Name: בפרוטוקול באתרו על כנפי פרפר גלמי שימוש Riboprobes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: חקור פרוטוקול אופטימלי להכלאה באתרו בכנפי פרפר גלמי Bicyclus anynana באמצעות ריבופרובים לניתוח ביטוי גנים. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תהליכי התפתחות בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ג&#39;יין Selegue, מרגרט הולינגסוורת&#39;, ג&#39;ין ברי, ריו Futahashi, Najmus סהר מחפוז, אלכסנדר Popadic, בוב ריד, תמיכה טכנית עבור רוש לסייע לפתרון בעיות בפרוטוקול זה. אנו מודים גם ויליאם Piel עצה על עריכת הסרט.

יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x PBT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DDH 2 O <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DEPC עבור הנפח הכולל 0.1% ולנער פתרונות במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde תקן 4% - באמצעות PBS-DEPC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון proteinase K - אם המשקע קיים, מערבולת במרץ לפני הסרת aliquot </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור הצפת עיכול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prehybridization הצפת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50:50 PBT: מאגר Prehybridization </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה הצפת <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות צריך להישמר RNase חינם. שימוש או כלי זכוכית, כי כבר אפוי (4 שעות 250 ° C) או פלסטיק חד פעמיות. Pipettes סרולוגית הם מאוד שימושי עבור ממציא פתרונות </li></ul></li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כנפיים מעת-מבוים גלמים ב PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כנפיים ישירות תקן הצפת בבארות של צלחת 24 תרבות היטב בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תקליטורי למשך 2 שעות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 x 5 דקות PBT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כנפיים במשך 3 דקות בתמיסה K proteinase </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 x ב הצפת עצור עיכול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 x 5 דקות PBT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 x 5 דקות 50:50 PBT: PHB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 1 x 10 דקות PHB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שעה לפחות 1 PHB על 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום לפגל RNA בדיקה (20-50ng לכל צורך היטב) (80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) ולהוסיף למאגר הכלאה (100 μl הדרוש לכל טוב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת בדיקה בארות דגירה 48 שעות ב 55 ° C </li></ol> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 4 x 5 דקות 55 ° C PHB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה PHB ב 55 ° C </li></ol> יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק נוגדן הצפת </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 1 x 5 דקות 50:50 PBT: PHB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 4 x 5 דקות PBT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנפיים דגירה במשך שעה 1 ב הצפת בלוק ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כנפיים בדילול 1:2000 של נוגדנים נגד Dig לילה ב 4 ° C </li></ol> יום 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור הצפת </li></ul><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח הפתרון - (לעטוף בנייר כסף) אור רגיש </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 x 5 דקות PBT בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 7 X 5 דקות PBT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כנפיים פעמיים בתוך מאגר זיהוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח הכנפיים מ&quot;ל 1 של פיתוח פתרון - זמן של התפתחות צריך להיות במעקב כל הזמן - פעמים מתפתחות יכול לשנות אפילו בעת שימוש חלליות אותו פתרון פיתוח - בדרך כלל לבדוק אחרי 5-10 דקות ולאחר מכן להגדיל את מרווחי עד לילה. פלייט יש לעטוף בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור כאשר לא בדיקת דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חמש פעמים הצפת עצור פיתוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כנפיים. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

אופטימיזציה של הפרוטוקולים הקיימים ב הכלאות באתרם על דיסקים כנף הזחל בוצעו בהצלחה באמצעות דיסקים של פרפרים תמצית coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. ותרבי et al 1999).. הפרוטוקול הנוכחי הותאם מתוך פרוטוקול כתוב מפורט זמין על פי דרישה מן המעבדה קרול עבור stainings כנף הזחל. השינויים שעשינו לשרת כדי להכיל הבדלים בין רקמות כנף הזחל ו גלמי. במהלך והניתוחים hindwing גלמי, קרום peripodial יש להסיר ולא נכלל הבארות. הזמן לתקן הראשוני הוא הרבה יותר בפר...

<table><tbody><tr><td>תמיפת קיבוע</td><td></td><td></td><td></td><td>4% פאראפורמאלדהיד ב-PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0.1% Tween 20 ב-PBS</td></tr><tr><td>תמיסת Proteinase K</td><td></td><td></td><td></td><td>2.5&amp;#109;ג'/מ"ל Proteinase K ב-PBT</td></tr><tr><td>בופר לעצירת העיכול</td><td></td><td></td><td></td><td>2 מ"ג/מ"ל גליצין ב-PBT</td></tr><tr><td>בופר טרום-היברידיזציה</td><td></td><td></td><td></td><td>עבור 50 מ"ל PHB: 12 מ"ל מים שעובדו ב-DEPC + 25 מ"ל פורממיד (Formamide) + 12.5 מ"ל SSC בריכוז 20x + 50 מיקרוליטר Tween 20 + 500 מיקרוליטר DNA מזרה סלמון בריכוז 10 מ"ג/מ"ל (ללא RNase, עבר דנטורציה תרמית לפני ההוספה לתמיסה).</td></tr><tr><td>תמיסת דיברידיזציה (Hybridization Buffer)</td><td></td><td></td><td></td><td>הוסף גליקוגן בריכוז 1 מ"ג/מ"ל לתמיסת טרום-הibrדיזציה (prehybridization buffer)</td></tr><tr><td>בופר חסימה</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>נוגדן</td><td>קבוצת Roche</td><td>11 093 274 910</td><td>אלקלאין פוספטאז מצומד</td></tr><tr><td>סט תמיסות שטיפה וחסימה ל-DIG</td><td></td><td>קבוצת Roche</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>תוכנית קיבוע מימית Crystal Mount</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>תוכנית הרכבה (Mounting Medium) </td></tr></tbody></table>

בפרוטוקול באתרו על כנפי פרפר גלמי שימוש riboprobes

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

כאן אנו מציגים, בפורמט וידיאו, פרוטוקול של הכלאות באתרם גלמי כנפיים של פרפר Bicyclus anynana באמצעות riboprobes. ב הכלאות באתרו, עמוד התווך של הביולוגיה ההתפתחותית, מועילים כדי ללמוד את דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בפיתוח רקמות ברמה של שעתוק. אם נוגדנים היעד מוצרי חלבון של שעתוק הגנים טרם פותחו, ו / או יש גן עותקים מרובים של חלבון מסוים בגנום זה לא יכול להיות מובחן באמצעות נוגדנים זמינים, בכל מנח יכול לשמש במקום. בעוד בטכניקה באתרו עבור דיסקים כנף הזחל כבר זמין לקהילה פרפר במשך כמה שנים, פרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה עבור כנפי גלמי גדול יותר ועדין יותר.

כדי לבחון ביטוי גנים ברקמות הזרוע גלמי של Bicyclus anynana, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה של הכלאות באתרו באמצעות riboprobes. כמו כן אנו מספקים הנחיות אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול זה לשימוש כנפיים גלמי Lepidopteran של מינים אחרים.

בפרוטוקול באתרו על כנפי פרפר גלמי שימוש Riboprobes

כאן אנו מציגים, בפורמט וידאו, פרוטוקול להיברידיזציה באתר (in situ hybridization) בכנפי בובנאות של הפרפר Bicyclus anynana באמצעות ריבופרובים (riboprobes). היברידיזציה באתר...

זהו פרוטוקול צביעה עבור כנפי פרפר בשלב הגולם. אנו מתחילים באיסוף טרום-גולמים מהכלוב, הנחתם על מגש, ולאחר מכן צילום של זמני המעבר המדויקים לשלב הגולם באמצעות צילום פרלפס (time lapse). הדבר מאפשר לנו לבצע את הצביעות בזמנים מדויקים לאחר התרחשות הגלומות.דבר זה חשוב מכיוון ש-mRNAs שונים עבור חלבונים שונים מובעים בזמנים שונים לאחר הפריון. כאן אנו מנתחים את כנפי התלמידים בתוך צלחת פטרי עם בסיס סיליקון, והחלק החשוב הוא להסיר את הכנפיים ולהניחן בתמיסת הקיבוע כך שיהיו שטוחות מאוד. אם הן לא יהיו שטוחות בשלב זה, הן לעולם לא יהיו שטוחות שוב.לאחר זמן הקיבוע המתאים, אנו מסירים את בופר הקיבוע ושוטפים חמש פעמים. בשיטת PBT, שלב הפרוטינאז K הוא קריטי למדי, והוא משמש להחדיר את הרקמות עבור הגשוש (probe); לכן יש לעצור אותו בזמן הנכון באמצעות שטיפות אלו. DNA מזרה סלמון משמש כמקור זול של DNA למניעת היקשרות לא ספציפית של הגשוש.הזרע הוא אחד הרכיבים של תמיסת טרום-ההibrדיזציה. לכן, אנו מוסיפים כאן את הזרע לתמיסת טרום-ההibrדיזציה, ולאחר מכן תהיה תמיסה מוכנה, שהיא תמיסת 1 50 50 P-B-T-P-H-B, חצי PBT וחצי תמיסת טרום-ההibrדיזציה. תמיסה זו משמשת כתמיסת ביניים כדי להעביר את הכנפיים בעדינות מתמיסת ה-PBT שבה הן נמצאות, אל תמיסת טרום-ההibrדיזציה.ולכן ישנו שלב ביניים שבו הכנפיים יהיו מושקעות תחילה בתמיסה של 50:50 זו. כא

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה...

תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו.   מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי  דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

חקור פרוטוקול אופטימלי להכלאה באתרו בכנפי פרפר גלמי Bicyclus anynana באמצעות ריבופרובים לניתוח ביטוי גנים. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תהליכי התפתחות בביולוגיה התפתחותית.

בפרוטוקול באתרו על כנפי פרפר גלמי שימוש Riboprobes

גלה סרטונים נוספים