בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל
15 באוקטובר 2010
פרוטוקול זה דן חי דיסקציה של תסיסנית הזחלים לצורך הדמיה התנועה של שלפוחית GFP axonal מתויג על הפסים microtubule.
במטרה לבחון האם פגמים בהובלה אקסונית למרחקים ארוכים קיימים במחלות נוירולוגיות כגון מחלת אלצהיימר או מחלת הנטינגטון. הובלה אקסונית של וסיקולות הובלה נדגמת באמצעות דימוי בתוך לבה של ושט חי. כאן נבחן זאת.
שלישית, זחלים של כוכבי ים המבטאים חלבון פיזי המסומן ב-A GFP מבודדים על קוביית ג'ל, ולאחר מכן מועברים למיקרוסקופ לצורך דימוי in vivo. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה משמשת לאחר מכן למעקב אחר הובלה פיזית בתוך האקסון. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת להדמיות של תנועה חיה ובלתי מופרעת של שלפוחיות סינפטיות ובאקסונים של זחלים.
היערכו לניתוח על ידי וידוא שכל האספקה והריאגנטים הבאים נמצאים בהישג יד. באפר ניתוח. קוביית Sill guard חתוכה לרוחב של one inch, אורך של one inch וגובה של one centimeter, המונחת על תזריקת זכוכית.
סיכות ניתוח קצרות במיוחד. החלק התחתון והחד של סיכות manum פועל בצורה הטובה ביותר בניתוח. ניתן להגיע לאורך הנכון על ידי החדרת סיכות ארוכות יותר לתוך הג'ל וחיתוך של כל חלק מהסיכה שבולט החוצה.
יהיה דרוש לכם גם זוג מספרי מיקרו-דיסקציה חדים, ושתי ערכות של פינצטות בעלות קצה עדין. השתמשו בשפכטל מתכת קטן כדי להעביר זחלי כוכב שלב שלישי המבטאים חלבון SLE המסומן ב-GFP אל צלחת פטרי.
בשלב הבא, יש להוסיף מים דה-יוניים לזחלים בצלחת הפטרי כדי להסיר את כל השאריות של המזון. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו אותם לקוביית ג'ל לדיסקציה כדי לבצע את הדיסקציה בחיים. השתמשו בפינצטה כדי להעביר זחל לקוביית הג'ל לדיסקציה.
הוסף למס chipset זכוכית תמיסת דיסקציה כדי להטביעה. לאחר מכן, הצמד את הלרווה בפיים הקדמיים והאחוריים כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה, בצע חתך קטן בקו האמצע קרוב לקצה האחורי.
מחתך זה, בצעו חתך נוסף עד לחלק הקדמי. מעיי המערכת העיכולית וגופי השומן יבלטו החוצה; השתמשו בשני סיכות כדי לקבע את קשרי השריון הגזורים מהקצוות הצדיים לקוביית התמיכה (sil guard cube).
השתמשו בפיפטה כדי להוסיף טיפה של תמיפת ניתוח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להסיר בזהירות את מעי המערכת והגופי השומן. הצמידו נייר ניגוב (Kimwipe) לצד אחד של הזחילה כדי להסיר את התמיפה, ובמקביל הוסיפו תמיפת ניתוח טרייה באמצעות פיפטה.
הלבה לא תהיה יבשה בשום שלב. כדי לסמן מבנים מיטוכונדריאליים או ליזוזומליים בלבה, החליפו את תמיסת הדיסקציה בתמיסת דיסקציה המכילה mito tracker או lyo tracker. הניחו את קוביית הדיסקציה בתא לחות ריבועי וכסו אותה בנייר אלומיניום.
דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירת הסמן in vivo, ספגו שוב ושוב את תמיסת הדיסקציה הסובבת את הזחלים והוסיפו תמיסת דיסקציה נוספת בעזרת פיפטה. חזרו על פעולה זו חמש פעמים כדי לשטוף שאריות של סמן.
לאחר החלפת השטיפה האחרונה, דחפו את הסיכות באופן מלא לתוך מגן ה-S והניחו מיד זכוכית כיסוי כדי למנוע תנועה של הלרבה. הלרבה מוכנה כעת לתצפית. כדי לבצע דימוי חי של הלרבה המנוסחת, הניחו את הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך לצורך דימוי של וסיקולות מסומנות.
בתוך עצבים סגמנטליים של פגית. בצעו הדמיה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 100 פעמים. אם נצפה צביעת GFP חזקה בגופי התאים בתמונת הגנגליון הוונטרלי, ניתן להדמות את העצבים הסגמנטליים באמצעות מערכת תצוגה כפולה עם פילטרים עבור C-F-P-Y-F-P או R-F-P-Y-F-P ותוכנת תצוגה מפוצלת (split view) כדי לצפות בו-זמנית בשני חלבונים מתויגים in vivo.
בסדרת צילומי Time lapse זו נראים שלפוחיות אקסוניות רבות על מסלולים אקסוניים רבים בתוך עצב סגמנטלי של זחל. שימו לב כי ה-GFP מייצג הצטברויות אקסוניות; שימו לב גם לתנועה הדו-כיוונית של השלפוחיות. כאן נראית תנועה של שלפוחיות אקסוניות על מסלול בודד בתוך עצב סגמנטלי של זחל.
שימו לב, התנועה הדו-כיוונית של מבנים אלו היא בממוצע מיקרון אחד לשנייה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו מבצעים דיסקציה נקייה לצפייה in vivo בוריקולות המסומנות ב-GFP ובאקסונים של זחלים ב-gsof.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה דן בהב dissection (הסרה) חיה של פשעת Drosophila לצורך הדמיה של תנועת שלפוחיות אקסוניות המסומנות ב-GFP על גבי מסלולי מיקרוטובוליים. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה של תנועה חיה ובלתי מופרעת של שלפוחיות סינפטיות בתוך אקסונים של פשעת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- הובלה אקסונלית חיונית לתפקוד נוירונלי.
- ליקויים בהסעה אקסונית קשורים למחלות נוירולוגיות.
- זחלי דרוזופילה (Drosophila) משמשים כאורגניזם מודל לחקר תהליכים אלו.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת תצפית בזמן אמת על תנועת וזיקולות.
מטרת המחקר
- לבדיקת פגמים בהסעה אקסונלית למרחקים ארוכים.
- להבנת המשמעויות של פגמים אלו במחלות נוירולוגיות.
- לשימוש בטכניקות של דימוי חי (live imaging) לצורך תצפית משופרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של פשקי Drosophila המבטאים חלבונים המסומנים ב-GFP.
- העברה של הפשקים המודקצעים לקוביית ג'ל לצורך יציבות.
- דימות in vivo באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מעקב אחר הובלת שלפוחיות בתוך אקסונים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של הובלה אקסונלית בפגות חיות.
- הדגמה של תנועת וסיקולות המסומנות ב-GFP.
- תובנות לגבי הדינמיקה של הובלת וסיקולות סינפטיות.
- השוואה לשיטות קיימות המדגישה את היתרונות של גישה זו.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר הובלה אקסונלית.
- דימוג חי חושף תובנות קריטיות לגבי תפקוד נוירונלי.
- ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור מצבים נוירולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הבנת הדינמיקה של הובלה אקסונית היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות טיפוליות למחלות ניוורו-דגנרטיביות, שכן פגמים בתעבורת שלפוחיות מקושרים באופן מכניסטי למחלות אלצהיימר, הנטינגטון ו-ALS. מודל זה של אקסון בזחלי Drosophila מאפשר ויזואליזציה בזמן אמת של תנועת שלפוחיות סינפטיות, ומספק מערכת ניבויית הרלוונטית למחלה לצורך תיקוף מוקדם של מטרות והשגת תובנות מכניסטיות. באמצעות כימות של קצב ההובלה ושל זרימת השלפוחיות הדו-כיוונית, השיטה תומכת בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בתוכניות פרה-קליניות המתמקדות בשמירה על שלמות האקסון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של מעבר של APP או סינפטוטגמין (synaptotagmin) מתויגים ב-GFP בתוך שלוחות עצביות (axons) חיות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות טיפוליות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקת שלפוחיות במערכת הניתנת למניפולציה גנטית.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור בין פגמים בהובלה לבין תפקוד עצבי לקוי במודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות אקסוניות מאושרות לסריקת תרכובות על ידי קביעת קו בסיס של ניידות שלפוחיות בתנאים פיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: אספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של תנועת שלפוחיות (למשל, זרימה דו-כיוונית של 1 µm/s) לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר זרימות עבודה של דימוג הניתנות להרחבה ותואמות לפלטפורמה לצורך הערכת השפעת תרכובות על הובלה אקסונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מידול פגמי הובלה שנצפו במצבים נוירודגנרטיביים בבני אדם.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות דימוי חי של הובלת שלפוחיות בעצבים שלםים בזחליים.
- הפחתת סיכונים: מסייע בקבלת החלטות לגבי קידום השלב הבא על ידי כימות הצלה או החמרה של ההובלה על ידי מודולטורים מועמדים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, והיא תומכת בבדיקת היפותזות בשלבי גילוי מוקדמים, בהכנת מערכי בדיקה (assay readiness) לסריקות, ובתיקוף מנגנוני בשלבים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של הובלת שלפוחיות בתגובה להפרעות גנטיות או פרימקולוגיות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של נתיחה, צביעה והדמיה המניבים מדדי ניידות עקביים של שלפוחיות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (מהירות, כיווניות, שטף) המאפשרות השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של פגמים בהובלה אקסונית הרלוונטיים למחלות נוירולוגיות אנושיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת הדמיה לשימוש חוזר עבור מחקרים אורכיים של שלמות אקסונית על פני מספר קבוצות מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של דינמיקת שלפוחיות סינפטיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות תנאי באפר דיסקציה ופרמטרי הדמיה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהיפותזות של הובלה אקסונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על יעילות ההצלה של ההובלה במודלים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, במיקרו-דיסקציה ובמיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- תלוי במיקרוסקופ הפוך עם עדשה של 100x, מערכת תצוגה כפולה (dual-view) וערכות מסננים מתאימות עבור GFP ופלואורופורים אחרים.
- מחייב סטנדרטיזציה של בופר הדיסקציה, שלב הזחליים ובקרות סביבתיות (תא לח, טמפרטורה).
- שיקולי התאמה כוללים ביטוי של מטענים שונים המסומנים ב-GFP (למשל, מיטוכונדריה, ליזוזומים) באמצעות מניעי GAL4 נוירונליים.
- מגבלות מעשיות כוללות את זמן הכנת הזחליים ואת חלון הזמן של 2–3 שעות להובלה יעילה של וסיקולות לאחר הדיסקציה.
