Name: דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: למד שיטת דימוי דיפרנציאלי של תהודות ראמאן ביולוגיות באמצעות לייזרים מסונכרנים ל-CARS ו-DR-CARS. טכניקה זו משפרת רגישות לאיתותים חלשים ומאפשרת הדמיה כימית ספציפית של תאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות Iwan נהר הסכי וסבסטיאן וקסמן-Hogiu על תרומתם בפיתוח טכניקה DR-מכוניות. השבועות טיילר מודה תמיכה על ידי תוכנית Scholar לורנס מן המעבדה הלאומית לורנס ליברמור. תומאס Huser הוא אסיר תודה על התמיכה של איגוד הלב האמריקני באמצעות תוכנית גרנט-in-Aid. עבודה זו נתמכה גם על ידי מימון הקרן הלאומית למדע בחלקו. המרכז Biophotonics, מדע וטכנולוגיה NSF המרכז, המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית מס &#39;0120999 PHY. תמיכה הוא הודה גם מהמרכז UCD המדע קלינית Translational תחת מספר מענק UL1 RR024146 מן המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR).

1. דור של מכוניות DR-CARS איתותי על מנת לייצר מכוניות DR-CARS אותות בעת ובעונה אחת, שלושה מקורות מתכונן מסונכרן קצר לייזר פעמו נדרשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל שלוש פעימות מסונכרן נתחיל עם אחת 10 W לייזר (PicoTrain, HighQ לייזר, Inc). לייזר זה אורך גל קבוע של 1064 ננומטר, אורך פולס קבוע של 7 ps, ושיעור החזרה קבוע של 76 MHz. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סדרה של חצי גל צלחות מקטב קרן splitter קוביות קרן מחולק לשלושה חלקים. צלחת חצי גל בשילוב עם קובייה מקטב קרן splitter מאפשר לנו להתאים את כמות כוח כל רכיב של הקורה מבלי לשנות את הכיוון שלו. בדרך כלל, שתי אלומות מותאמים ~ 4.5 ואט כל אחת, את קרן third מכיל את הנותרים 1 וו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי אלומות בהספק גבוה מופנים אז לשתי מתנדים עצמאי פרמטרי אופטי (OPO של, Avante, APE GmbH, ברלין, גרמניה). ההבדל להשתמש OPO של תדר הדור להמיר פוטון אנרגיה גבוהה יותר לשני פוטונים עם אנרגיה נמוכה יותר באורכי גל שונים. על ידי שליטה על הטמפרטורה של גביש המשמש להשיג את האפקט הזה, אורכי הגל של הפוטונים וכתוצאה מכך ניתן לשלוט בתוך 0.1 ננומטר. על ידי הכפלת תדר האותות הללו, לייזר עם אורך גל קבוע של 1064 ננומטר כעת ניתן להפוך קרן לייזר כי יכול להיות מכוון מקום בין 780 ננומטר עד 910 ננומטר. על ידי שאיבה של שני נפרד OPO עם מקור זהה 1064 ננומטר, נקבל שני מקורות לייזר מתכונן באופן עצמאי כי מסונכרנים באופן אוטומטי לייזר המשאבה המקורית שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרן השלישית (ההספק הנמוכה ביותר) של לייזר 1064 ננומטר משאבת מכוונת סביב זה OPO על ידי שילוב של מראות dichroic כך כל שלוש אלומות (2 מ OPOs, 1 מ לייזר המשאבה) ניתן recombined מאוחר יותר. על מנת לייצר ביעילות קוהרנטית פוטונים אות ראמאן קטניות recombined חייבת להיות חפיפה הן temporally מרחבית. בגלל זה OPO מכילים חללים הטבעת, המאפשר לכל הדופק לייזר לעבור דרך מספר רב של פעמים קריסטל, קורות שנשלח באמצעות נסיעה של OPO המרחק הנוסף וכתוצאה מכך עיכוב ניכר ביחס הקורה משאבה מקורית. מרחק זה חייב להיות מתוגמל עבור עם קרן השלישי ידי הצגת מראות כי תוספת כוח קרן זה לנסוע את אותו המרחק כמו השניים האחרים לפני שהם recombined שימוש במראות dichroic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לספק התאמה קנס של אורך השביל הקורה כל נוסע בשלבים עיכוב מתכווננת, באמצעות retroreflectors פריזמה, מוכנסים כל נתיב קרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצה נוספת של חצי גל צלחות מקטב קרן קוביות ספליטר מתווספים כל הקורה כדי לאפשר לנו להתאים את העוצמה של כל קרן באופן עצמאי מבלי להשפיע על הקלט של OPO של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראות dichroic משמשים קודם לשלב את קורות משתי של OPO ולאחר מכן עם קרן 1064 ננומטר. יש להקפיד על מנת להבטיח כי הקורות הם חפפו במדויק (כלומר הם קוליניארי יש סטייה דומה). זה יכול להיבדק על ידי השוואת חפיפה של קורות קרוב (בתוך כמה סנטימטרים) ורחוק במראה (~ 1 מ ') dichroic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היתרון של שימוש בלייזרים פעמו היא הדופק כל יכול להיות שיא אנרגיה גבוהה המדגם, המאפשר לדור יעיל של אותות ראמאן קוהרנטית, תוך שמירה על עוצמת הממוצע נמוך. עוצמת ממוצע גבוה יכול לגרום נזק המדגם. לכן על מנת להמשיך לשלוט על עוצמת הממוצע מבלי להקריב אנרגיה שיא, שלוש קורות בשילוב נשלחים דרך אפנן אלקטרו אופטיים (תא של Pockel, ConOptics) מתפקד בורר דופק, אשר מאפשר לנו להתאים את קצב החזרה של פולסים כי מגיעים המדגם שלנו ולכן עוצמת הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרני לייזר משולב הם מצמידים מכן לתוך מיקרוסקופ הפוכה עם מטרה NA גבוה. המטרה היא בדרך כלל 60 X אובייקטיבי מים עדשה עם צמצם מספרית (NA) של 1.2 כי תוקנה על סטייה כרומטית על פני טווח של tunability של OPO שלנו הקורה 1064 ננומטר. חזק התמקדות שנוצר על ידי העדשה NA גבוה אובייקטיבי מאפשרת לדור היעילה ביותר של אותות ראמאן קוהרנטית בסולם מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות בשילוב מורחבות כדי overfill האחורי יציאת המטרה מיקרוסקופ. עד שגדשו את החלק האחורי של המטרה מיקרוסקופ אנו יכולים להשיג את התנאים הטובים ביותר התמקדות ולכן ברזולוציה מרחבית הטובה ביותר במערכת מיקרוסקופ שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העדשה אובייקטיבי מיקרוסקופ שלנו הוא רכוב על הבמה XYZ piezo שמאפשר לנו לקבל תמונות על ידי סריקה לסריקת הקורות על פני המדגם, בדומה הקורה סריקת מיקרוסקופ מסחרי confocal. </li></ol> 2. השימוש שלושה לייזרים קצר פעמו שימוש של שלושה לייזרים קצר פעמו תוצאות בייצור של אותות כמה מכוניות, החל ג השונותombinations של שני לייזרים, כמו גם 3-Color מכוניות DR-FWM אותות משילוב של כל שלושת לייזרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורכי הגל של האותות יכול לשקר spectrally קרובים זה לזה. כאשר אותות קרובים זה יכול להיות קשה להפריד ביניהם לניתוח שימוש קבוע bandpass גל מסננים ומראות dichroic. מסיבה זו האותות שלנו מועברים לתוך ספקטרומטר ההדמיה (SpectraPro 2300i, אקטון Research), אשר משמש גם monochromator יעילה במרחב נפרד אותות באורכי גל שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המראה להעיף actuated אלקטרונית בתוך הספקטרומטר בעמדה הוריד שולח את האות בחזרה מואר דלדול עמוק מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) המספק מידע ספקטרוסקופיות על פני טווח האות כולו מאפשר לנו לזהות לייעל את קוהרנטית שונים ראמאן אותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחור את האות שבה אנו רוצים תמונה אנחנו פשוט לסובב את הסורג בתוך הספקטרומטר, באמצעות המסופקים מלאה רכישת נתונים תוכנה (WinSpec, פרינסטון מכשירים), למרכז השיא של הריבית על מצלמת CCD ולאחר מכן לשנות את המיקום של המראה להעיף להפנות את האות ליציאת היציאה השנייה שבה מפולת פוטון יחיד לספור צילום דיודה (APD) חובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העדשה היא המטרה אז raster-שנסרקו את האותות נרשמות על APD הם השתמשו כדי ליצור תמונה על ידי הצגת פוטון לספור שער עבור כל פיקסל באמצעות תוכנה רכישת נתונים (SymPhoTime, Picoquant GmbH, ברלין, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו חוזרים על הליך זה עבור הדמיה האות הרצויה בכל ראמאן קוהרנטי אשר מאפשר לנו להשוות את האותות במהלך שלאחר עיבוד. </li></ol> 3. לדוגמא הכנה על מנת לקבל ברורה, תמונות לשחזור טיפול כלשהו חייב להילקח בהכנת המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מוכנים בדרך כלל על 150 ~ coverslips מיקרון זכוכית עבה. Coverslips אלה הם דקים מספיק כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עם 1.2 מטרות NA המשמשים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידה אופטית של עצמים דיאלקטרי יכול להתרחש כאשר אור הלייזר הוא diffracted דרך עצמים שקופים קטנים. השימוש כוח, ממוקדת היטב שיא גבוהה, קצר קרני לייזר פעמו מכן ניתן לגרור תאים קטנים או חיידקים יחד, וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות או מרוחות. כדי למנוע זאת זה עשוי להיות נחוץ כדי לשתק את המדגם על פני השטח של coverslip הזכוכית על ידי הראשון מריחת שכבה דקה של פולי-L-ליזין ידי ציפוי ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים בתרבית תחתית זכוכית מנות התרבות יכול להיות מנוצל המאפשרים הדמיה ללא צורך לנתק את התאים מן התרבות התא שלהם מנות צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפגנה תרומה זו אנו הראשון פיקדון פורמלדהיד-קבוע C. elegans תולעת נמטודות על פיסת כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להוסיף טיפה 20 μL של פתרון M 5 גלוקוז deuterated על התולעת. הפתרון מספק גלוקוז deuterated חתימה ייחודית וחזקה רקע ראמאן. </li></ol> 4. לדוגמא ניתוח כדי לנצל כראוי אפקט שיפור כפליים-התהודה הספקטרום של שני ראמאן ראמאן-התהודה חומרים חייב להיות ידוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם הוא מוכן על coverslip הוא ניתח באמצעות מיקרוסקופ ראמאן confocal לקבל את ספקטרום ראמאן רלוונטי ספונטנית לזהות פסגות מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע DR-CARS לנו לזהות את מיקומי הרפאים של מצב למתוח CH, הקשורות בדרך כלל שומנים, ואת מצב למתוח CD, הקשורים גלוקוז deuterated, כי 2845 ו - 2121 ס"מ -1 ס"מ -1 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיזור ראמאן קוהירנט מושגת כאשר ההבדל בין שני לייזרים תדר תואם את תדירות הרטט מולקולרית. על ידי כוונון OPO אחד 817 ננומטר זה יהיה לחקור את 2845 -1 ס"מ מצב CH בשילוב עם אלומת לייזר 1064 ננומטר ידי כוונון OPO אחרים 868 ננומטר זה יהיה לחקור את השיא 2,121 -1 ס"מ בשילוב עם קרן 1064 ננומטר . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי סריקה לסריקת המדגם על מיקרוסקופ המכוניות עכשיו אנחנו יכולים להתבונן three אותות ראמאן קוהרנטית של עניין. מכוניות אות לחקור את CH מתיחה רטט, מכוניות אות לחקור את מצב המתיחה CD, ואת אות DR-CARS חיטוט שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו בוחרים כל שיא כמתואר בסעיף 2.3 ולקחת תמונה כפי שתואר לעיל. </li></ol> 5. עיבוד תמונה מחלץ מידע נוסף על שלושת התמונות כעת דורש עיבוד תמונה פשוטה למדי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית תמונות חייב להיות תקין. ב נורמליזציה התיאוריה יכולה להיות מושגת על ידי החשבונאי עוצמת הלייזר כל המעורבים בתהליך כל דור האות. אולם בפועל זה לא תמיד עובד, בעיקר עקב תגובה לא אחידה רפאיםמראות, גלאי dichroic, ומסבכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה מעשית נורמליזציה מסתמך על העובדה כי באזורים בהם שומנים טהור להשתלט על האות, את התהודה CD לא צריך לתרום כל האות. כמו כן, באזורים של פתרון גלוקוז טהור התהודה CH לא צריך לתרום כל האות. לאור זאת, אנו לנרמל את התמונה DR-מכוניות התמונה מכוניות מתקבל על תהודה את התקליטור של הפתרון גלוקוז deuterated לאזור גם מחוץ C. elegans תולעת צריך להפגין אין תהודה CH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז אנחנו לזיהוי אזור בתוך התולעת בתמונה מכוניות CH-התהודה כי הוא עשיר שומנים לנרמל אותו לאזור המתאים בתוך התמונה DR-CARS מנורמל. בשיטה זו כדי לעבוד כמו שצריך אנו מניחים כי עמוק בתוך האזור הזה לא הגלוקוז deuterated הוא ההווה. זוהי הנחה בטוחה מאז שומנים הם הידרופובי ולא לערבב עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, על ידי הפחתת תמונה מנורמל CH-התהודה מכוניות מהתמונה DR-CARS מנורמל נותרנו רק עם האות CD-התהודה מוגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה על ידי הפחתת תמונה מנורמל CD-התהודה מכוניות מהתמונה DR-FWM מנורמל אנחנו נשארים עם CH-מהדהד רק אות מוגבר. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: תרשים של מערכת DR-CARS מיקרוסקופיה כמתואר לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: תמונה האור הלבן של ג תולעת elegans בפתרון גלוקוז deuterated מוכן על coverslip כוס ומוכן הדמיה. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3:. ספקטרום ראמאן של חומצה אולאית שונה (חומצת שומן בלתי רוויות) הכולל שינוי alkyne (משולשת הקשר פחמן פחמן קבוצה) תהודות CH חזק ב 2845 ו -1 ס"מ תהודה alkyne ב -1 ס"מ 2100 הן מבודד היטב מאזור טביעת אצבע (האזור של פסגות בצפיפות), מה שהופך אותם סמנים אידיאלי עבור הדמיה ראמאן קוהרנטית. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4:. ספקטרום אופייני של אותות ראמאן קוהרנטית שנוצר כאשר שלושה קצר פעמו לייזרים הם חופפים בתוך המדגם החיצים מצביעים על תהליך (ES) אחראי על כל אות כמו מיוצג על ידי דיאגרמות אנרגיה. ב דיאגרמות המוצג כאן החצים מצביעים מקווקו פוטונים מקרינת הלייזר ואת OPO של וחצים מוצק לציין את האות שהתקבל. קווים אופקיים מוצק לציין את האנרגיה של הרטט ראמאן ולתת ייצוג חזותי, כי DR-CARS, ערבוב אותו 3 פוטונים קלט בו זמנית בדיקות two תנודות ראמאן שונים. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5: תוצאות אופייניות של הדמיה ג elegans תולעים באמצעות DR-מכוניות מכוניות. השורה העליונה השתמשו בשלושת האותות המצוין באיור 4 לתמונה תולעת בתמיסה של גלוקוז deuterated. בשורה השנייה התמונות היו מנורמל הולם בשורה השלישית את התמונות ההבדל הופקו על ידי הפחתת כל התמונות מכוניות תמונה DR-המכוניות.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
<li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+%28DR-FWM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li>
<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ספקטרוסקופיית ראמאן ראמאן מבוססות הדמיה הם כלים חדשים רבי עוצמה בתחום מדעי ביו. נכון לעכשיו, זה נכון במיוחד עבור in vivo ו במחקר במבחנה של חילוף החומרים התאי והפרעות מטבוליות עיבוד ואחסון של שומנים. רוב ביו מקרומולקולות מכילים כמות גדולה של איגרות חוב דומות מולקולרית בעיקר מבוססי פחמן, כך ספקטרום ראמאן המתקבל תאים ואורגניזמים הם בדרך כלל פיתול של תרומות שומנים, חלבונים, חומצות גרעין, סוכרים, שומנים וכו &#39;קל יחסית כדי לבודד מן הספקטרום הללו מורכבים, בשל נטייתם טופס טיפות צפופה או bilayers ובגלל שהם מכילים שרשראות מורחבת עם מספר רב של אג&quot;ח CH aliphatic. היכולת שלנו כדי לבודד חלבונים ספציפיים, חומצות אמינו, RNA או DNA בתוך הסביבה התאית מורכבת, עם זאת, מוגבלת מאוד. זה נכון במיוחד אם אלה מולקולות של עניין קיימים רק בריכוזים מיקרומטר ומטה. הנה, את היכולת לחקור תהודות ראמאן חלש ניצול הציג את החדשות שלנו DR-CARS הדמיה טכניקה ההבדל מספק גישה רב עוצמה פוטנציאלי עבור microanalysis הכימי שלהם הדמיה. אמנם, את החלק המסובך ביותר של פרוטוקול זה הוא יישור וסינכרון של מערכת לייזר. כאשר מתחיל מאפס, את הסנכרון של קטניות, כלומר להבטיח כי קטניות הן חופפות בזמן למרות מסלולים שונים שהם לוקחים ניתן להקל על ידי שימוש autocorrelator דופק. חפיפה מרחבית לאחר ובזמן מושגת, מכוניות DR-CARS אותות צריכה להתגלות בקלות. עם זאת, יישור הראשון הוא בדרך כלל בוטה, וכתוצאה מכך אותות חלשים. התרגול הטוב ביותר עבור יישור מערכת זו גם היא תחילה לייצר אותות חלשים ולאחר מכן על מנת לשפר את עוצמת האות על ידי tweaking בעדינות את המראות לאורך כל נתיב והתאמת חפיפה הזמני באמצעות בשלבים דיחוי. למרות ספקטרומטר / monochromator משמש לבלבל יעיל מאוד אור בחדר תוצאות הנקייה יכולה להיות מושגת על ידי מערכת ההפעלה עם האורות בחדר כבוי וילונות או צינורות העדשה כדי למזער רקע שהוצגו על ידי אור ממקורות שונים אחרים (כגון מסכי מחשב, חיווי אורות, נוריות וכו &#39;). ההגדרה שלנו בפרט מנצל פוטון יחיד מפולת צילום דיודה הספירה (APD) גלאי זמן בקורלציה ספירת חומרה פוטון יחיד (TCSPC) לאיתור 5. זה מאפשר לנו לזהות אותות חלשים מאוד עם רעש נמוך יחסית, אבל קבוצות רבות מצאו צילום מכפיל צינורות (PMT של) עם רווח משתנה יתרון בעת ​​ביצוע מדידות דומות. היתרון של PMT היא שהם מציעים רווח משתנה ויש להם שטח זיהוי הרבה יותר גדול אשר יכול לפשט את היישור של הגלאי. בנוסף, ההגדרה שלנו מנצל בשלבים piezo לתרגם את המטרה על מנת להשיג סריקה הקורה. היתרון של זה היא שיש לנו את היכולת לחזור למקום כלשהו בתוך התמונה הסרוקה בעבר עם רמה גבוהה של דיוק לבצע מדידות נוספות כולל ספקטרום ראמאן ספונטנית. קבוצות אחרות הצליחו ניצול אסיפות ראי סריקה, או כל עוד יחידות סריקה confocal כגון מערכת אולימפוס FluoView, אשר מציע הדמיה הרבה יותר מהר, אך היא מוגבלת ביכולתה לחזור דווקא למקומות שרירותי בתוך תמונה. כוונון לייזרים כדי להתאים את התהודה ראמאן גם שלב קריטי אשר יחייבו כמה אופטימיזציה. למרות הפסגות ראמאן יכול להיות ידוע את עוצמת מקסימום שיא הספקטרום המתקבל DR-מכוניות מכוניות לא בהכרח מתאימות לכל היותר הפסגה ראמאן ספונטנית. זאת בשל התערבות מהותית של אותות שנוצר על ידי ארבע גל ערבוב המוביל האות הלא מהדהד ברקע ומכוניות, אשר מעוות מכוניות ספקטרה יחסית ספקטרום ראמאן ספונטנית. המיקום הרפאים של השיא של האות המכוניות ניתן לחשב, אך גישה מעשית יותר היא לכוון את OPOs ב, כמה צעדים קטנים על פני הספקטרום המיקום הצפוי של התהודה ראמאן. תהליך זה אמור להניב מקסימום ברור. למעשה, על הרגישות הגדולה של DR-FWM תהודות הן חייב להיות מכוון למקסימום זה. אחת הבעיות פוטנציאל האחרון הגישה DR-המכוניות יש גם לדון, כלומר את האות DR-CARS יהיה תלוי הפצה הומוגנית של המולקולה ראמאן פעיל הגברה. עבור אובייקטים ביולוגיים ביותר, זה יכול בהחלט להיות תהודה רחבה OH מן המים, שהוא בשפע בכל מקום כמעט. מים, לעומת זאת, מחוץ לאזורים הידרופובי עם תא, כגון טיפות השומנים, המוביל עיוות של האותות המתקבלים כאשר ניצול תהודה מים כדי להגביר מצבי השומנים. בדוגמה שלנו, השתמשנו פתרון של גלוקוז deuterated לייצר אות לזיהוי בקלות ובשפע למדגם הביולוגי שלנו. באופן דומה, deuterated מים או deuterated buffe ביולוגיrs, כגון d-HEPES יכול לשמש. בדוגמה שלנו, שומנים טיפות בתוך ג תולעת elegans היו קטנים מספיק כדי להכיל תמיד, הפתרון deuterated גלוקוז ושומנים בתוך המקום לייזר ממוקדת של המערכת שלנו. עם זאת, הוא בדרך כלל לא נכון. דוגמה מסוים יהיה adipocytes, אשר יוצרים טיפות השומנים די גדול בתוך הציטופלסמה שלהם. זאת אומרת, כל ניסוי שנערך עם טכניקה DR-המכוניות מצריכה הכנה קפדנית וניסיונות לשלוט כדי לאמת את התוצאות.

<table><tbody><tr><td>עדשת אובייקט 60X בטבילת מים</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>תא פוקלס (Pockels Cell)</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>משאבת לייזר של Picotrain</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>מתנד פרמטרי אופטי</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 כיסויי זכוכית (cover slips)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 ס"מ&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>לוחות חצי-גל</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>קוביות מפליג קרן מקטבים</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 או PBS053</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר/מונוכרומטור</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>דיודה פוטואלקטרית מסוג Avalanche (APD)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>במה פייזו XYZ</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>זהו שילוב של במה XY ומחזיק עדשה Z</td></tr><tr><td>מראות דיכרואיות</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>מסננים דיכרואיים ספציפיים אלו אינם קריטיים; כל סט בעל מאפייני העברה/החזרה מתאימים יהיה מספיק.</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>לשילוב קרני הלייזר השונות בטווח האינפרה-אדום הקרוב</td></tr><tr><td>כרטיס TCSPC</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדימות Symphotime</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (cars)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

קוהירנט שיטות הדמיה ראמאן ראינו עלייה דרמטית בפעילות בעשור האחרון, בשל הבטחתם לאפשר ללא תווית הדמיה אופטית עם סגוליות גבוהה מולקולרית 1. הרגישות של טכניקות אלה, לעומת זאת, הזמנות רבות של עוצמת הקרינה חלשה יותר, המחייב מילי טוחנת מולקולרית 1,2 ריכוזי. כאן אנו מתארים טכניקה שיכולה לאפשר גילוי ריכוזים חלש או נמוך של ראמאן פעיל מולקולות על ידי הגברה האות שלהם עם זה המתקבל scatterers ראמאן חזק או עשיר. האינטראקציה של לייזרים של פולסים קצרים מדגם הביולוגי מייצר מגוון רחב של קוהרנטית אותות פיזור ראמאן, שכל אחד מהם לשאת מידע כימי ייחודי על המדגם. בדרך כלל, רק אחד האותות הללו, למשל פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS), משמש ליצירת תמונה בעוד אחרים מבוטלים. עם זאת, כאשר האותות הללו אחרים, כולל 3-צבע מכוניות ארבעה גל ערבוב (FWM), נאספים לעומת האות המכוניות, אחרת קשה לזהות מידע ניתן לחלץ 3. לדוגמה, מכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS) הוא תוצאה של התערבות בונה בין שני אותות התהודה 4. אנו מדגימים כיצד כוונון של שלוש לייזרים הנדרש כדי לייצר מכוניות DR-אותות 2845 הרטט -1 ס&quot;מ למתוח CH שומנים לבין 2,120 -1 ס&quot;מ תקליטור רטט מתיחה של מולקולה deuterated (סוכרים deuterated למשל, חומצות שומן, וכו &#39;) יכול להיות מנוצל כדי בדיקה גם תהודות ראמאן בו זמנית. בתנאים אלה, בנוסף אותות מכוניות תהודה כל אות משולב DR-CARS חיטוט הן מופק גם. אנו מדגימים כיצד לזהות את ההבדל בין אות DR-המכוניות ואת האות הגברה של רעידות מולקולה של שפע יכול לשמש כדי לשפר את הרגישות לאות החלש. בנוסף, אנו מראים כי גישה זו אף מרחיב את יישומים בהם הן אותות נוצרות ממולקולות שונות, כך למשל באמצעות האות ראמאן חזקה של ממס יכול לשפר את האות ראמאן חלש של המומס לדלל.

שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

טכניקות של דימות רמאן קוהרנטי (Coherent Raman imaging) חווו עלייה דרמטית בפעילות במהלך העשור האחרון, בשל הפוטנציאל שלהן לאפשר דימות אופטי ללא סימון...

סרטון זה מדגים פרוצדורה לביצוע דימוי דיפרנציאלי של שתי תהודות רמון הקשורות למבנים ביולוגיים בעלי אותות פיזור רמון קוהורנטיים. ראשית, שלושה לייזרים של פולסים קצרים מסונכרנים מוחלפים בזמן ובמרחב. הפולסים המוחלפים נשלחים לאחר מכן למיקרוסקופ הפוך סטנדרטי, המאפשר יצירה של אותות רמון קוהורנטיים מאובייקטים מיקרוסקופיים.אותות ממירים לתמונות באמצעות תוכנה מסחרית על מנת להשוות בין אותות רמון שונים שנוצרו. התוצאות מעידות כי ההבדל בין תמונות שהתקבלו מאותות רמון בעלי תהודה כפולה לעומת תהודה בודדת מספק רגישות מוגברת לאותות רמון חלשים. שלום, אני טיילר ויקס מהמרכז לפוטוניקה ביולוגית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס.אני תומס ER מהמרכז לפוטוניקה ביולוגית והמחלקה לרפואה פנימית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. היום נראה לכם הליך לשימוש בפיזור רמון אנטי-סטוקס קוהורנטי עם תהודה כפולה (doubly resonant coherent anti-Stokes Raman scattering) להפקת תמונות ספציפיות מבחינה כימית של תאים. אנו משתמשים בהליך זה כדי לזהות אותות ממולקולות שהם חלשים מכדי להיות מזוהים ישירות על ידי ספקטרוסקופיית רמון אנטי-סטוקס קוהורנטית לבדה.אם כך, נתחיל. כדי להפיק אותות CAR ו-Dr CAR בו-זמנית, נדרשים שלושה מקורות לייזר בעלי פולסים קצרים, הניתנים לכוונון ומסונכרנים. כדי להשיג את הפולסים המסונכרנים הללו, נתחיל עם לייזר פולסים קצרים בודד בעל הספק פלט של 10 watts, אורך גל קבוע של 1064 nanometers, משך פולס קבוע של שבעה picoseconds וקצב חזרות קבוע של 76 megahertz.באמצעות סדרה של לוחות חצי-גל (half wave plates) וקוביות מפליל קרן מקטב (polarizing beam splitter cubes), הקרן מופסלת לשלושה חלקים. לוח חצי-גל בשילוב עם קוביית מפליל קרן מקטב מאפשרים כיוונון של כמות ההספק בכל רכיב של הקרן מבלי לשנות את כיוונה. בדרך כלל, שתי קרניים מכווננות לכ-4.5 watts כל אחת, והקרן השלישית מכילה את הוואט הנותר.שתי קרני ההספק הגבוה מופנות לאחר מכן לשני מתנדים פרמטריים אופטיים (OPOs) עצמאיים. OPOs משתמשים ביצירת תדרים שונה כדי להמיר פוטון בעל אנרגיה גבוהה לשני פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה יותר ובאורכי גל שונים. על ידי בקרת הטמפרטורה של הגביש המשמש להשגת אפקט זה, ניתן לשלוט באורכי הגל של הפוטונים שנוצרו בדיוק של עד 0.1 nanometers.באמצעות הכפלת תדר של אותות אלה, ניתן כעת להפוך לייזר בעל אורך גל קבוע של 1064 nanometers לקרן לייזר שניתן לכוון לכל נקודה בין 780 nanometers ל-910 nanometers, על ידי הזרעה של שני OPOs נפרדים מאותו מקור של 1064 nanometer. כך מתקבלים שני מקורות לייזר הניתנים לכוונון באופן עצמאי, המסונכרנים אוטומטית ללייזר ההזרעה המקורי שלנו. הקרן השלישית מלייזר ההזרעה של 1064 nanometer מופנית מסביב ל-OPOs באמצעות שילוב של מראות דיאלקטריות, כך שניתן יהיה לאחד את כל שלוש הקרניים מאוחר יותר.על מנת להפיק ביעילות פוטונים קוהרנטיים של אות ראמן (ramen), יש להחפיף את הפולסים המאוחדים הן מבחינה זמנית והן מבחינה מרחבית, מכיוון ש-OPOs מכילים חללי טבעת המאפשרים לכל פולס לייזר לעבור דרך הגביש מספר פעמים; הקרן הנשלחת דרך ה-OPOs עוברת מרחק נוסף, מה שגורם לעיכוב ניכר ביחס לקרן המשאבה המקורית. יש לפצות על מרחק זה באמצעות קרן שלישית, על ידי הכנסת מראות נוספות המאלצות קרן זו לעבור את אותו המרחק כמו שתי הקרניים האחרות לפני שהן מאוחדות באמצעות מראות דיכרואיות, וזאת כדי לאפשר כיוונון עדין של אורך המסלול. כל קרן נשלחת דרך שלבי עיכוב מתכווננים, המאפשרים כיוונון של החפיפה הזמנית בין פולסי הלייזר השונים.סט נוסף של לוחות חצי-גל (half-wave plates) וקוביות של מפליט קרניים מקטב (polarizing beam splitter) מתווספים לכל קרן כדי לאפשר כוונון עצמאי של הספק הלייזר של כל קרן. מראות דיכרואיות משמשות תחילה לאיחוד הקרניים משני ה-OPOs, ולאחר מכן את קרן ה-1064 nanometer; יש להקפיד לוודא שהקרניים חופפות בדיוק במרחב. ניתן לאמת זאת על ידי השוואת חפיפת הקרניים במרחק של סנטימטרים ספורים מהמראה הדיכרואית לעומת חפיפתן במרחק של כמעט מטר מהמראה הדיכרואית.מכיוון שחשיפה לקרני לייזר בעלות הספק ממוצע גבוהה עלולה לפגוע בדגימה, שלושת הקרניים המשולבות מועברות דרך מודולטור אופטי חשמלי המתפקד כבורר פולסים (pulse picker), המאפשר כיוונון של קצב החזרת הפולסים המגיעים לדגימה, ובכך כיוונון של ההספק הממוצע. קרני הלייזר המשולבות מוזנות לאחר מכן לתוך מיקרוסקופ הפוך עם עדשת אובייקטיב בעלת מפתח מספרי גבוה, או na. המיקוד ההדוק הנוצר על ידי עדשת האובייקטיב בעלת ה-NA הגבוה מאפשר את הייצור היעיל ביותר של אותות רמן קוהורנטיים בקני מידה מיקרוסקופיים.עדשת העדשה של המיקרוסקופ מורכבת על במה פייזו (pizo) בצירים X, Y, Z, המאפשרת השגת תמונות על ידי סריקת רסטר (raster scanning) של הקרניים על פני הדגימה, בדומה למיקרוסקופים קונפוקאליים מסחריים עם סריקת קרניים. כעת נראה כיצד להפיק אותות CARS ו-DRFM. האינטראקציה של שלוש קרני לייזר בפולסים קצרים עם הדגימה גורמת להפקה של מספר אותות של ערבוב ארבע גלים (four wave mixing), כגון CARS מהשילובים השונים של שני לייזרים, וכן אותות Three-color CARS ו-DR CARS מהשילוב של שלושת הלייזרים. כאשר האותות קרובים יחסית באורך הגל שלהם, הפרדתם לצורך אנליזה עלולה להיות קשה.מסיבה זו, האותות מועברים לספקטרומטר דימוי המשמש גם כמונוכרומטור או כמסנן מעבר פס (band pass filter) כדי להפריד מרחבית אותות באורכי גל שונים. מראה מתהפכת המופעלת אלקטרונית בתוך הספקטרומטר, במצב מורד, שולחת את האות למצלמת CCD (מכשיר צימוד מטען) בעלת התרוקנוּת עמוקה ותאורה אחורית, המספקת מידע ספקטרוסקופי לכל טווח האותים, ומאפשרת לנו לזהות ולבצע אופטימיזציה לאותות ה-robin הקוהרנטיים השונים כדי לבחור את האות להדמיה. פשוט סובבו את הסריג בתוך הספקטרומטר באמצעות תוכנת הבקרה ורכישת הנתונים המסופקת על ידי הספק כדי למרכז את השיא הרלוונטי במצלמת ה-CCD.לאחר מכן, שנו את מיקום מראת ההיפוך כדי להפנות את האות ליציאה שנייה שבה מחוברת גלאי פוטון בודד מסוג Avalanche Photo Diode (APD) או PD. בצעו סריקת רסטר (Raster scan) של עדשת העדשה, ולאחר מכן השתמשו באותים שהוקלטו ב-APD כדי להפיק תמונה על ידי הצגת קצב ספירת הפוטונים עבור כל פיקסל באמצעות תוכנת רכישת הנתונים. חזרו על הליך הדמיה זה עבור כל אות Raman קוהרנטי רצוי, כך שניתן יהיה להשוות בין האותים במהלך עיבוד הנתונים לאחר הניסוי.כעת נראה כיצד להכין את הדגימה בצורה נכונה כדי לקבל תמונות ברורות הניתנות לשחזור. יש לנקוט במשנה זהירות בהכנת הדגימות. הדגימות מוכנות בדרך כלל על לוחות כיסוי מזכוכית בעובי של כ-150 micron.לוחיות כיסוי אלו דקות מספיק כדי לאפשר דימוי ברזולוציה גבוהה באמצעות עדשות אובייקטיב עם NA גבוה בטבילת מים או שמן, המשמשות בניסויים אלו. כדי להדגים את הכנתו של דגימה טיפוסית, אנו מכינים חתכים בעובי של כ-20 micron של רקמת שריר של עכבר המקובעים לעליית מיקרוסקופ. טיפה של 20 microliter של תמיסת גלוקוז דאוטריום בריכוז five molar מתווספת לדגימה.תמיסת הגלוקוז הדאוטרד מספקת חתימת רקע רמנית ייחודית וחזקה. כיסוי זכוכית (cover slip) מונח מעל הדגימה ומקובע במקומו באמצעות לק ציפורניים עבור התאים והתרבית. ניתן להשתמש בצלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית, המאפשרות דימוג ללא צורך בניתוק התאים מתוך צלחות גידול תרבית התאים שלהם.כעת נראה כיצד לקבוע את פסגות ה-Raman המתאימות עבור Dr cars. כדי לנצל כראוי את אפקט ההגברה של תהודה כפולה, יש להכיר את ספקטרי ה-Raman של שני החומרים הרזוננטיים. בדרך כלל, אלו הם 2,845 inverse centimeters הקשורים לליפידים ו-2,121 inverse centimeters עבור מצב המתיחה של CD הקשור לגלוקוז דויטרי.פיזור רמן קוהורנטי מושג כאשר הפרש התדרים בין שני לייזרים תואם את תדר הרטט המולקולרי. על ידי כיוון של OPO אחד ל-817 nanometers, הוא יבחון את מצב ה-C ב-2,845 inverse centimeters כאשר הוא משולב עם קרן לייזר של 1064 nanometer, ועל ידי כיוון של ה-OPO השני ל-868 nanometers, הוא יבחון את ה-2,121 inverse centimeter כאשר הוא משולב עם קרן ה-1064 nanometer. במצב ספקטרוסקופי, מיקרוסקופ ה-CARS מאפשר לנו לצפות בשלושה אותות רמן קוהורנטיים רלוונטיים: אות CARS הבוחן את רטט המתיחה של CH, אות CARS הבוחן את מצב המתיחה של CD, ואות DR CARS הבוחן את שניהם. בדיאגרמה המוצגת כאן, חצים מקווקווים מציינים פוטונים מהלייזר ב-OPOs וחצים רצופים מציינים את האות שהתקבל.הקווים האופקיים הרצופים מציינים את האנרגיה של רטט הראמן ומספקים ייצוג ויזואלי לכך שבמכוניות DR, ערבוב של אותם שלושה פוטונים קלטים בודק בו-זמנית שני רטטי ראמן שונים. יהיה צורך לבצע אופטימיזציה של עוצמת האות עבור כל שיא על ידי כיוונון בצעדים קטנים סביב מיקומי שיאים אלו. כאן אנו בוחרים בכל שיא ומצלמים תמונות של תולעי sea elgan בתמיסה של גלוקוז מוחדר; הפקת מידע נוסף בהסתמך על שלוש התמונות שהתקבלו בנפרד אלו דורשת עיבוד תמונות פשוט למדי.ראשית, יש לנרמל את התמונות. שיטה מעשית לנרמול מתבססת על העובדה שליפידים הם הידרופוביים. משמעות הדבר היא שבvאזורים בעלי צפיפות ליפידים גבוהה, תהיה לתהודה של ה-CD מהגלוקוז תרומה מועטה מאוד לאות התהודה הכפולה.לעומת זאת, באזורים של תמיסת גלוקוז טהורה, התהודות של CH מהליפידים צריכות לתרום מעט מאוד. בהתחשב בכך, נרמלו את תמונת ה-DR car ואת תמונת ה-car שהתקבלה מהתהודה של CD של תמיסת הגלוקוז הדאוטרביים לאזור שנמצא הרחק מחוץ ל-CL egan's worm, אשר לא אמור להפגין תהודת CH. לאחר מכן, זהו אזור בתוך התולעת בתמונת ה-car בעלת תהודת CH העשיר בליפידים, ונרמלו אותו לאזור המקביל בתמונת ה-DR car המנורמלת.כדי ששיטה זו תעבוד כראוי, נניח שבאזור זה, בעומק, לא נוכח גלוקוז דאוטרלי. זוהי הנחה בטוחה מכיוון שהליפידים הם הידרופוביים ולא יתערבבו עם התמיסה. כעת, על ידי חיסור תמונת ה-car בעלת התהודה של CH הנורמלית מתמונת ה-car בעלת התהודה של DR הנורמלית, נותר רק אות התהודה המוגבר של CD; באופן דומה, על ידי חיסור תמונת ה-car בעלת התהודה של CD הנורמלית מתמונת ה-Dr.FWM הנורמלית.רק האות המהודק של ה-CH נותר; מוצג כאן ספקטרום רמנ של חומצה אולאית שעברה שינוי הכולל מודיפיקציית אלקין. התהודדויות ה-CH החזקות ב-2,845 inverse centimeters והתהודדות האלקין ב-2,121 inverse centimeters מבודדות היטב מאזור טביעת האצבע, שהוא האזור בעל הפסגות הצפופות, מה שהופך אותן לסמנים אידיאליים לדימות רמנ קוהורנטי. זהו ספקטרום טיפוסי של אותות רמנ קוהורנטיים הנוצרים כאשר שלושה לייזרים של פולסים קצרים חופפים בתוך הדגימה. החיצים מצביעים על התהליכים האחראים לכל אות כפי שהם מיוצגים בתרשימי אנרגיה.אלו הן תוצאות טיפוסיות מדימות של תולעי C Elgin באמצעות רכבים מסוג DR ורכבים רגילים. בשורה העליונה נעשה שימוש בשלושת האותות שהוצגו זה עתה כדי לדמות תולעת בתמיסת גלוקוז בריכוז מופחת. בשורה השנייה, התמונות נורמלו באופן מתאים, ובשורה השלישית הופקו תמונות הפרש על ידי הפחתת התמונות של כל רכב מהתמונה של רכב ה-DR. הרגע הצגנו כיצד לבצע דימות הפרש רמאן המבוסס על מיקרוסקופיית antis רמאן קוהורנטית בעלת תהודה כפולה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו שחשוב לוודא שהקרניים חופפות ומסונכרנות כראוי. כמו כן, בעת מעבר בין אותות קוהרנטיים שונים, יש להקפיד לא להזיז או להבליט את הדגימה, שכן הדבר ישפיע על הניתוח. זהו כל הפרוצדורה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: McCullagh, E. A., et al. יישום קוהרנטי של ספקטרוסקופיית רמאן אנטי-סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית וספקטרוסקופיה קוהרנטית של רמאן אנטי-סטוקס (CARS) כדי להמחיש ארכיטקטורה עצבית ברקמת מוח של מכרסמים. צביעת Nissl מסמנת גופי תאים על ידי קשירה ל-RNA ריבוזומלי, בעוד שהדמיית CARS מכוונת למיאלין עשיר בשומנים באמצעות אותות המושרים בלייזר. שכבת תמונות הקרינה וה-CARS מספקת תצוגה מפורטת של גופי תאים ואקסונים מיאליניים.

ספקטרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן להדמיית נוירונים מיאליניים ברקמת מוח של עכבר

מיקרוסקופיה קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) בשילוב עם התקנת זרימה דרך פנימי פירוק כדי לאפשר באתר והדמיה של פני השטח של טבליות תרופות עוברות פירוק בזמן אמת. באמצעות התקנה שהותקן זה, זה אפשרי, כדי לקשר בין סרטוני מכוניות עם פרופילי פירוק תרופה שנרשמו באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגת UV מוטבעת.

פיזור ראמאן (CARS) טבליות קוהרנטית אנטי סטוקס מדמיין מיקרוסקופית תרופות במהלך פירוק

קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן פיזור (CARS) מיקרוסקופיה מבוסס על רטט טבוע של אג"ח מולקולה התיר ללא תווית כימי סלקטיבית הדמית תא חייה. עבודה זו מציגה יישום טכניקה מיקרוסקופיה משלימים על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton התקן על בסיס Ti femtosecond: לייזר ספיר לייזר OPO.

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה סלקטיבית ונטולת תווית של moieties כימיים ספציפיים והיא שימשה ביעילות כדי לדמות מולקולות השומנים ב vivo. כאן, אנו מספקים היכרות קצרה עם העיקרון של מיקרוסקופיה SRS ומתארים שיטות לשימוש בו באחסון השומנים הדמיה ב Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

מאמר זה משווה באופן ישיר את ניגודי הרזולוציה, הרגישות וההדמיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS) ופיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) המשולבים באותה פלטפורמת מיקרוסקופ. התוצאות מראות של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, SRS נותן ניגודים טובים יותר ורזולוציה ספקטרלית טובה יותר, ולשתי השיטות יש רגישות דומה.

השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית

אנו מציגים פרוטוקול לרכישת תמונות כימיות עם מיקרוסקופיית פיזור ראמאן (SRS) בפס רחב. בהתבסס על מיקרוסקופ SRS הפועל עם זיהוי דיפרנציאלי רב-ערוצי-נעילה, הפרוטוקול מתאר את הכנת הדגימה, התאמת מנגנון ה-SRS והכימומטריקה כדי לנטרל מרכיבים שונים של דגימות הטרוגניות מבחינה כימית.

הדמיה כימית מולטיפלקס מבוססת על מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה בפס רחב

הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

תוך שימוש בפלטפורמה רב-מודאלית המשלבת שיטות הדמיה אופטיות ללא תוויות, פיתחנו פרוטוקול להדמיה וכימות של דינמיקה תאית וחילוף חומרים. באמצעות הדמיה באמצעות פלואורסצנציה רב-פוטונית, דור הרמוני שני ומיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה, אנו יכולים ליצור סקירה הוליסטית של הסביבה התאית והמולקולרית.

פלטפורמת הדמיה אופטית מולטי-מודאלית לחקר חילוף החומרים התאי

למד שיטת דימוי דיפרנציאלי של תהודות ראמאן ביולוגיות באמצעות לייזרים מסונכרנים ל-CARS ו-DR-CARS. טכניקה זו משפרת רגישות לאיתותים חלשים ומאפשרת הדמיה כימית ספציפית של תאים חיים.

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

גלה סרטונים נוספים