCM וחלקו 20 µL לכל אחד מחמישה מבחנות או יותר.מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר או באריות של פלטה בעלת תחתית קונית (chimney bottom plate). שניהם מוצגים כאן. הוסיפו לדגימות נוגדנים מונוקלונליים המשורשרים לפלואורוכרום.בצע את צביעת ה-FCM לפי הוראות הספק או בהתאם לריכוזים שנקבעו באופן אמפירי כנקודת התחלה. הוסף 0.2 עד מיקרוליטר אחד של תמיסת נוגדן מלאי בריכוז של לפחות 0.1 milligrams per milliliter לכל מבחנה או באר, והדגר למשך 40 דקות על קרח. שטוף את החרו지를 שעברו סריקה במבחנות של 1.5 milliliter פעמיים עם מיליליטר אחד של תמיסה קרה במיוחד.בופר FCM, צנטריפוגה ב-20,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות. לאחר כל שטיפה, הסירו בעדינות את supernatant, תוך הקפדה שלא להפריע לחריסות.לחלופין, עבור chimney, שטפו את הלוח התחתון פעמיים עם 0.2 milliliters של FCM buffer קר מאוד, תוך סבוב בצנטריפוגה ב-1000 times gravity למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר כל שטיפה, לאחר כל שטיפה. כדי להסיר את העילוי מהחרוזים, נקו את הלוח פעם אחת ואז, בעודו הפוך, ספגו כל טפטוף משולי הבארות.הנפח הנותר בכל באר המכילה את החרוצים יהיה כ-20 µL. השהה את החרוצים ב-200 µL של באפר FCM לדגימה, והעבר אותם למבחנות fax מסומנות. הדגימות מוכנות כעת לביצוע ציטומטריית זרימה או FCM במכשירי Becton Dickens וסייטומטרים אחרים.הסיר את שרוול הכילת של הטיפה שעשוי להקיף את כניסת הדגימה או את ה-sip. אפשר מה-sip לטפטף בין דגימות, שכן הדבר ימנע מעבר של חרוזים מדגימה אחת לשנייה. חרוזי ה-CML המשמשים כאן הם בעלי קוטר של שלושה עד חמישה מיקרומטרים, בערך מחצית מהקוטר של לימפוציט עכבר שאינו פעיל.לכן, ייתכן שיהיה צורך להגביר ידנית את הגבר (gain) של ה-forward scatter ואת המתח של ה-side scatter כדי שאוכלוסיית חלקיקי ה-beads תירשם בציטומטר; כאן, פעולה זו מבוצעת באמצעות beads לא מסומנים או ריקים. הגדרות ה-gait מכווננות כדי להוציא bead, doublets ו-abri לפני הקריאה.דגימות ניסוייות מבטיחות שהפלוורסצנציה תהיה בטווח המדידה. חרוזיים לא מסומנים משמשים כביקורת שלילית לפלוורסצנציה, וחלקיקי כיול רב-צבעיים (RCPs) יכולים לשמש כביקורת חיובית לפלוורסצנציה. מכיוון ש-RCPs קטנים יותר מחרוזי CML, ייתכן שיהיה צורך לשנות זמנית את פרמטרי הפיזור קדימה (forward scatter) והפיזור הצידי (side scatter), כמו גם את מיקום השער (gate position), עבור דגימה זו.לאחר כיולים אלו, קיצוני הפלואורסצנציה השליליים והחיוביים מוצגים על ציר לוגריתמי. ברגע שהכיול עם ה-RCPs הושלם, חזרו להגדרות של חרוזים לא מסומנים עבור פיזור קדמי וצדי (forward and side scatter). כל עוד נעשה שימוש בגשש פלואורסצנטי אחד בלבד לדגימה, כפי שקורה בניסוי המוצג כאן, אין צורך בפיצוי פלואורסצנציה.כעת רכשו ושמרו את קבצי נתוני הפלואורסצנציה; הניתוח יבוצע לאחר מכן באמצעות תוכנה לציטומטריית זרימה כגון Cell Quest או FlowJo. כאן מוצגת התוצאה של ניתוח IP FCM של תאי T של עכבר ב-1% digitonin. קומפלקס החלבונים הלא-חלבונים של TCR CD3 נמשך באמצעות חרוזי anti-CD3 epsilon.הקומפלקסים שנלכדו מכילים כמויות משמעותיות של TCR beta ו-CD three epsilon המשויך אליו. רמות קרובות לרמות הרקע של חלבונים אחרים זוהו, כפי שנקבע באמצעות שימוש בגשוש (probe) של immunoglobulin לא רלוונטי או בנוגדנים נגד החלבונים TH 1.2, CD 45 או H two KD. היתרונות של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון immunoprecipitation ולאחריה western blotting, הם היכולת של I-P-F-C-M לאפשר הערכה של אינטראקציות בין חלבונים במצבם הטבעי ללא צורך בהנדסה גנטית או בדגימות גדולות. I-P-F-C-M יכול להניב יחסי אות-לרעש גבוהים אפילו כאשר זמין מעט מאוד חומר ביולוגי לניתוח, מכיוון שניתן לבצעו עם נפחים קטנים וריכוזים נמוכים של אנליטים.

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את חלקם של תאי T רוצחים הנגרמים על ידי ציטוקינים, תאי CIK, שהורחבו מתרבית תאים חד-גרעיניים היקפית בדם.

זיהוי סמן CD של תאי הרג המושרים על ידי ציטוקינים אנושיים על ידי ציטומטריה של זרימה

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

זרם איגוד הסלולר מבוססי cytometry assay מתואר זה משמש בעיקר ככלי מיון כדי לזהות תרכובות המעכבות את הכריכה של ליגנד כימוקין CXC fluorescently שכותרתו 12 (CXCL12) לקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4).

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4

מאמר זה מתאר שיטה לניתוח תוכן תא החיסון של רקמת שומן על ידי בידוד של תאים חיסוניים של רקמת שומן וניתוח עוקבות באמצעות cytometry זרימה.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

הדמיה cytometry זרימה מספקת גישה אידיאלי כדי לזהות את שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של תאים ברמות הפרט והן populational. הפונקציה endocytic שיבשו למצגת אנטיגן השומנים ב החשופים מזהם את האדם תאים דנדריטים הודגם עם transcriptomic בשילוב פרופיל של ביטוי גנים, הפגנה מורפולוגי של חלבון סחר בבני אדם.

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

זיהוי מיקרוגליה (MG) ומקרופאגים חודרים היקפיים (Mø) בחוט השדרה הפגועים הוא קשה. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בזרימה ציטומטרית (FCM) לזיהוי MG דמוי M1, MG דמוי M2, M1 דמוי Mø ו-M2 דמוי Mø, בהתאמה. ניתן ליישם טכנולוגיה זו גם על מחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית כדי להבין את תפקידם של MG ו-Mø.

זיהוי מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים היקפיים בחוט השדרה הפגוע באמצעות ציטומטריית זרימה

למד את שיטת IP-FCM לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון תוך שימוש בחרוזים מצופים נוגדנים וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש ללא צורך בהנדסה גנטית או בדגימות גדולות.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

גלה סרטונים נוספים