אטריה ו בדיקות Capellini טיפול: מדדים כמותיים פשוט פונקציה של מיומנות בכפו אצל חולדות ועכברים
21 ביולי 2010
אטריה ו בדיקות Capellini טיפול מיומנות בכפו לנצל את הנטייה הטבעית של מכרסמים לתפעל פריטי מזון באמצעות בכפו מיומן ותנועות ספרות. בעלי חיים הם צילמו בזמן הטיפול גדילים קצרים של פסטה יבשה מבושלת. השמעת וידאו בהילוך איטי מאפשרת כימות של התאמות בכפו.
סרטון זה מדגים הליך לכימות ליקויים במיומנות מוטורית עדינה בזמן טיפול במזון. במכרסמים, כל בעל חיים נחשף למקטעים קצרים של פסטה לא מבושלת, תחילה בכלוב הבית ולאחר מכן בסביבת הבדיקה. בסביבת הבדיקה, תנועות ה-fopo של בעל החיים מוקלטות בווידאו. במהלך אכילת הפסטה, ההתאמות המבוצעות עם כל fopo מזוהות ונספרות במהלך השמעת הווידאו בהילוך איטי.
במהלך ניתוח הווידאו, מזוהים דפוסי התנהגות אתיפיים בטיפול באוכל. התוצאות המזוהות מראות שינויים בארבעה מדדי זריזות לקויה לאחר פגיעה מוחית או במהלך ההזדקנות, וזאת באמצעות כימות התנועות המשמשות למניפולציה של מזון בזמן האכילה. שלום, אני קלי טנט מהמעבדה של תרזה ג'ונס במחלקה לפסיכולוגיה באוניברסיטת טקסס באוסטין, ואני RNAi, גם אני מהמעבדה של ג'ונס.
היום נציג בפניכם פרוצדורות למבחן הטיפול בורמיצ'לי (Vermicelli Handling Test) בחולדות ומבחן הטיפול ב-CAPI בעכברים. אנו משתמשים בפרוצדורות אלו במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד משתנה השימוש בארבעת ה-P של דקסטר (Dexter's four P) במהלך הטיפול במזון, לאחר נזק מוחי או במהלך ההזדקנות. אז בואו נתחיל.
כדי להכין את חתיכות הפסטה לבדיקה, השתמשו בטוש בעל חוד דק במיוחד כדי לסמן פסטה מסוג vermicelli מהמותגים DeCheco, CAPI ו-Skinner במרווחים ספציפיים באמצעות תבנית מקרטון. עבור capal, השתמשו במרווחים של 0.86 centimeter, ועבור vermicelli השתמשו במרווחים של 1.75 centimeter. פעולה זו מקלה על ויזואליזציה של תנועת גדיל הפסטה.
במהלך ההכנה, השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך את הקאפי לאורכים של 2.6 centimeter לשימוש עם עכברים, ועבור חולדות חתכו ורמישלי לאורכים של שבעה centimeter. מכיוון שמותגי פסטה נחלקים במרקם ובקוטר, דבר שעלול להשפיע על אופן הטיפול, מומלץ להשתמש במקור פסטה יחיד לבדיקות חוזרות. כדי להתגבר על תגובות נאופוביות ולבסס מיומנות בטיפול, חשפו את בעלי החיים לחתיכות הפסטה בכלוב הבית שלהם בשבועות שלפני הבדיקה. חשיפה של חמישה עד 10 ימים, עם כארבעה חלקים לבעל חיים בכל פעם, היא מספיקה.
גם בעלי חיים שהתרגלו לסביבה עלולים להסס לאכול בנוכחות המצלמה. מסיבה זו, מקמו את המצלמה מול אזור הבדיקה במהלך מפגש אחד או יותר של הסתגלות. לאחר שבעלי החיים נחשפו לחתיכות הפסטה, מקמו אותם בסביבת הבדיקה והרגילו אותם לאכול שם.
בדרך כלל, בעלי החיים אוכלים את הפסטה בקלות בסביבה זו. לאחר שלושה עד חמישה מפגשי האכלה שבהם ההכנות הושלמו, נראה כיצד לבצע ניסויי טיפול בפסטה בחולדות ועכברים. מפגשי הבדיקה מורכבים מניסויים עוקבים שבהם נאכלת יחידת פסטה אחת בכל ניסוי.
מפגש מורכב בדרך כלל מארבעה עד חמישה ניסיונות לכל חולדה ושלושה עד ארבעה ניסיונות לכל עכבר. חולדות יושבות בדרך כלל זקוף על רגליהן האחוריות כדי לאכול פסטה, והמשיכות נצפות ביתר קלות. כאשר המצלמה ממוקמת בערך בגובה רצפת התא ובזווית קלה כלפי מעלה, עכברים נוטים להישפף קדימה ולהחזיק את הפסטה בזווית.
לפיכך, תא בדיקה בעל רצפה פתוחה מונח על גבי מראה. המצלמה ממוקמת בגובה מעט גבוה יותר מהרצפה ומוטה כלפי מטה כדי להתמקד בהשתקפות הכפות במראה. לפני תחילת צילום הווידאו, יש להניח פיסת פסטה בתוך תא הבדיקה.
כדי להתניע את האכילה ולהביא את בעל החיים למבט מצלמה מתאים, על בעל החיים להיות פונה למצלמה והמצלמה חייבת להיות בזום מספיק של 10 עד 12 x. כדי לצפות בהתאמות בדיוק בשתי כפות הרגליים ובכל האצבעות, פרקי שתי כפות הרגליים צריכים להיות גלויים ברגע שבעל החיים והמצלמה והמיקום מתחילים את ההפלה הראשונה של הניסוי, או יש לתלות פיסת פסטה ישירות מול בעל החיים ולהתחיל בהקלטה. לפני תחילת האכילה, ניתן לשמוע כל נשיכה מפיסת הפסטה.
לפיכך, הקלטה קולית היא כלי יעיל לאימות האכילה. המשיכו בניסיונות שנותרו. באופן דומה, מומלץ לצמצם ככל האפשר את ההמתנה בין הניסיונות כדי שהבעלי החיים לא יתרחקו ממיקום הצפייה האופטימלי.
כעת נראה כיצד לבצע ניתוח וידאו כמותי של ארבע התאמות לקויות וזמן אכילה. ניתוח של ארבע התאמות לקויות במהלך האכילה הוא מדד כמותי פשוט הרגיש לליקויים לטרליים לאחר פגיעה ב-CNS בחולדות ולשינויים תלויי גיל בעכברים. במהלך הניתוח, מהירות השמעה של הווידאו מואטת לכ-50% מהזמן האמיתי, או שנעשה שימוש בהתקדמות פריים אחר פריים לפי הצורך כדי לזהות התאמות. החלק הכמותי של הניסוי מתחיל כאשר פיסת הבצק מונחת לראשונה בפה ומסתיים כאשר החלק האחרון של הבצק משתחרר מהפיסות ונעלם לתוך הפה.
התאמה נספרת בכל פעם שהנקב משתחרר וחוזר למגע עם החלק הקודם. כאשר ישנו חידוש של אחיזת הנקב, או כאשר קיימת פלקסיה של הרחבה או אבדוקציה, אבדוקציה של האצבעות, כל התאמה נרשמת בנפרד עבור הנקב השמאלי והימני. התאמות אינן נספרות כאשר הנקב מחליק על פני היצירה ללא תנועה של האצבעות או מיקום מחדש של האחיזה.
תנועות של הפה כאשר הוא אינו במגע עם חתיכת המאכל אינן נספרות גם הן. זמן האכילה נרשם עבור כל ניסוי, החל מהתחלת הפעולה ועד לרגע שבו חתיכת המאכל נעלמת לתוך הפה. אם בעל החיים מפסיק לאכול אך ממשיך להחזיק בחתיכה, זמן ההפסקה מופחת מהזמן הכולל; אם התהליך אינו רציף, הניסוי מושמט מהניתוח.
אם במהלך כל חלק מהאכילה, המבט על ההפסקה נחסם או אם בעל החיים שבר את החתיכה, מכיוון שחתיכות קצרות יותר משנות את דפוסי הטיפול, עכברים מפילו לעיתים את הפסטה במהלך האכילה ולאחר הפסקה קצרה, מרים אותה ומחדשים באכילה. הדבר עשוי לנבוע מהסחת דעת או משובעיות חלקית. אם האכילה מתחדשת במהירות, איננו פוסלים ניסויים אלו, אלא מחסירים את הזמן שבו החתיכות נפלו מזמן האכילה הכולל.
המדידות שהתקבלו מניתוח הווידאו הן מספר ההתאמות הממוצע לנקב, ליחידה, זמן האכילה הממוצע ליחידה, וקצב ההתאמות. כעת נבחן מספר דפוסי טיפול שאינם טיפוסיים. דפוסי טיפול שאינם טיפוסיים יכולים להבדיל בין סוגים שונים של פגיעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ולחשוף שינויים הקשורים לגיל.
תיעוד התנהגויות אלו שימושי כניתוח משלים. בעלי חיים שלמים מתחילים בדרך כלל לאכול כאשר קצה אחד של הפסטה נמצא נמוך יותר והקצה השני קרוב לפה. ה-POS תופסים בדרך כלל את אותן עמדות בכל הניסויים.
בהתנהגות לא טיפוסית, בעל החיים עשוי להחליף את מיקומם של שני הגפיים. במהלך האכילה בבעלי חיים תקינים, הפורות נעות למספרים סימטריים יותר זה לצד זה, או עם אצבעות מפרידות כאשר החתיכה קצרה מאוד. חלק מהבעלי חיים עם פגיעות ב-CNS לא יצליחו לעשות זאת, ובמקום זאת ימיקמו את המוטות יחד באחיזה סימטרית כאשר החתיכות היו ארוכות.
שני התנהגויות לא טיפוסיים נוספים בחולדות ועכברים הם אי-מגע עם חלק הפסטה דרך נקב אחד למשך זמן ממושך במהלך האכילה, ושימוש בפה כדי למשוך את הפסטה דרך הנקבים לצורך מיקום מחדש שלהם. חלק מההתנהגויות נחשבות לבלתי טיפוסיות עבור חולדות, אך טיפוסיות עבור עכברים, כגון תנוחת גב קמור והפלת הפסטה לאחר תחילת האכילה. עם זאת, שכיחות ההפלות בעכברים עשויה לעלות לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית (CNS), ולכן מומלץ לתעד את שכיחות ההפלות בשני המינים.
עכברים מבוגרים מבצעים לעיתים קרובות התאמות שאינן גורמות להתקדמות הפסטה. פעולה זו נספרת בכל פעם שהתאמה נכשלת בבירור בלהוביל לתנועה ניתנת לזיהוי של הפסטה לתוך הפה. כעת נציג מספר תוצאות מבדיקות הטיפול.
ניתוחים שבוצעו בחולדות עם נגעים בקליפת המוח הסנסורי-מוטורית מצביעים על כך שבעלי החיים מבצעים פחות התאמות עם הגפה התומכת הפגועה (השמאלית לנגע) מאשר עם הגפה התומכת בע측 הנגע. חסימה חד-צדדית של העורק המוחי האמצעי גורמת הן לירידה בהתאמות עם הגפה התומכת הפגועה והן לעלייה בהתנהגויות טיפול שאינן טיפוסיות. ניתוחי וידאו מעכברים מראים שבעלי חיים מבוגרים זקוקים לזמן רב יותר כדי לאכול את חתיכות הפסטה ומבצעים יותר התאמות שאינן מובילות להחדרת הפסטה לתוך הפה בהשוואה לעכברים צעירים בוגרים.
הדגמנו בפניכם כיצד לכמת התנהגויות טיפול בפסטה בחולדות ועכברים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את המהימנות בין השוהים (interrater reliability) כדי להבטיח שסידורי הפסטה מזוהים באופן מדויק. וזהו זה.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את מבחני הטיפול בורמיצ'לי ובקפליני (Vermicelli and Capellini Handling Tests), המעריכים את המיומנות המוטורית של כפות הרגליים הקדמיות במכרסמים על ידי ניתוח האופן שבו הם מטפלים בפסטה לא מבושלת. הפרוצדורה כוללת צילום של בעלי החיים במהלך הטיפול במזון כדי לכמת את ההתאמות שהם מבצעים בכפות הרגליים הקדמיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- מודלים של מכרסמים
רקע
- מיומנות מוטורית של כף רגל קדמית היא קריטית להבנת מיומנויות מוטוריות במכרסמים.
- במבחני הטיפול (handling tests) נעשה שימוש בפסטה כדי להעריך את הדיוק של תנועות כף הרגל הקדמית.
- שינויים במיומנות המוטורית העדינה עשויים להעיד על ליקויים נוירולוגיים או על ירידה הקשורה לגיל.
- ניתוח וידאו מאפשר תצפית מפורטת על תנועות הכפות בזמן האכילה.
מטרת המחקר
- לכימות התאמות של כף רגל קדמית במהלך טיפול במזון במכרסמים.
- להערכת ההשפעה של נזק מוחי או הזדקנות על מיומנות מוטורית (dexterity).
- לקביעת שיטה סטנדרטית להערכת מיומנויות מוטוריות במודלים של מכרסמים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מבצעים הרגלה של המכרסמים לטיפול בפסטה לא מבושלת בכלוב הבית שלהם.
- הצילום בווידאו מבוצע בסביבת בדיקה מבוקרת.
- נעזרים בהשמעה של סרטון בהילוך איטי כדי לנתח את התאמות כף רגל הקדמית.
- המדדים הכמותיים כוללים את מספר ההתאמות ואת זמן האכילה.
תוצאות עיקריות
- כימות ההתאמות חושף הבדלים במיומנות המוטורית לאחר פציעה או עם הגיל.
- ניתוח וידאו מזהה דפוסי טיפול לא טיפוסיים במהלך מניפולציה של מזון.
- השיטה מספקת נתונים מהימנים על מיומנות כפות הרגליים הקדמיות במודלים של מכרסמים.
- התוצאות תורמות להבנת התפקוד המוטורי ואסטרטגיות שיקום.
מסקנות
- מבחני הטיפול בורמיצ'לי ובקפליני יעילים להערכת מיומנות כפות הרגליים הקדמיות.
- מבחנים אלו יכולים לסייע בזיהוי שינויים נוירולוגיים במכרסמים.
- נהלים סטנדרטיים משפרים את השחזוריות במחקר התנהגותי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת מיומנות כף הרגל הקדמית במודלים של מכרסמים מספקת מדד תרגומי לתפקוד מוטורי התומך בתיקוף מטרה בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). נקודות קצה התנהגותיות כמותיות, כגון תדירות התאמה וזמן אכילה, מאפשרות הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור התערבויות מולקולריות לתוצאות תפקודיות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים באמצעות זיהוי ליקויים לטרליים ושינויים תלויי-גיל הרלוונטיים לאינדיקציות נוירודגנרטיביות ונוירופסיכיאטריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות ליקויים לטרליים של כף רגלי הקדמית לאחר נגעים מוחיים חד-צדדיים או דלטור של דופמין.
- ערך תפעולי: מספק מדד רגיש וניתן לשחזור לזיהוי גירעונות מוטוריים עדינים שעשויים שלא להבוא לידי ביטוי במבחנים מוטוריים כלליים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הקשר בין מטרות מולקולריות לשינויים מדידים בתפקוד מיומן של כף רגל קדמית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים ונורמליים (התאמות לפי יחידה, זמן אכילה) המתאימים לסריקת התנהגות בעלת תוכן גבוה.
- ערך תפעולי: משתמש באורכי פסטה סטנדרטיים ובפרוטוקולי הרגלה כדי להפחית שונות ולשפר את השחזוריות של הבדיקה בין מעבדות שונות.
- ערך מדעי: מקל על זיהוי דפוסי טיפול לא טיפוסיים שיכולים להבדיל בין סוגי פגיעות לבין התקדמות המודל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע רגישות מערכתית רלוונטית למחלה הן לפגיעות חריפות במערכת העצבים המרכזית (למשל, MCAO) והן לתהליכים נוירודגנרטיביים כרוניים.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב ארוך טווח של שינויים במיומנות המוטורית (dexterity), ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות סיכון במחקרי פרה-קליניקה.
- ערך מדעי: עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי אספקת מתאם תפקודי להתערבויות מבניות או מולקולריות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), כאשר תיקוף פונקציונלי מספק בסיס להחלטות המשך או הפסקה (go/no-go) לפני השקעה משמעותית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבחינת השערות באמצעות כימות התאמות של כף רגל קדמית כמדד עקיף לשלמות המעגל העצבי ולשליטה מוטורית.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה באמצעות ניתוח וידאו והתרגלות סטנדרטיים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מניבה תוצאות כמותיות (קצב התאמה, זמן אכילה) המאפשרות השוואה אובייקטיבית בין קבוצות ניסוי ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מתחברת לרצף פרה-קליני על ידי מידול ירידה במיומנות מוטורית הקשורה לגיל ומסלולי התאוששות לאחר פציעה.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת ניתנת להרחבה עם תשתית מינימלית, ישימה בתחומי טיפול מרובים הכוללים תפקוד מוטורי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בין מודולציה של המטרה לבין התאוששות תפקודית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה ואת השחזוריות בין מעבדות באמצעות קריטריוני ניקוד מוגדרים וניתוח מבוסס וידאו.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים תפקודיים מוקדמים המפחיתים נשירה בשלבים מאוחרים עקב חוסר יעילות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על שיפורים תלויי-מינון בהתנהגות מיומנות של כף רגל קדמית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהתנהגות מכרסמים ובניתוח וידאו כדי להבטיח זיהוי מדויק של התאמות בכף הרגל הקדמית.
- תלוי בתאורה עקבית, במיקום המצלמה וביכולת השמעה בהילוך איטי לצורך איסוף נתונים מהימן.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ההרגלה והניקוד כדי לשמור על מהימנות בין בוחנים.
- כולל שיקולי התאמה בעת תרגום בין פרוטוקולים של חולדות לעכברים בשל הבדלים בטיפול הספציפי למין.
- מוגבל להערכת שימוש מיומן בכף הרגל הקדמית במהלך בליעה; אינו מיועד למדידת תנועה גסה או כוח.
