Name: בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למד הדמיה של תנועת שקיקים סינפטיים בתוך אקסונים של זחלי Drosophila באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצניה. שיטה זו מאפשרת מעקב חי בזמן אמת אחר תהליכי תחבורה אקסונלית ומסייעת בחקר מחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב באפלו ומ ג&#39;ון ר Oishei קרן. ח&quot;כ נתמך על ידי פרס תלמיד מחקר על ידי CURCA ב UB.

1. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכנת המאגר לנתיחה על ידי הוספת מרכיבים הבאים: 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 מ"מ MgCl 2, 2mm KCl, HEPES 5mm, סוכרוז ו 36 מ"מ 1000 PH, 7.2 מ"ל ל ולסנן לעקר. </li></ol> 2. הכנה Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוביית Siligard: ג'ל הוא לחתוך סנטימטר בערך רחב, 1 אינץ ארוך על 1cm גבוהה. הקוביה הג'ל מושם על זכוכית שקופית במהלך לנתיחה. קוביות ניתן להשתמש יותר מפעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכות: סיכות המשמש לנתיחה צריך להיות תוספת קצרה. החלק התחתון של סיכות חדות minutien עובד הכי טוב לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זקוק חד באביב מספריים microdissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צריך שני מלקחיים היטה בסדר. </li></ol> 3. אוסף של הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנודד 3 rd הזחלים instar כי מביעים GFP חלבון מתויג שלפוחית ​​נאספים על גבי צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחלים נשטפים במים deionized להיפטר כל האוכל. </li></ol> 4. דיסקציה חיים של זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחל מועבר קוביית לנתיחה ג'ל על זכוכית שקופית. הזחל הוא שקוע בתוך חיץ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Larva היא שואפת את הקדמי ואת האחורי באמצעות שתי סיכות בסדר עם הצד הגבי למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים microdissection, חתך קטן הוא עשה את קו האמצע לקראת סוף האחורי. מתוך חתך זה לחתוך נעשית דרך הקדמי. באמצעות שתי סיכות, להצמיד את לציפורן לחתוך בשולי לרוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של ביתור חיץ. הסר בזהירות את הבטן, המעיים וגופים שומן עם מלקחיים. רוב הרקמות הללו בדרך כלל לטפטף החוצה במהלך חיתוך הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את החיץ עם חיץ לנתח טריים. הזחל לא צריך להיות יבש כל הזמן צריך להיות ביתור חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubations משתמש MitoTracker סמנים LysoTracker vivo או נעשים בשלב זה, על ידי דילול בסמן vivo במאגר לנתיחה. לאחר דגירה של בטוש vivo לשטוף את הזחל גזור כמה פעמים (5 שוטף ומהיר) באמצעות חיץ לנתח טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלפת לשטוף האחרונה לדחוף את הסיכות לתוך syligard ומיד coverslip. הזחלים עכשיו הוא מוכן לצורך השגחה. </li></ol> 5. הדמיה חיה של הזחלים גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslip וג'ל לבמה מיקרוסקופ ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים העדשה 100x אל שלפוחית ​​תמונה מתויג בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. ביטוי של GFP בגופם של תא גנגליון הגחון מוערך הראשון לפני עצבים סגמנטלי הם צילמו. אם מכתים GFP חזקים הוא ציין את הגופות תא גנגליון הגחון, עצבים הם צילמו אז בשימוש לצורך הערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מערכת תצוגה כפולה עם מסננים עבור CFP / או YFP RFP / YFP ולהציג תוכנה לפצל אנחנו יכולים בו זמנית two תמונה חלבון מתויג in vivo. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1:. תמונה מייצגת מראה שלפוחית ​​axonal רבים על מסלולים רבים בתוך axonal עצב סגמנטלי הזחל הערה כתמים של ה-GFP, המייצג הצטברויות axonal. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: תמונת מראה נציג מסלול axonal יחיד עם שלפוחית ​​axonal רבים בתוך עצב סגמנטלי הזחל.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בתחום ההדמיה vivo התחבורה שלפוחית ​​סינפטית בתוך העצבים תסיסנית הזחל סגמנטלי הוא כלי רב עוצמה ללימוד מנגנוני בתחבורה axonal. השתמשנו בעבר בפרוטוקול זה על מנת להעריך את הדינמיקה בתוך התחבורה עצבים הזחל להביע מורחבת חוזר polyQ להבהיר כיצד התפשטות חוזרת להשפיע על הדינמיקה של שלפוחית ​​התחבורה 3. שימוש בפרוטוקול זה מהירות התנועה שלפוחית ​​ניתן לקבוע על ידי המרת הזרמים וידאו רשם גלים. שימוש בגנטיקה, תחבורה GFP שלפוחית ​​ניתן דמיינו בתוך האקסון בודד...

<table><tbody><tr><td>זוג אחד של מספרי מיקרו-דיסקציה</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>מספרי קפיץ &amp;#8211; להב 6mm. קוטר חוד 0.125 mm</td></tr><tr><td>2 זוגות פינצטות</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>פינצטות מיקרו-אדסון לדיסקציה עם חוד משונן מבית Fisherbrand</td></tr><tr><td>קופסת סיכות דיסקציה</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>סיכות Minutien בקוטר 0.1mm</td></tr></tbody></table>

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

הבהרת המנגנונים של תחבורה axonal הוכיח להיות חשוב מאוד בקביעת כיצד פגמים הובלה למרחקים ארוכים להשפיע על מחלות נוירולוגיות שונות. פגמים בתהליך זה חיוני יכול להיות השפעות מזיקות על ההתפתחות העצבית ואת תפקוד. פיתחנו פרוטוקול לנתיחה אשר נועד לחשוף את<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצבים סגמנטלי הזחל כדי להציג תחבורה axonal בזמן אמת. אנחנו צריכים להתאים את פרוטוקול הדמיה לחיות מזו שפרסם Hurd ו סקסטון (1996) המשמש immunolocalizatin עצבים סגמנטלי הזחל. דיסקציה זהירה ותנאי חיץ תקין הם קריטיים עבור למקסם את תוחלת החיים של הזחלים גזור. כאשר נעשה כראוי, זחלים גזור הראו התחבורה שלפוחית ​​חזקים 2-3 שעות בתנאים פיזיולוגיים. אנו משתמשים בשיטה כטב&quot;מ-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; להביע את ה-GFP-tagged APP או שלפוחית ​​synaptotagmin בתוך האקסון יחיד או אקסונים רבים עצבים סגמנטלי הזחל באמצעות שונות העצבית GAL4 הנהגים. סמנים מתויג fluorescently אחרים, למשל mitochrondria (MitoTracker) או lysosomes (LysoTracker), יכול להיות מיושם גם הזחלים לפני הצפייה. GFP-שלפוחית ​​ותנועת החלקיקים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות אורכי גל שונים.

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחלים לצורך הדמיה התנועה של שלפוחית ​​GFP axonal מתויג על הפסים microtubule.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

הבנת המנגנונים של הובלה אקסונלית הוכחה כחשובה מאוד לקביעת האופן שבו פגמים בהובלה למרחקים ארוכים משפיעים על ...

במטרה לבחון האם פגמים בהובלה אקסונית למרחקים ארוכים קיימים במחלות נוירולוגיות כגון מחלת אלצהיימר או מחלת הנטינגטון. הובלה אקסונית של וסיקולות הובלה נדגמת באמצעות דימוי בתוך לבה של ושט חי. כאן נבחן זאת.שלישית, זחלים של כוכבי ים המבטאים חלבון פיזי המסומן ב-A GFP מבודדים על קוביית ג'ל, ולאחר מכן מועברים למיקרוסקופ לצורך דימוי in vivo. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה משמשת לאחר מכן למעקב אחר הובלה פיזית בתוך האקסון. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת להדמיות של תנועה חיה ובלתי מופרעת של שלפוחיות סינפטיות ובאקסונים של זחלים.היערכו לניתוח על ידי וידוא שכל האספקה והריאגנטים הבאים נמצאים בהישג יד. באפר ניתוח. קוביית Sill guard חתוכה לרוחב של one inch, אורך של one inch וגובה של one centimeter, המונחת על תזריקת זכוכית.סיכות ניתוח קצרות במיוחד. החלק התחתון והחד של סיכות manum פועל בצורה הטובה ביותר בניתוח. ניתן להגיע לאורך הנכון על ידי החדרת סיכות ארוכות יותר לתוך הג'ל וחיתוך של כל חלק מהסיכה שבולט החוצה.יהיה דרוש לכם גם זוג מספרי מיקרו-דיסקציה חדים, ושתי ערכות של פינצטות בעלות קצה עדין. השתמשו בשפכטל מתכת קטן כדי להעביר זחלי כוכב שלב שלישי המבטאים חלבון SLE המסומן ב-GFP אל צלחת פטרי.בשלב הבא, יש להוסיף מים דה-יוניים לזחלים בצלחת הפטרי כדי להסיר את כל השאריות של המזון. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו אותם לקוביית ג'ל לדיסקציה כדי לבצע את הדיסקציה בחיים. השתמשו בפינצטה כדי להעביר זחל לקוביית הג'ל לדיסקציה.הוסף למס chipset זכוכית תמיסת דיסקציה כדי להטביעה. לאחר מכן, הצמד את הלרווה בפיים הקדמיים והאחוריים כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה, בצע חתך קטן בקו האמצע קרוב לקצה האחורי.מחתך זה, בצעו חתך נוסף עד לחלק הקדמי. מעיי המערכת העיכולית וגופי השומן יבלטו החוצה; השתמשו בשני סיכות כדי לקבע את קשרי השריון הגזורים מהקצוות הצדיים לקוביית התמיכה (sil guard cube).השתמשו בפיפטה כדי להוסיף טיפה של תמיפת ניתוח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להסיר בזהירות את מעי המערכת והגופי השומן. הצמידו נייר ניגוב (Kimwipe) לצד אחד של הזחילה כדי להסיר את התמיפה, ובמקביל הוסיפו תמיפת ניתוח טרייה באמצעות פיפטה.הלבה לא תהיה יבשה בשום שלב. כדי לסמן מבנים מיטוכונדריאליים או ליזוזומליים בלבה, החליפו את תמיסת הדיסקציה בתמיסת דיסקציה המכילה mito tracker או lyo tracker. הניחו את קוביית הדיסקציה בתא לחות ריבועי וכסו אותה בנייר אלומיניום.דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירת הסמן in vivo, ספגו שוב ושוב את תמיסת הדיסקציה הסובבת את הזחלים והוסיפו תמיסת דיסקציה נוספת בעזרת פיפטה. חזרו על פעולה זו חמש פעמים כדי לשטוף שאריות של סמן.לאחר החלפת השטיפה האחרונה, דחפו את הסיכות באופן מלא לתוך מגן ה-S והניחו מיד זכוכית כיסוי כדי למנוע תנועה של הלרבה. הלרבה מוכנה כעת לתצפית. כדי לבצע דימוי חי של הלרבה המנוסחת, הניחו את הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך לצורך דימוי של וסיקולות מסומנות.בתוך עצבים סגמנטליים של פגית. בצעו הדמיה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 100 פעמים. אם נצפה צביעת GFP חזקה בגופי התאים בתמונת הגנגליון הוונטרלי, ניתן להדמות את העצבים הסגמנטליים באמצעות מערכת תצוגה כפולה עם פילטרים עבור C-F-P-Y-F-P או R-F-P-Y-F-P ותוכנת תצוגה מפוצלת (split view) כדי לצפות בו-זמנית בשני חלבונים מתויגים in vivo.בסדרת צילומי Time lapse זו נראים שלפוחיות אקסוניות רבות על מסלולים אקסוניים רבים בתוך עצב סגמנטלי של זחל. שימו לב כי ה-GFP מייצג הצטברויות אקסוניות; שימו לב גם לתנועה הדו-כיוונית של השלפוחיות. כאן נראית תנועה של שלפוחיות אקסוניות על מסלול בודד בתוך עצב סגמנטלי של זחל.שימו לב, התנועה הדו-כיוונית של מבנים אלו היא בממוצע מיקרון אחד לשנייה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו מבצעים דיסקציה נקייה לצפייה in vivo בוריקולות המסומנות ב-GFP ובאקסונים של זחלים ב-gsof.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקר מחזור שלפוחית סינפטית בצמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה המבטאים צ'נלרודופסין באמצעות צבע פלואורסצנטי. אור כחול מפעיל את הצ'אנלרודופסינים, גורם לזרימת סידן ולאקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. הצבע משתלב בקרומים העצביים ומופנם במהלך אנדוציטוזה, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת. גירוי נוסף של אור כחול גורם לאקסוציטוזה ולשחרור צבע, אשר מוצג על ידי פלואורסצנטיות מופחתת.

ניתוח מחזור שלפוחית סינפטית וקליטת צבע פלואורסצנטי בזחלי דרוזופילה

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

למד הדמיה של תנועת שקיקים סינפטיים בתוך אקסונים של זחלי Drosophila באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצניה. שיטה זו מאפשרת מעקב חי בזמן אמת אחר תהליכי תחבורה אקסונלית ומסייעת בחקר מחלות נוירולוגיות.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

גלה סרטונים נוספים

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל