Name: משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למד את שיטת tkRNAi להשתקת גנים בתאי סרטן באמצעות חיידקי E. coli. שיטה זו מאפשרת הפיכת עמידות רב-תרופתית ושיפור יעילות הטיפולים האונקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי מענק לא. 01GU0615 של &quot;Bundesministerium für und Forschung Technologie (BMBF).

1) משלוח חיידקית של shRNAs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים עם התרבות חיידקים, יש להכין LB-בינוני LB-אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור LB-בינוני לשקול את תמצית שמרים (0.5% w / v), bacto tryptone (1.0% w / v), ואת NaCl (0.6% w / v) לדלל ברכיבים אלה אקווה bidest. הפתרונות צריכים להיות מוכנים לעקר ב החיטוי והם אז מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור LB-צלחות אגר אגר bacto (1.5% w / v) יש להוסיף עד בינוני LB הקודם עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים LB-אגר במיקרוגל עד LB-אגר הוא נמס לגמרי. בואו הפתרון להתקרר עד שהבקבוק יכול להיות נגע בקלות מבלי להישרף. הוסף kanamycin (100 מ"ג / מ"ל) עבור הבחירה של שיבוטים חיובי צעדים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LB-אגר צלחות על ספסל זרימה למינרית (בתנאים סטריליים) על ידי pipetting 20 מ"ל של תמיסת LB-אגר לתוך 10 ס"מ פטרי, הכלים. בואו הצלחות להתקרר עד הנוזל הפך מוצק. הצלחות מוכנים כעת לשימוש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ShRNA קידוד וקטורי ביטוי הופכים E. המוסמכת coli ceq221 ידי הלם חום באמצעות ההליך CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט את החיידקים שינו על צלחות LB-אגר המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin, לסגור את המכסה, לאטום את צלחות עם parafilm ולטפח במהופך על 37 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבויות מיני חיידקים עם שיבוטים חיובית על ידי הרמת מושבות גדלו עם לבחור השן. העברת השן לאסוף לתוך 7.0 מ"ל של מדיום LB-טריים המכילה 100 מ"ג / מ"ל ​​kanamycin ולטפח ב 37 ° C במשך הלילה על שייקר בסל"ד 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 100 מ"ל של LB טרי בינוני המכיל 100 מ"ג / מ"ל ​​kanamycin 1:100 עם תרבות הלילה מעל מיני בקבוקון 1 אני Erlenmeyer ו לדגור על 37 ° C במשך הלילה על שייקר בסל"ד 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 25 x 10 4 (מספר התאים זורעים תלוי במהירות של צמיחת תאים של הקו הסלולרי בהתאם; confluency צריך להיות 70-80% ~ 24 שעות לאחר זריעה) אנושי לתאי סרטן קיבה (EPG85-257RDB) לכל היטב 6 - מנות היטב דגירה אלה ב 37 ° C, באווירה של 5% CO 2, אדי מים רוויים במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקודם לזיהום תאים סרטניים, על תרבויות לילה של TK RNAi וקטור המכיל E. coli נמדדים פוטומטר כדי לקבוע את OD 600. לדלל את הפתרון חיידקי עד צפיפות אופטית של 0.5 הוא הגיע (OD 600 = 0.5 שווה 1.6 x 10 8 תאים חיידקיים / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את FCS המכיל תרבית תאים בינוניים קרצינומה של תאים נגד בינוני FCS ללא 30 דקות הקודמים חיידקי שיתוף הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיידקים פעמיים עם 1 x PBS, וכן לדלל בסרום ללא בינוני ליבוביץ L-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חיידקים בדילול לתאי הסרטן הרצוי משרד הפנים (ריבוי זיהום = מספר תאים חיידקיים לכל תא סרטני) ושיתוף דגירה חיידקים תאים סרטניים עבור 2 שעות 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות של שיתוף הדגירה תאים סרטניים נשטפו פעמיים עם 1x x PBS ופעם עם סרום המכיל בינוני ליבוביץ L-15 בתוספת 100 u / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin, 150 מיקרוגרם / גנטמיצין מ"ל, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך טיפוח תאים סרטניים ב 37 ° C, באווירה של 5% CO 2, אדי מים רוויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשפעות של הטיפול חיידקים ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, נמדדת כמותית בזמן אמת RT-PCR על רמת ה-mRNA, ועל ידי ניתוח כתם המערבי על רמת חלבון, מוצג עם מבחני פונקציונלי כמו ניתוח FACS, ושגשוגם מבחני התא. (אם רוצים, הליכים אלה יכול להיות מתואר בפירוט). </li></ol> 2) נציג תוצאות אם פרוטוקול מבוצעת כראוי, התוצאה הייתה צריכה להיות דומה לאלה המוצגות להלן. מיקרוסקופ פלואורסצנטי איור 1 מציג תא אנושי קרצינומה של הקיבה שלוש שעות לאחר הטיפול חיידקים (א) בהשוואה תא מטופל (ב). מסביב לגרעין התא טיפול, החיידקים יכולים להתגלות. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: מיקרוסקופ פלורסנט האדם קיבה קרצינומה של תאים לאחר טיפול חיידקי (1:500) וגם תא מטופל אנושי קרצינומה של הקיבה כמו שליטה, DAPI-מכתים, DAPI bandpass מסנן (Λem = 640 ננומטר), מטרת 40X. כמותי בזמן אמת RT-PCR באיור 2 תקנה את ה-mRNA של MDR1 של כ -70% (קרן שחור) ניתן לראות לאחר טיפול עם חיידקים טיפולית. תאים הורים לשמש כביקורת חיובית בשל חוסר overexpression MDR1. השורה תא 257RDB p170 המכיל פלסמיד המבטא אנטי MDR1 shRNAs s נלקח השוואה ישירה של הטכנולוגיה transkingdom RNAi למחקר אחריםנאי השתקה אסטרטגיות. הקו מטופל תא עמיד EPG85-257RDB overexpressing MDR1, קו התא אותו שטופלו חיידקים חסר shRNA להביע פלסמיד, וזה קו תאים שטופלו חיידקים טיפולית נושא פלסמיד המבטא אנטי MRP2 shRNAs נלקחו כפקדי חיובית. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: כמותי בזמן אמת RT-PCR ביטוי MDR1 mRNA לאחר טיפול ה טיפולית coli ceq221 להביע אנטי MDR1 shRNAs (משרד הפנים 1: 500). נורמליזציה בוצעה באמצעות aldolase גן משק הבית. היחס MDR1/aldolase של תאים שלא טופלו של הקו הסלולרי EPG85-257RDB נקבעו 100%. P-ערכים חושבו באמצעות התלמיד מבחן t (= * p &lt;0.05, ** = p &lt;0.005, *** = p &lt;0.001). ניתוח כתם המערבי איור 3 מגלה כי MDR1 למטה תקנה גם התקיים ברמת חלבון לאחר הטיפול חיידקים. הוא מציג את MDR1 חסר הבעה של שורת תאים רגישים סמים הורים (EPG85-257P), הביטוי MDR1 של קו תא מטופל עמידים תרופה (EPG85-257RDB) ואת הביטוי MDR1 המדגם טופלו. תקנה מטה ברורה של MDR1 של תאים שטופלו bacterially ניתן לצפות. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3: ניתוח כתם המערבי MDR1 רמות הביטוי של מטופל לתרופה רגיש EPG85-257P, מטופל עמידים לתרופות-EPG 257RDB, ושל EPG85-257RDB לאחר דגירה משותפת עם א. coli ceq221 + P43 MDR1. ראשי Ab C219 1:100, אנטי אקטין 01:05 000, משני Ab נגד עכבר 01:10 000. Cytotoxicity assay אנליזה פונקציונלית כמו assay cytotoxicity שמוצג באיור 4 הם גם אינדיקטורים לתפקוד של RNAi transkingdom. השורה תא ההורים קו התא המכיל אנית-MDR1 shRNA להביע פלסמיד לא מראים שום התנגדות daunorubicin. השורה תא עמיד EPG85-257RDB ושני שולטת עוד לא מראים שינויים משמעותיים התנגדות לעומת המדגם שטופלו נגד חיידקים MDR1 shRNA מביע בו התנגדות Daunorubicin יכול להיות הפוך על ידי כ -90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4: assay cytotoxicity. תרופות ספציפיות IC50 ערכי נקבע על ידי assay cytotoxicity להישרדות התא. P-ערכים חושבו באמצעות התלמיד מבחן t (= * p &lt;0.05, ** = p &lt;0.005, *** = p &lt;0.001). Anthracycline assay הצטברות על פי ההתנגדות הוריד דוגמאות ליחס bacterially (איור 4), הצטברות anthracycline של אנטי MDR1 תאים שטופלו shRNA הוא גדל על ידי כ -90% כפי שמוצג באיור 5. השורה תא ההורים את קו תא 257RDB p170 מראים הצטברות daunorubicin חזק עד 100%. וריאנט עמיד מראה נדיר כל הצטברות. תאים שטופלו נגד חיידקים MDR1 shRNA להביע מצביעים על עלייה הצטברות anthracyline של 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5: assay anthracycline הצטברות. Anthracycline הצטברות של תאים קרצינומה של 6 ימים לאחר הטיפול חיידקים נמדדת cytometry הזרימה. P-ערכים חושבו באמצעות התלמיד מבחן t (= * p &lt;0.05, ** = p &lt;0.005, *** = p &lt;0.001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מספר תא זרע עבור זיהום הפנים המקביל בשימוש, ביקורתי תלוי שורות תאים תחת תצפית מהירותם של צמיחה. כדי למצוא מספרים תא האופטימלי עבור זריעה, טרום ניסויים כדי לקבוע את המהירות של הצמיחה מומלץ מאוד. מלבד זאת, MOIs שונים יש לבדוק בשל מוגבלת להאריך אשר התאים יכול לסבול את הפלישה חיידקי בלי למות של מתח. נקודת הזמן האופטימלי שבו תקנה את הגן תחת השגחה עשוי להשתנות. מומלץ לבצע ניסויים על פני תקופה מסוימת של זמן כדי למצוא את התנאים האופטימליים.

<table><tbody><tr><td>אגר</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>אין מספר קטלוג זמין, הזמנה ישירה</td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>מכיל 5,000 יחידות של פניצילין (base) ו-5,000 &amp;mu;g של סטרפטומייצין (base)/ml תוך שימוש ב-penicillin G (sodium salt) ו-streptomycin sulfate במי מלח 0.85%.</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

משלוח חיידקית של rnai effectors: transkingdom rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

התערבות RNA (RNAi) מהווה מנגנון אפקטיבי גבוה עיכוב מסוים של ביטוי ה-mRNA. מלבד הפוטנציאל שלו ככלי מעבדה עוצמה, מסלול RNAi נראה מבטיח ניצול טיפולית. עבור פיתוח של התערבות RNA (RNAi) טיפולים מבוססי, המסירה של RNAi-בתיווך סוכני לתאי המטרה היא אחד המכשולים העיקריים. אסטרטגיה הרומן להתגבר על המשוכה הזאת הוא transkingdom RNAi (TK RNAi). טכנולוגיה זו משתמשת פתוגניים שאינם חיידקים, למשל Escherichia coli, לייצר ולספק טיפולית מכבנה RNA קצר (shRNA) לתאי מטרה לגרום RNAi. הדור הראשון TK-RNAi מתווך, טיול וקטור, מכיל את מקדם T7 bacteriophage להסדרת ביטוי shRNA טיפולית של עניין. יתר על כן, תשמ&quot;ה אינו מוקד Inv מ pseudotuberculosis Yersinia המקודד invasin, המאפשר לחיידקים פולשנית טבעי להיכנס β1-integrin חיוביים בתאי יונקים ואת הגן HlyA מ חיידקי ליסטריה, אשר מייצרת listeriolysin O. אנזים זה מאפשר shRNA טיפולית לברוח כניסה שלפוחית ​​בתוך הציטופלסמה של תא המטרה. בונה תשמ&quot;ה מוכנסים זן המוסמכת Escherichia coli שאינם פתוגניים, אשר מקודד T7 RNA פולימראז הכרחי לסינתזה T7 האמרגן מונחה של shRNAs. היטב מאופיין סרטן הקשורים מולקולה יעד שונים אסטרטגיות RNAi הוא ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). זה טרנספורטר-ABC משמש משאבה תרופה שחול ומתווך &quot;קלאסיים&quot; ABCB1 בתיווך multidrug ההתנגדות (MDR) הפנוטיפ של תאים סרטניים אנושיים אשר מאופיינת דפוס לחצות התנגדות ספציפית. ABCB1-לבטא בתאי סרטן שונים MDR טופלו אנטי ABCB1 וקטור shRNA ביטוי נושאות E. coli. הליך זה הביא הפעלת המסלולים RNAi בתוך התאים הסרטניים תקנה מטה ניכר של mRNA ABCB1 את הקידוד כמו גם את המשאבה המתאימה שחול סמים. בהתאם לכך, הצטברות התרופה היה משופר של עמידות לתרופות בתאים סרטניים וטהור לבין פנוטיפ MDR התהפכה. באמצעות מודל זה הנתונים מספקים הוכחה של קונספט זה TK RNAi מתאים אפנון של סרטן הקשורים גורמים, כגון ABCB1, בתאי סרטן אנושיים.

עבור פיתוח של התערבות RNA (RNAi) טיפולים מבוססי, אסטרטגיה רומן פותחה, transkingdom RNAi (tkRNAi). טכנולוגיה זו משתמשת פתוגניים שאינם חיידקים כדי לייצר ולספק טיפולית מכבנה RNA קצר (shRNA) לתאי המטרה. כאן, tkRNAi יושמה בהצלחה היפוך ההתנגדות ABCB1 בתיווך קלאסית multidrug (MDR) של תאים סרטניים.

משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi

השתקת RNA‏ (RNA interference - RNAi) מהווה מנגנון יעיל ביותר לעיכוב ספציפי של ביטוי mRNA. מעבר לפוטנציאל שלה ככלי מעבדתי רב-עוצמה...

בשיטת ה-trans kingdom RNA interference, או הליך RNAi, נעשה שימוש בחיידקים להחדרת shRNA (RNA בעל מבנה של סיכת ראש) או RNA המכוון נגד הגן רצוי MDR1 לתאי סרטן, במטרה להשתיק את הגן הרצוי באמצעות RNAi. ראשית, חיידקי E. coli עוברים טרנספורמציה עם וקטור המבטא shRNA. לאחר מכן, תאי סרטן חיוביים ל-Beta 1 נזרעים כך שצפיפות התאים תהיה 70% עד 80% כעבור 24 שעות מהזריעה. בשלב הבא, החיידקים המבטאים את ה-shRNA והתאים מדגריים יחד במשך שעתיים.לבסוף, הדגירה המשותפת מסתיימת על ידי טיפול באנטיביוטיקה של תאי הסרטן. התוצאות מראות דה-רגולציה (downregulation) של הגן הנבדק ברמת ה-mRNA, החלבון והרמות הפונקציונליות, באמצעות real-time PCR, אנליזת Western blot, בדיקות תרביית תאים ובדיקות הצטברות של תרופות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני הליכים סטנדרטיים אחרים, כגון טרנספקציה של S-I-R-N-A באמצעות oligo effect mean, הוא ההספקה היעילה והישירה של irna אל תאי המטרה.טכנולוגיית Trans Kingdom RNAi, או TK RNAi, משתמשת ב-E. coli לא פתוגני כדי לייצר ולהחדיר RNA בעלת מבנה סיכת ראש קצרה טיפולית (short hairpin RNA) או shRNA לתאי מטרה כדי להשרות RNAi. וקטור או trip המתווך TK RNAi מהדור הראשון מכיל את הפרומוטור של הבקטריופאג T7 לבקרת ביטוי של shRNA טיפולית רצויה. יתרה מכך, ה-trip מכיל את הלוכוס INV מ-Yersinia pseudotuberculosis המקודד לאינוואזין (invasin), המאפשר לחיידקים לא פולשניים להיכנס לתאי יונקים חיוביים לבטא-1 אינטגרין (beta one integrin).Tripp כולל גם את hli, גן מ-listeria monocytogenes, המייצר listeria lysin O. אנזים זה מאפשר ל-HRNA הטיפולי להימלט מוובוסילי הכניסה בתוך הציטופלזמה של תא המטרה. מבני Trop מוכנסים למערך competent של שבט esia coli שאינו פתוגני, המקודד ל-T seven RNA polymerase הדרוש לסנתזה של SH RNAs המונעת על ידי פרומוטר T seven. החיידקים והתאים העקריים מדגריים יחד (co-incubated), מה שמאפשר לחיידקים להיכנס לתאים העקריים.ה-SH RNAs משתחררים ונכנסים למסלול RNAi. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו תרבית של חיידקי e coli שטרנספורמציה שלהם בוצעה עם גורם המשפיע על ביטוי S-H-R-N-A בתרבית לילה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ביום שלפני. להדגרת החיידקים עם תאי המטרה, זרעו 25 × 10⁴ תאי קרצינומה של הקיבה אנושית לכל באר בצלחות בעלות שש בארות.מספר התאים המוזרעים תלוי בקצב הגדילה של שלב התאים; תכננו את זמן הזריעה כך שהצפיפות תהיה כ-70 עד 80% לאחר 24 שעות. לאחר הזריעה, דגרו את התאים המוזרעים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה רוויה באדי מים ו-5% carbon dioxide למשך הלילה. לפני תחילת ההדבקה של תאי הסרטן, מדדו את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה של e coli המכיל את וקטור ה-TK RNAi.קבעו את ה-OD 600, ודללו את התמיסה הבקטריאלית לצפיפות אופטית של 0.5 כ-30 דקות לפני האינקובציה המשותפת של הבקטריות. החליפו את מצע תרבית התאים של תאי הקרינומה המכיל FCS במצע ללא FCS במהלך פרק זמן זה של 30 דקות. שטפו את הבקטריות פעמיים עם PBS 1x על ידי סרCיפוגציה במהירות של 4,000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, וסספנדו אותן שוב ב-PBS ללא סרום.L 15, עד לנפח הדילול המקורי. לאחר השעיית החיידקים וסיום דגירת התאים למשך 30 דקות, הוסיפו את החיידקים לתאי הסרטן בריבוי זיהום (multiplicity of infection) רצוי או MRI, שצריך להיות בטווח של 1:300 עד 1:700. דגרו את החיידקים ותאי הסרטן יחד למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה רוויה באדי מים וב-5% carbon dioxide.לאחר שעתיים של דגירה משותפת, שטפו את תאי הסרטן פעמיים עם 1x PBS ופעם אחת עם סרום המכיל רכיבי מעבדה. מצע L 15 מועשר ב-100 units/mL פניצילין, 100 µg/L סטריפטומייצין ו-2.5 µg/mL.Amphotericin B בריכוז 150 µg/mL ו-gentamicin בריכוז 100 µg/mL. ניתן להמשיך בגידול תאי הסרטן בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה רוויה באדי מים עם 5% CO2. ניתן להדגים את השפעות הטיפול הבקטריאלי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, למדוד אותן באמצעות quantitative real-time RT-PCR ברמת ה-mRNA, ולבחון אותן באמצעות אנליזת Western blot.ניתן להשתמש גם בבדיקות תפקודיות כגון אנליזת fax ובדיקות שגח של תאים. תמונה מייצגת זו צולמה שלוש שעות לאחר הדגרה של תאי קרצינומה של הקיבה אנושית עם חיידקים המבטאים טיפול. ניתן לזהות חיידקי S-H-R-N-A מסביב לגרעין של התא המטופל.בניסוי זה, נבדקה דה-רגולציה (downregulation) של ביטוי הגן העמיד לריבוי תרופות MDR1 באמצעות realtime PCR. ניתן להבחין בדה-רגולציה של mdr1 mRNA בשיעור של כ-70% לאחר טיפול בחיידקים טיפוליים. דה-רגולציה של MDR1 התרחשה גם ברמת החלבון לאחר הטיפול החיידקי.רמות חלבון ה-MDR one פחתו עם הזמן בהשוואה לשורת התאי הבקרה. ניתוח תפקודי המבוסס על תוצאות בדיקת הציטוטוקסיות המוצגת כאן יכול לשמש כאינדיקטור לתפקוד של ה-RNAi חוצה-ממלכות, בעוד ששורת תאים עמידה לתרופות אינה מגיבה לתרופה נגד הסרטן. למטה, אותה שורת תאים שהודבקה בחיידקים שהועבר להם פלסמיד המבטא anti MDR one S-H-R-N-A רגישה לתרופה.לבסוף, בבדיקת הצטברות אנתרציקלין, שורת התאים העמידה לסרטן הראתה הצטברות נמוכה של תרופות לסרטן, כפי שנצפה בתאים העמידים לסרטן שטופלו ב-MDR one SHRA לאחר שהטכניקה נשלטה. ניתן ליישם טכניקה זו בתוך 28 שעות אם היא מבוצעת כראוי בהתאם לנוהל זה. ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון R-T-P-C-R, על מנת לענות על מספר שאלות, כגון ההשפעות הרגולטוריות על הגן הנחקר.לאחר צפייה בסרטון זה, תגובבו על האופן שבו ניתן ליישם אינטרפרון RNA חוצה-ממלכות באמצעות אינקובציה משותפת של חיידקים המבטאים hRNA ותאי יונקים רגישים.

bacterial-delivery-of-rnai-effectors-transkingdom-rnai

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

אנו מתארים שיטה להפיל ביטוי גנים באוכלוסייה הולכת וגדלה של תאי E. coli באמצעות קלטות ביטוי sRNA ממוקדות רצף המועברות על ידי וקטור פגמיד M13.

משלוח בתיווך הפאג של ממוקדת Srna בונה להפיל Gene Expression ב<em&gt; E. coli</em

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

בסרטון הזה, אנו מראים נוהל משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך הרקמה לחיות עם אקדח גנים רומן זעיר. אנחנו מפילה את הביטוי של מולקולות הנחיה Netrin האקסון בעוברים עלוקה על ידי אספקת מולקולות של dsRNA בקיר גוף הגחון ועל הגרעינים של מגזרים בודדים.

לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא

למד את שיטת tkRNAi להשתקת גנים בתאי סרטן באמצעות חיידקי E. coli. שיטה זו מאפשרת הפיכת עמידות רב-תרופתית ושיפור יעילות הטיפולים האונקולוגיים.

משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi

גלה סרטונים נוספים