דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)
17 באוקטובר 2010
שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.
סרטון זה מדגים הליך לביצוע דימוי דיפרנציאלי של שתי תהודות רמן הקשורות למבנים ביולוגיים עם אותות פיזור רמן קוהרנטיים. ראשית, שלושה לייזרים של פולסים קצרים מסונכרנים מותאמים בזמן ובמרחב. הפולסים המותאמים נשלחים לאחר מכן למיקרוסקופ הפוך סטנדרטי, המאפשר יצירת אותות רמן קוהרנטיים מאובייקטים מיקרוסקופיים.
אותות ממירים לתמונות באמצעות תוכנה מסחרית כדי להשוות בין אותות רמן שונים שנוצרו. התוצאות מעידות כי ההבדל בין תמונות שהתקבלו מאותות רמן בעלי תהודה כפולה לעומת תהודה בודדת מספק רגישות משופרת עבור אותות רמן חלשים. שלום, אני טיילר וויקס מהמרכז לפוטוניקה ביולוגית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס.
אני תומס ER מהמרכז לפוטוניקה ביולוגית ומחלקת הרפואה הפנימית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. היום נדגים לכם פרוצדורה לשימוש בפיזור רמנאן אנטי-סטוקס קוהרנטי בעל תהודה כפולה (doubly resonant coherent anti-Stokes Raman scattering) להפקת דימויים בעלי ספציפיות כימית של תאים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לזהות אותים ממולקולות שהם חלשים מכדי להיות מזוהים ישירות על ידי ספקטרוסקופיית רמנאן אנטי-סטוקס קוהרנטית בלבד.
בואו נתחיל. כדי להפיק אותות CAR ו-DrCAR בו-זמנית, נדרשים שלושה מקורי לייזר בעלי פולסים קצרים, הניתנים לכיוון ולסנכרון. כדי לקבל פולסים מסונכרנים אלו, נתחיל עם לייזר פולסים קצרים בודד עם הספק פלט של 10 watts, אורך גל קבוע של 1064 nanometers, אורך פולס קבוע של שבעה picoseconds וקצב חזרה קבוע של 76 megahertz.
באמצעות סדרה של לוחות רבע-גל וקוביות של מפחיתי קרן מקטבים (polarizing beam splitter cubes), הקרן מופעלת לפיצול לשלושה חלקים. לוח רבע-גל בשילוב עם קוביית מפחית קרן מקטבים מאפשרים כוונון של כמות ההספק בכל רכיב של הקרן מבלי לשנות את כיוונה. בדרך כלל, שתי קרניים מכווננות לכ-4.5 watts כל אחת, והקרן השלישית מכילה את הוואט הנותר.
שתי קרני ההספק הגבוה מופנות לאחר מכן לשני מתנדים פרמטריים אופטיים (OPOs) עצמאיים. OPOs משתמשים ביצירת תדרים שונים כדי להמיר פוטון בעל אנרגיה גבוהה לשני פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה יותר ובאורכי גל שונים. באמצעות בקרת הטמפרטורה של הגביש המשמש להשגת אפקט זה, ניתן לשלוט באורכי הגל של הפוטונים המתקבלים ברמת דיוק של 0.1 nanometers.
על ידי הכפלת תדר של אותות אלו, ניתן כעת להפוך לייזר בעל אורך גל קבוע של 1064 nanometers לקרן לייזר שניתן לכוון לכל ערך בין 780 nanometers ל-910 nanometers, באמצעות שאיבה של שני OPOs נפרדים מאותו מקור של 1064 nanometer. כך מתקבלים שני מקורות לייזר הניתנים לכוונה באופן עצמאי ומסונכרנים אוטומטית ללייזר השאיבה המקורי. הקרן השלישית מלייזר השאיבה של 1064 nanometer מופנית סביב ה-OPOs באמצעות שילוב של מראות דיאלקטריות, כך ששלוש הקרנות יוכלו להיות מאוחדות שוב מאוחר יותר.
על מנת לייצר ביעילות פוטונים קוהרנטיים של אות ראמן, על הפולסים המאוחדים להיות חופפים הן מבחינה זמנית והן מבחינה מרחבית, מכיוון ש-OPOs מכילים חללי תהודה טבעתיים המאפשרים לכל פולס לייזר לעבור דרך הגביש מספר פעמים; הקרינה הנשלחת דרך ה-OPOs עוברת מרחק נוסף הגורם להשהיה ניכרת ביחס לקרן המשאב המקורית. יש לפצות על מרחק זה באמצעות קרן שלישית על ידי הוספת מראות נוספות המאלצות קרן זו לעבור את אותו מרחק כמו שתי הקרניים האחרות לפני איחודן באמצעות מראות דיכרואיות, במטרה לאפשר כיוונון מדויק של אורך המסלול. כל קרן מועברת דרך שלבי השהיה מתכווננים, המאפשרים כיוונון של החפיפה הזמנית בין פולסי הלייזר השונים.
סט נוסף של פלטות חצי-גל (half-way plates) וקוביות מפריד קרניים מקטב (polarizing beam splitter cubes) מתווסף לכל קרן כדי לאפשר כוונון עצמאי של הספק הלייזר של כל קרן. מראות דיכרואיות משמשות תחילה לאיחוד הקרניים משני ה-OPOs, ולאחר מכן לקרן של 1064 nanometer; יש להקפיד לוודא שהקרניים חופפות בדיוק במרחב. ניתן לאמת זאת על ידי השוואת החפיפה של הקרניים במרחק של סנטימטרים ספורים מהמראה הדיכרואית לעומת חפיפתן במרחק של כמעט מטר מהמראה הדיכרואית.
מכיוון שחשיפה לקרני לייזר בעלות הספק ממוצע גבוהה עלולה לפגוע בדגימה, שלושת הקרניים המשולבות נשלחות דרך מודולטור אופטי חשמלי המשמש כבורר פולסים (pulse picker), המאפשר כיוונון של קצב החזרת הפולסים המגיעים לדגימה, ובכך את ההספק הממוצע. קרני הלייזר המשולבות מוזנות לאחר מכן לתוך מיקרוסקופ הפוך עם עדשת אובייקטיב בעלת מפתח מספרי גבוה, או na. המיקוד הדוק שנוצר על ידי עדשת האובייקטיב בעלת ה-NA הגבוה מאפשר את היצירה היעילה ביותר של אותי רמנית (ramen) קוהרנטיים בקני מידה מיקרוסקופיים.
העדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ מורכבת על במה פייזו (pizo stage) בצירים X, Y, Z, המאפשרת השגת תמונות באמצעות סריקת רסטר (raster scanning) של קרניים על פני הדגימה, בדומה למיקרוסקופים קונפוקאליים מסחריים עם סריקת קרניים. כעת נראה כיצד לייצר אותות CARS ו-DRFM; האינטראקציה של שלוש קרני לייזר בפולסים קצרים עם הדגימה גורמת להיווצרותם של מספר אותות של ערבוב ארבע גלים (four wave mixing), כגון CARS מהשילובים השונים של שני לייזרים, כמו כן אותות Three-color CARS ואותות DR-CARS מהשילוב של שלושת הלייזרים. כאשר האותות קרובים יחסית באורך הגל שלהם, הפרדתם לצורך אנליזה עלולה להיות קשה.
מסיבה זו, האותים מועברים לספקטרומטר דימות המשמש גם כמונוכרומטור או כמסנן חסימת פס (band pass filter) להפרדה מרחבית של אותים באורכי גל שונים. מראה מתהפכת המופעלת אלקטרונית בתוך הספקטרומטר, במצב מורד, מעבירה את האות למצלמת CCD (charge coupled device) בעלת תא תאורה אחורית ודלטורי עמוק (deep depletion), המספקת מידע ספקטרוסקופי על פני כל טווח האותים, ומאפשרת לנו לזהות ולבצע אופטימיזציה לאותות robin קוהרנטיים שונים כדי לבחור את האות להצגה. פשוט סובבו את הסריג (grating) בתוך הספקטרומטר באמצעות תוכנת הבקרה ורכישת הנתונים שסופקה על ידי היצרן כדי למקם את שיא העניין במרכז מצלמת ה-CCD.
לאחר מכן, שנו את מיקום מראת ההפיכה כדי להפנות את האות לנמל יציאה שני, לו מחוברת דיודה פוטו-אלקטרית מסוג Avalanche (APD) לספירת פוטון בודד או גלאי פוטו (PD). סרקו את עדשת העדשה (objective lens) באמצעות סריקת רסטר (Raster scan), ולאחר מכן השתמשו באותים שנרשמו ב-PD כדי להפיק תמונה, על ידי הצגת קצב ספירת הפוטונים עבור כל פיקסל באמצעות תוכנת רכישת הנתונים. חזרו על הליך ההדמיה עבור כל אות Raman קוהורנטי רצוי, כך שניתן יהיה להשוות בין האותים במהלך עיבוד הנתונים לאחר הבדיקה.
כעת נראה כיצד להכין את הדגימה בצורה נכונה כדי לקבל תמונות ברורות וניתנות לשחזור. יש לנקוט בזהירות בעת הכנת הדגימות. דגימות מוכנות בדרך כלל על לבישות זכוכית בעובי של כ-150 micron.
כיסויים אלה דקים מספיק כדי לאפשר דימות ברזולוציה גבוהה באמצעות עדשות אובייקטיב עם NA גבוה בטבילת מים או שמן, המשמשות בניסויים אלה. כדי להדגים את הכנת דגימה טיפוסית, אנו מכינים חתכים בעובי של כ-20 micron של רקמת שריר של עכבר, המקובעים לסרטית מיקרוסקופ. טיפה של 20 µL של תמיסת גלוקוז דאוטרציה בריכוז five molar מתווספת לדגימה.
תמיסת הגלוקוז הדאוטרלית מספקת חתימת רקע חזקה וייחודית ל-Raman. כיסוי זכוכית (cover slip) מונח מעל הדגימה ומקובע במקומו באמצעות לק ציפורניים עבור תאים ותרביות. ניתן להשתמש בצלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית המאפשרות דימוי ללא צורך בניתוק התאים מצלחות גידול תרבית התאים שלהם.
כעת נראה כיצד לקבוע את קווי הרמון והשיאים המתאימים עבור Dr cars. כדי לנצל כראוי את אפקט ההגברה של התהודה הכפולה, יש להכיר את ספקטראי הרמון של שני החומרים בעלי התהודה הרמונית. בדרך כלל, אלו הם 2,845 inverse centimeters הקשורים לליפידים ו-2,121 inverse centimeters עבור מצב המתיחה של CD הקשור לגלוקוז דויטרי.
פיזור רמן קוהרנטי מושג כאשר הפרש התדרים בין שני לייזרים תואם לתדר של רטט מולקולרי. על ידי כוונון של OPO אחד ל-817 ננומטר, הוא יבחון את אופן ה-C ב-2,845 סמ⁻¹ כאשר הוא משולב עם קרן לייזר של 1064 ננומטר, ועל ידי כוונון ה-OPO השני ל-868 ננומטר, הוא יבחון את ה-2,121 סמ⁻¹ כאשר הוא משולב עם קרן ה-1064 ננומטר. במצב ספקטרוסקופי, מיקרוסקופ ה-CARS מאפשר לנו לצפות בשלושה אותות רמן קוהרנטיים רלוונטיים: אות CARS הבוחן את רטט המתיחה של CH, אות CARS הבוחן את אופן המתיחה של CD, ואות DR CARS הבוחן את שניהם. בדיאגרמה המוצגת כאן, חצים מקווקווים מציינים פוטונים מהלייזר ב-OPOs וחצים רצופים מציינים את האות שהתקבל.
הקווים האופקיים הרצופים מציינים את האנרגיה של רטט ה-raman ומספקים ייצוג חזותי לכך שבמכוניות DR ערבוב של אותם שלושה פוטוני קלט בודק בו-זמנית שני רטטי ramen שונים. יהיה צורך לבצע אופטימיזציה של עוצמת האות עבור כל שיא על ידי כיוונון בצעדים קטנים סביב מיקומי השיאים הללו. כאן אנו בוחרים בכל שיא ומצלמים תמונות של תולעי sea elgan בתמיסה של גלוקוז מופחת; הפקת מידע נוסף על בסיס שלוש התמונות שהתקבלו בנפרד אלו דורשת עיבוד תמונות פשוט למדי.
ראשית, יש לנרמל את התמונות. שיטה מעשית לנורמליזציה נשענת על העובדה ששומנים הם הידרופוביים. משמעות הדבר היא באזורים בעלי צפיפות גבוהה של שומנים, תהודה ה-CD מהגלוקוז צריכה לתרום מעט מאוד לאות התהודה הכפולה.
לעומת זאת, באזורים של תמיסת גלוקוז טהורה, התהודות של CH מהליפידים צריכות גם הן לתרום מעט מאוד. בהתחשב בכך, נרמלו את תמונת ה-DR ואת התמונה שהתקבלה מהתהודה של CD של תמיסת הגלוקוז הדאוטרבית לאזור שנמצא הרחק מחוץ ל-CL egan's worm, אשר לא אמור להפגין תהודת CH. לאחר מכן, זהו אזור בתוך התולעת בתמונת תהודת ה-CH העשיר בליפידים, ונרמלו אותו לאזור המקביל בתמונת ה-DR המנורמלת.
כדי ששיטה זו תעבוד כראוי, נניח כי עמוק בתוך אזור זה אין גלוקוז דויטרי. זוהי הנחה בטוחה מכיוון שהליפידים הם הידרופוביים ולא יתערבבו עם התמיסה. כעת, על ידי חיסור תמונת ה-car התהודה של CH הנורמלית מתמונת ה-car התהודה של DR הנורמלית, נותר רק אות התהודה המוגבר של CD; באופן דומה, על ידי חיסור תמונת ה-car התהודה של CD הנורמלית מתמונת ה-Dr.FWM הנורמלית.
רק האות המהדהד המוגבר של קשרי CH מוצג כאן; זהו ספקטרום רמן של חומצה אולאית משונה הכוללת מודיפיקציית אלקין. התהודה החזקה של CH ב-2,845 inverse centimeters והתהודה של האלקין ב-2,121 inverse centimeters מבודדות היטב מאזור טביעת האצבע, שהוא האזור בעל השיאים הצפופים, מה שהופך אותם למסמנים אידיאליים עבור דימות רמן קוהורנטי. זהו ספקטרום טיפוסי של אותי רמן קוהורנטיים הנוצרים כאשר שלושה לייזרים של פולסים קצרים חופפים בתוך הדגימה. החצים מצביעים על התהליכים האחראים לכל אות כפי שהם מיוצגים בדיאגרמות אנרגיה.
אלו הן תוצאות טיפוסיים מדימוי של תולעי C Elgin באמצעות CARs ו-DR CARs. בשורה העליונה נעשה שימוש בשלושת האותים שהוצגו זה עתה כדי לדמות תולעת בתמיסה של גלוקוז מופחת. בשורה השנייה, התמונות נורמלו באופן מתאים ובשורה השלישית הופקו תמונות ההפרש על ידי הפחתת כל אחת מתמונות ה-CAR מהתמונה של ה-DR CAR. הצגנו כעת כיצד לבצע דימוי הפרשי רמן המבוסס על מיקרוסקופיה של אנטי-רמן קוהורנטית בעלת תהודה כפולה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו כי חשוב לוודא שהקרניים חופפות ומסונכרנות כראוי. כמו כן, בעת מעבר בין אותים קוהורנטיים שונים, הקפידו לא להניע או להזיז את הדגימה, שכן הדבר ישפיע על הניתוח. זהו כל השלב.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת פיזור רמון אנטי-סטוקס קוהורנטי (CARS) ו-CARS בעל תהודה כפולה (DR-CARS) באמצעות שלושה לייזרים מסונכרנים בעלי פולסים קצרים. הטכניקה משפרת את הרגישות לאותים רמניים חלשים, ובכך מקלה על דימוי של מבנים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביו-פוטוניקה
- טכניקות דימות
רקע
- פיזור רמאן קוהרנטי הוא טכניקת דימוי רבת עוצמה.
- גילוי של אותי רמאן (Raman) חלשים מהווה אתגר.
- שילוב של מספר מקור לייזר יכול לשפר את גילוי האות.
- טכניקות דימות הן חיוניות למחקר של דגימות ביולוגיות.
מטרת המחקר
- להדגמת פרוצדורה ליצירת אותות CARS ו-DR-CARS.
- לשיפור הרגישות לזיהוי מפזרי רמן חלשים.
- לספק תמונות בעלות ספציפיות כימית של תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בשלושה לייזרים בעלי פולסים קצרים מסונכרנים.
- חפיפה של פולסי הלייזר בזמן ובמרחב.
- שימוש בתנודתי פרמטריים אופטיים (OPOs) לכיוון אורך גל.
- ספקטרומטר דימוי להפרדה וניתוח של האות.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של אותות CARS ו-DR-CARS.
- הדגמה של רגישות משופרת עבור אותות רמן חלשים.
- יכולת להפיק תמונות בעלות ספציפיות כימית של מבנים ביולוגיים.
- השיטה מאפשרת דימיון יעיל של אובייקטים מיקרוסקופיים.
מסקנות
- השילוב של לייזרים משפר באופן משמעותי את גילוי אות ה-Raman.
- ניתן ליישם טכניקה זו במגוון יישומים של דימיון ביולוגי.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את היכולות של דימיון Raman קוהורנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו משפרת את הרגישות לגילוי מולקולות בעלות פעילות רמאן בריכוזים נמוכים במערכות ביולוגיות, על ידי ניצול הגברה של אותים ממפזרי אור שכיחים. היא מאפשרת דימות ספציפי מבחינה כימית ללא סימון ובלי תיוגים חיצוניים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בעת בחינת דינמיקה של ליפידים או התפלגות של סממנים דאוטריים במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מבנים עשירים בליפידים ומיקום של מולקולות דאוטרפיות ללא סימון, ובכך תומך בבדיקת היפותזות של יעדים במסלולי מטבוליזם של ליפידים.
- ערך תפעולי: מספק השוואה כמותית של אותות בין אופני רטט של CH ו-CD כדי להבהיר את ההתפלגות המולקולרית ברקמות מורכבות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תמונות מנורמלות עם הפחתת רקע, המגבירות אותות Raman חלשים של אנליטים בריכוז נמוך באמצעות אותים חזקים של ממס או מטריצה.
- ערך תפעולי: מאפשר ניגודיות הדירה ללא סימון (label-free) לסריקת השפעות של תרכובות על סדר ליפידים או שילוב של גששים דאוטריים בסביבות של תאים חיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך ברצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מעקב אחר ספיגת סמן דויטרי במערכות רלוונטיות למחלה, כגון *C. elegans* או חתכים של רקמות עכבר.
- ערך תפעולי: מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין אות סמן ספציפי לבין רעשי רקע באזורים עשירים בליפידים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה החל משלב הגילוי המוקדם ועד לשלבים הפרה-קליניים, שבהם דימות כימי ללא סימון (label-free) מספק מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ועל ויסות מסלולים לפני אופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על דינמיקה של ליפידים ומיקום של גשים דאוטריים באמצעות דימוי תהודה רטטית.
- סריקה: מאפשרת דימוי הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה של הבדלים בפיזור מולקולרי בין תנאי טיפול לתנאי ביקורת.
- אנליזה: מספקת פלטי סיגנל כמותיים ונורמליים המאפשרים השוואה של תרומות תהודה של CH ו-CD בין דגימות.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי דימוי של פיזור חומרי סמן במודלים של אורגניזם שלם כגון C. elegans.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמת דימוי ללא סימון, הניתנת לכיוון, והישימה בפרויקטים מרובים החוקרים מטבוליזם של ליפידים או ביזור ביולוגי של תרכובות דאוטריות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות בזיהוי אותות בריכוז נמוך.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זיהוי אותות באמצעות נורמליזציה והדמיה דיפרנציאלית, מה שמשפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מפחית את אי-הוודאות בהסרת סיכונים ביולוגיים במטרות הקשורות לליפידים, ומאפשר קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) טובות יותר בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המשפיעות על סדר ליפידים או על שימור סומן דויטרי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באופטיקה לא-ליניארית ובסנכרון לייזר עבור יצירת אות רמון קוהרנטי.
- תלוי במתנדים פרמטריים אופטיים הניתנים לכיוונון ובמיקרוסקופיה בעלת NA גבוהה להשגת חפיפה מרחבית וזמנית של הפולסים.
- מחייב הפרדת אותים מבוססת ספקטרומטר וגילוי באמצעות CCD או גילוי פוטון בודד לצילום ברזולוציית אורך גל.
- כולל שיקולים בהכנת דגימות עבור רקמות עשירות בליפידים ותאימות למסות דאוטריות.
- מוגבל על ידי הצורך בתהודות רמון ידועות והנחות של הפרדה הידרופובית/הידרופילית לצורך נורמליזציה.
