Name: הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: למד ליצור כלאי RNA/DNA ברמה הכרומוזומית בתאי שמרים חיים באמצעות טרנספורמציה עם אוליגונוקליאוטידים המכילים RNA. שיטה זו מאפשרת העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA גנומי ותיקון מוטציות בגנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקואליציה סרטן גאורגיה מענק-R9028.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
</ol>

הייצור וידאו עבור מאמר זה נערך בחסות תרמו פישר סיינטיפיק, אשר מייצרת ריאגנטים מכשיר בשימוש בפרסום זה.

העובדה RNA יכולים להעביר מידע גנטי ישירות הדנ&quot;א הגנומי בתאים התגלה ניצול השימוש RNA המכיל oligos סינתטי (oligos Dharmacon מסונתז) 1. זה היה הוכחה של העיקרון כי ניתן להשתמש בתאים המכילים מולקולות RNA או RNA בלבד רצפים כתבניות עבור סינתזה של DNA. השימוש RNA המכיל oligos לא רק הוביל להפגנה כי המידע הגנטי ניתן להעביר ישירות מ-RNA ל-DNA הגנומי ללא צורך הפוכה עיבד DNA להעתיק ביניים, אלא גם הוכחה כי RNA יכול לשמש כתבנית הומולוגיים ב את התיקון של נזק לדנ&quot;א 1,3. Oligos יכול להתבצע של RNA בלבד או להכיל רק ribonucleotide בודד מוטבע ברצף ה-DNA, כמו בדוגמה שהצגנו כאן. RNA המכיל אוליגו יש אחד ribonucleotide מוטבע שנועדה לתקן את המוטציה שטויות את האלל גנומית trp5 פגום. העברת מידע גנטי ribonucleotide ל-DNA הגנומי מתגלה על ידי שינוי פנוטיפ (תא גדל על המדיום חסר טריפטופן) של התאים הממוקדים. התדירות של תיקון הגן שהושגו עם אוליגו RNA המכיל נמדד בהשוואה לזה של ה-DNA רק לשלוט אוליגו. על ידי ביצוע תיקון זה גן assay ברקע תאים שונים, כאשר אנו עוברים מוטציה גנים שמרים שונים, אנו יכולים לזהות מה גורם / ים משפיעים במיוחד על מיקוד על ידי RNA המכיל oligos. לפיכך, אנו יכולים לחשוף מנגנונים כיצד תאים מווסתים את היציבות של RNA / DNA כלאיים. פשוט על ידי תכנון גרסאות שונות של RNA המכיל oligos אנו יכולים לקבוע את הסבירות עבור מערכת RNA מסוים לשמש תבנית שינוי ה-DNA, ואנחנו יכולים לקבוע את יציבות מסוימת רצפי הרנ&quot;א מוטבע לתוך ה-DNA. יתר על כן, אנו יכולים לזהות מה הם העדיפו בשנת מצעים vivo גורמים אינטראקציה עם RNA / DNA כלאיים. בעוד מספר מחקרים במבחנה, בעיקר ניצול קצר RNA המכיל oligos, נערכו כדי לאפיין את הפונקציה של גורמים שיכולים לזהות רנ&quot;א היברידית עם ה-DNA, כגון אנזימים RNase H 4, בפונקציות vivo של RNases H כמו גם כזהות של חלבונים אחרים שיכולים להשפיע על RNA / DNA יציבות היברידית אינם ידועים ברובם. האפשרות לנצל RNA המכיל oligos באורך משמעותי (50-80, מרס) ובאיכות אופטימלית (כגון Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל oligos) יש לפתוח את הדרך בחינת מגוון רחב של תהליכים מולקולריים ישירות in vivo ב תאים של עניין. כפי שניתן לראות השינוי הזה וידאו, באמצעות RNA המכיל oligos דורש בעצם רק כמה צעדים נוספים לעומת השינוי באמצעות מולקולות ה-DNA, כדי למנוע השפלה ידי RNases. לכן, השינוי באמצעות RNA המכיל oligos אינו מוגבל למערכת שמרים, אבל יכול להיות מיושם על כל אורגניזם או סוג התא שבו שינוי ה-DNA על ידי oligos הוא מיומן. לסיכום, על ידי מיקוד תאים המכילים RNA oligos מספקת את ההזדמנות כדי לייצר RNA / DNA היברידיים ribonucleotides מוטבע ב DNA בתאי in vivo. היציבות, פונקצית וההשלכות של אלה in vivo שנוצר RNA / DNA כלאיים ניתן לנתח ומאופיינת, פוטנציאל חשיפת מנגנוני ידוע של תיקון DNA וגילוי אסטרטגיות חדשניות גן מיקוד.

א טרנספורמציה ריאגנטים המדיה (שונה מן Storici ו רזניק, 2006 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YPD (שמרים Peptone דקסטרוז): עבור L 1, 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם סויה peptone, 20 גרם דקסטרוז. הוסף 15 גר &#39;אגר לעשות התקשורת מוצק YPD. החיטוי לפני השימוש. אחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 1: 0.1 M של ליתיום אצטט. הכן מיד לפני השינוי. פתרון 1 הוא פתרון של העבודה, ולכן הוא מוכן ישירות האבקה. פתרון ללא מניות הוא עשה. לשמור בטמפרטורת החדר. LiAc מגדיל את חדירות התא שמרים קיר ל-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2: 0.1 M של ליתיום אצטט ו -50% פוליאתילן גליקול 4000. כמו כן פתרון 2 הוא פתרון עבודה הוא עשה ישירות האבקה. פתרון ללא מניות מוכנה. לשמור בטמפרטורת החדר. פיקדונות PEG oligos על תאים ושמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA המכיל oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80, מרס, desalted, deprotected שאינם מטוהרים. Resuspend עד 250 pmoles / μl. חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA רק oligos, 50-80, מרס, desalted שאינם מטוהרים. Resuspend עד 50 pmoles / μl. חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SC-TRP (התקשורת להשלים סינתטי חסר טריפטופן) מדיה מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקוטר 0.5 ס&quot;מ חרוזי זכוכית, מעוקרים ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNase-off: פתרון RNase טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase / RNase חופשי, מבחנות צנטריפוגה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase / RNase חינם, צינורות חרוטי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase / RNase חינם, פיפטה סטרילית אירוסול טיפים עם ZAP: 100-200 מ&quot;ל, 100-1000 מ&quot;ל. </li></ol> ב המושבה PCR חומרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA primers, desalted ולא מטוהרים. מתמוססים במים סטריליים עד 50 pmoles / μl. חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקי פולימראז ה-DNA, מאגר, dNTPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR צינורות. </li></ol> ג טיהור PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR ערכת טיהור. </li></ol> ד ג&#39;ל אלקטרופורזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 x חיץ TBE ריצה (45 mM טריס-borate ו 1 ethylenediamine tetraacetate mM) מדוללת מ TBE 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prestained משקל מולקולרי הסמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA לצבוע הטעינה. </li></ol> E. העיכול סייג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת אנזימים, מאגרים 10x, BSA. </li></ol> פ טיפול אלקליות עבור RNA המכיל אוליגו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M NaOH של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.2 מ &#39;של פתרון HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M של טריס-HCl, pH 7.4 פתרון. </li></ol>

הדור של rna / dna כלאיים ב-dna הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות rna המכיל oligonucleotides

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

פולימרים סינתטיים קצר חומצות גרעין, oligonucleotides (oligos), הם כלי פונקציונלי ביותר נרחבת של הביולוגיה המולקולרית. Oligos יכול להיות מיוצר להכיל את כל ה-DNA הרצוי או רצף הרנ&quot;א יכול להיות מוכן לכלול מגוון רחב של הבסיס שינויים סוכר. יתר על כן, oligos ניתן שנועד לחקות שינויים ספציפיים חומצות גרעין, ולכן, יכול לשמש כלי חשוב לחקור את ההשפעות של נזק לדנ&quot;א מנגנוני התיקון. מצאנו כי Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל oligos עם אורך בין 50 ל 80 נוקלאוטידים יכול להיות מתאים במיוחד ללמוד, ב, פונקציות vivo וההשלכות של RNA כרומוזומליות / כלאיים דנ&quot;א של ribonucleotides מוטבע לתוך ה-DNA. RNA / DNA כלאיים יכול בקלות ליצור במהלך התיקון שכפול, שעתוק דנ&quot;א, לעומת זאת, מעט מאוד ידוע על היציבות של RNA / DNA כלאיים בתאים אשר במידה כלאיים אלה יכולים להשפיע על שלמות הגנטי של התאים. RNA המכיל oligos, אם כן, מייצגים וקטור המושלם להציג ribonucleotides לתוך הדנ&quot;א בכרומוזומים וליצור RNA / DNA כלאיים של אורך נבחר הרכב הבסיס. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור שילוב של ribonucleotides לתוך הגנום של שמרים מערכת אוקריוטים מודל / cerevisiae Saccharomyces /. עם זאת, במעבדה שלנו ניצלה Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל oligos לייצר RNA / DNA כלאיים ברמת כרומוזומליות במערכות תאים שונים, בין חיידקים לתאי האדם.

עבודה זו מראה כיצד ליצור כלאיים RNA / DNA ברמה כרומוזומליות ולחשוף העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA הגנומי בתאי שמרים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

פולימרים סינתטיים קצרים של חומצות גרעין, אוליגונוקלאוטידים (oligos), הם הכלים הפונקציונליים והנפוצים ביותר בביולוגיה מולקולרית. אוליגונוקלאוטידים יכולים להיות...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור היברידים של RNA-DNA ברמה הכרומוזומלית בתאי שמרים חיים, על ידי טרנספורמציה של תאי השמרים עם אוליגו-נוקליאוטידים המכילים RNA. דבר זה מושג באמצעות הכנסת גדיל RNA בודד, המכיל אוליגו, לתאי שמרים הנמצאים בחלוקה. האוליגו יגבהש (anneal) עם האזור המשלים של גן מסמן מוטגנזי הממוקם על כרומוזום של השמרים כדי ליצור היבריד RNA-DNA; כשלב שני, תאי השמרים שעברו טרנספורמציה באמצעות האוליגו המכיל RNA נזרעים על מצע סלקטיבי.דבר זה מאפשר גידול של תאים שבהם חלק ה-RNA של האוליגו משמש כתבנית לתיקון של הגן המסמן המוטה. לאחר מכן, נספרות מושבות שמרים הגדלות על המצע הסלקטיבי כדי לקבוע את תדירות תיקון הגן על ידי האוליגו המכיל RNA; התוצאות המתקבלות חושפות את העברת המידע הגנטי מקטע ה-RNA של האוליגו אל הגן המסמן המוטה בגנום השמרים. הדבר ניכר מניתוח עיכול רסטריקציה, ניתוח רצף ובדיקת יציבות בבסיס בסיסי (alkaline liability assay).שלום, אני מייסד HIN, המעבדה של ד"ר Francesca בבית הספר לביולוגיה במכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה (Georgia Institute of Technology). היום נדגים לכם פרוטוקול ליצירת היברידים של RNA-DNA ברמה הכרומזומלית בתאי שמרים חיים. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים סובלים מנוכחות של RNA המשובץ בתוך DNA גנומי, וכדי לקבוע אילו גורמים משפיעים על יציבות היברידי RNA-DNA in vivo.אם כן, נתחיל. לפני תחילת הפרוצדורה, נגב את כל החומרים שבהם ייעשה שימוש בניסוי, כולל מבחנות אוליגו, פפטים, מעמדי וורטקס, אתר העבודה והכפפות של החוקר, באמצעות תמיסה לדה-קונטמינציה של RNA. כדי למנוע זיהום פוטנציאלי ב-RNA, השתמש במים נקיים מ-RNA, בריאגנטים כימיים, במבחנות ובטיפים של פפטה לאורך כל הפרוצדורה.השג אוליגו המכיל RNA להעברת מידע גנטי ל-DNA הגנומי של תאי שמרים. זן השמרים המשמש כאן מכיל גן trip five מוטנטי עם מחיקה של שני בסיסים ומוטציית nonsense אחת. זן שמרים כזה הוא מוטנט טריפטופן-אטרופי ואינו יוצר מושבות במצעים ללא טריפטופן.האוליגו המכיל RNA הוא בעל אורך של 65 MER עם השחלה של שני בסיסי DNA שנועדה לתקן את מוטציית המחיקה. בנוסף, האוליגו כולל ריבנוקלאוטיד אחד לתיקון מוטציית הנונסנס של אלל trip five. לאחר קבלתו, הכין את האוליגו המכיל RNA כתמיסת מלאי בריכוז 250 micromolar כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. 16 שעות לפני הטרנספורמציה עם האוליגו המכיל RNA, בצע אינוקולציה.העבירו חמישה מיליליטרים של מצע נוזלי rich yeast peptide dextrose או YPD עם תאי שמרים מוטנטים מסוג trip five וגדלו את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך לילה. לאחר דגירה של לילה, העבירו 1.5 מיליליטרים מהתרבית של הלילה לתוך 50 מיליליטרים של מצע נוזלי YPD. דגרו את התאים בשייקר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במהירות של 225 סיבובים לדקה למשך ארבע שעות, מיד לפני שלב הפשרת הטרנספורמציה.השאירו את האוליגו-נוקלאוטידים המכילים RNA ואת האוליגו-נוקלאוטידים המכילים DNA בלבד על קרח. האוליגו-נוקלאוטידים המכילים DNA בלבד משמשים כביקורת חיובית. דללו את האוליגו-נוקלאוטידים לריכוז של 50 micromolar באמצעות מים נקיים מ-RNA במבחנות נקיות מ-RNA.הכינו 70 µL מכל אוליגו כדי לאפשר דגימה מספיקה לשלוש טרנספורמציות של מול אחד עם עודף מסוים של דנטורציה; חממו את האוליגואים המכילים RNA ואת האוליגואים של DNA בלבד על בלוק חימום של 100 °C למשך שתי דקות כדי לסלק מבנים שניוניים של האוליגואים. מיד לאחר הדנטורציה, העבירו את המבחנות לקרח והשאירו אותן שם עד לטרנספורמציה. הכינו את תמיסה 1 ותמיסה 2 בתוך מבחנות נטולות RNA מיד לפני הטרנספורמציה. העבירו את תרבית התאים למבחנה של 50 mL נטולת RNA וסבבו במהירות של 3000 סל"ד, המקבילה ל-1,562 ×g, למשך שתי דקות.הסיר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את התאים עם 50 milliliters של מים נקיים מ-RNA. סבב את התאים שוב ב-3000 rotations per minute למשך שתי דקות. חזור על תהליך זה חמש פעמים כדי להיפטר מתוצר המעבדה ומכל RNA שעלול להיות נוכח לאחר הסבב האחרון.הסיר את הנוזל העליון ותלה שוב את התאים בחמישה מיליליטר של תמיסה. אחת. סבב את הדגימה ב-3000 rotations per minute למשך שתי דקות, השלך את הנוזל העליון והוסף 250 µL של תמיסה אחת לתאים. כמות תאים זו מספיקה לשבע עד שמונה טרנספורמציות.העבירו מנה של 50 µL מהתמיס התאי לכל אחד משבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוזה נקיות מ-RNA. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL מהאוליגו בריכוז 50 µM המכיל RNA לשלוש מבחנות. הוסיפו 20 µL מהאוליגו בריכוז 50 µM המכיל DNA בלבד לשלוש מבחנות, ו-20 µL של מים סטריליים ללא אוליגו למבחנה אחת כביקורת שלילית.לאחר מכן, הוסיפו 300 µL מתמיסה שתיים עבור כל אחת משבע תגובות הטרנספורמציה. ערבבו את הדגימות במכשיר וורטקס בעוצמה כדי לערבב את הרכיבים. דגרו את תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות בשייקר לאחר הדגירה.בצעו הלם תרמי לדגימות בטמפרטורה של 42 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, סבבו את התאים במהירות של 5,000 סל"ד, המקבילה ל-2,236 ×g, למשך ארבע דקות. הסירו את ה-SUP agent ותלו את התאים מחדש ב-100 µL של מים סטריליים עבור כל אחד משלוש מבחנות.קחו מנה (aliquot) של תרחיף תאים זה ודללו כל מנה במים סטריליים פי 100,000. הוסיפו כ-15 כדורי זכוכית סטריליים לכל צלחת, ופזרו 100 µL של התאים המדוללים פי 100,000 על שלוש צלחות YPD. פזרו 100 µL של התאים המשוחזרים (resuspended) מכל תגובת טרנספורמציה על צלחת פטרי אחת של מצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן, ונערנער את הצלחות באופן אחיד.לאחר מכן הסר את החרוזים. דגרי את התאים בצלחות YPD בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים, ודגרי את התאים שהוצבו במצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך ארבעה עד חמישה ימים. ספור והשווה את מספר המושבות שגדלו במצע הסלקטיבי וכן במצע YPD כדי לחשב את תדירות תיקון הגן עבור האוליגו המכיל RNA, עבור האוליגו המכיל DNA בלבד ועבור בקרת ה"ללא אוליגו".מצופה שלא ייווצרו מושבות על המצע הסלקטיבי כאשר לא נוספו אוליגו-נוקלאוטידים לתאים. יש לזרוע מספר מושבות טרנספורמיביות שנבחרו באופן אקראי על מצע YPD כדי לקבל בידוד של מושבות בודדות. יש לדגור את התאים למשך יומיים בטמפרטורה של 30 °C לצמיחת המושבות. לאחר הדגירה, יש לבחור מספר מושבות בודדות ולהכין מריחות (patches) על מצע YPD ועל המצע הסלקטיבי.במצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן, לאחר דגירה של יום אחד, נצפה צמיחה עבור התאים שעברו טרנספורמציה עם האוליגוס, אך לא עבור זן הביקור ללא אוליגו במצע הסינתטי המלא והסלקטיבי ללא טריפטופן. לאחר מכן, תכננו זוג פריימרים להגברה של האזור שמטרתו האוליגו המכיל RNA באמצעות colony PCR כדי להתחיל את תהליך ה-colony PCR. השעיו את התאים שנלקחו מהפטצ'ים (patches) האינדיבידואליים ב-50 µL של מים המכילים יחידה אחת של liase, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן דגרו בבלוק חימום ב-100 °C למשך חמש דקות כדי לפרק את התאים ולשחרר את ה-DNA הגנומי לתמיסה.הכינו את תגובות ה-PCR באנבובי PCR, תוך הוספת 10 µL מתלי suspension התאים לכל מערך אנبوب, ובצעו את תגובת ההגברה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הריצו את הדגימות שהתקבלו על ג'ל agarose בריכוז 1% כדי לצפות בתוצר ה-PCR. מכיוון שהמידע הגנטי שהועבר על ידי ה-oligo המכיל RNA בניסוי זה יוצר אתר restriction חדש של VAN 91 1 באזור המטרה הגנומי של השמרים, ניתן לאמת את ההעברה הנכונה של המידע על ידי עיכול של תוצר ה-PCR באמצעות אנזים ה-restriction מסוג van 91 1.הכינו את תגובת העיכול כך שתכלול 6 µL של בופר לתוצר PCR, 0.5 µL של BSA, את אנזים ההגבלה ומים סטריליים עד לנפח של 15 µL. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. הריצו דגימה שאינה מעובדת יחד עם הדגימות המעובדות באותה שורה של ג'ל agarose בריכוז 2%, כדי לצפות במודיפיקציה הגנטית שהועברה על ידי רצף ה-RNA של האוליגו המכיל RNA.טהרו את תוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR והכינו אותם לריצוף DNA. הגש את הדגימות לריצוף באמצעות אותם פריימרים ששימשו להגברה של התוצר. לבסוף, נתחו את תוצאות ריצוף ה-DNA באמצעות תוכנה המאפשרת יישור של רצפים מרובים מול רצף ייחוס נבחר, כדי לבצע טיפול בבסיס (alkali treatment) של האוליגו המכיל RNA עבור כל תגובה, בריכוז של 1 mol של האוליגו המכיל RNA או של אוליגו ה-DNA בלבד, לתוך מבחנה של 1.5 milliliter.לאחר מכן, הוסיפו 4 µL של sodium hydroxide בריכוז 1 M לצורך הידרוליזה, או 4 µL של מים עבור הביקורת השלילית. דגרו את הדגימות בבן-מריא בטמפרטורה של 65 °C למשך שעה אחת לאחר הדגירה. העבירו את התגובה לקרח.נטרלו את תגובת ההידרוליזה באמצעות 2 µL של חומצה כלורידית 1.2 M, 4 µL של tris hydrochloride בריכוז 1 M ו-4 µL של מים עבור הביקורת השלילית. הוסיפו 6 µL של מים ו-4 µL של tris hydrochloride בריכוז 1 M. שמרו את הדגימות על קרח עד לביצוע התרגום.כפי שתואר הרגע, תאי שמרים שעברו טרנספורמציה ללא אוליגו אינם יוצרים מושבות על מצע מוצק סינתטי מאוזן (synthetic complete) ללא טריפטופן. לעומת זאת, תאים שגודלו על מצע מוצק סינתטי מאוזן ללא טריפטופן לאחר שעברו טרנספורמציה עם אוליגו אחד המכיל RNA, מראים כעת מושבות.מושבות שמרים גדלו גם על מצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן לאחר שהתאים עברו טרנספורמציה עם ננומול אחד של אוליגו בקרת DNA בלבד; הזיהוי של העברה של מידע גנטי מהאוליגו המכיל RNA ל-DNA הכרומוזומלי של השמרים ניכר על ידי עיכול רסtriksjon של VAN 91 1 של תוצר ה-PCR המגביר את האזור הגנומי המטרה, כפי שמוצג; ניתן לראות את תוצר ה-PCR של לוקוס trip. Five שהוגבר מה-DNA הגנומי של זן מוטנט trip. Five.מוצג גם תוצר PCR שהועשר מ-DNA גנומי שהופק ממושבת trip plus שסומנה על ידי ה-oligo של DNA בלבד. תוצרי ה-PCR שהועשרו מ-DNA גנומי שהופק ממושבות trip plus שסומנו על ידי ה-oligo המכיל RNA הורצו אף הם על הג'ל. תוצאות עיכור ה-van 91 1 של אותם תוצרי PCR חושפות פס PCR מועשר של 278 זוגות בסיסים ופסי תוצרי עיכור של van 91 1 של 177 זוגות בסיסים ו-101 זוגות בסיסים.ריצוף DNA חושף את תיקון הגן על ידי האוליגו המכיל RNA כאן. מוצג אלקטרופורוגרם של DNA של האזור הגנומי שהיהו יעד לאוליגו המכיל RNA. ה-g ברצף ה-DNA נובע מה-RG שבאוליגו המכיל RNA go.במסגרת מופיעה גם ההחדרה של רצפי הבסיסים CG באזור trip five של הטרנספורמנטים trip plus שנכוונו על ידי האוליגו של ה-DNA בלבד והאוליגו המכיל RNA; אלו תואמים לרצף הקונסנזוס ומושוואים לרצף של תאי מוטנט trip five לפני הכוונתם על ידי האוליגואים. לאוליגו המכיל RNA לתיקון, המופיע למטה, יש החדרה של שני בסיסי DNA והחלפה של בסיס RNA אחד.האזורים המסוגרים בכחול עם גוון צהוב מראים כי הן האוליגו המכיל RNA והן האוליגו המכיל DNA בלבד תיקנו במדויק את מוטציית המחיקה ואת מוטציית ה-nonsense בכל הדגימות שנבדקו; הקווים המקווקוים מסמנים את מיקומו של רצף האוליגו המכיל RNA. טיפול בבסיס (Alkali) מונע תיקון גנתי על ידי האוליגו המכיל RNA; מוצגת תדירות הטרנספורמציה עבור האוליגו המכיל RNA ועבור האוליגו המכיל DNA בלבד. פסי השגיאה מייצגים את טעות התקן של הממוצע עבור שלוש טרנספורמציות עצמאיות לכל אוליגו.האוליגו המכיל DNA בלבד מראה תדירות טרנספורמציה דומה עם ובלי טיפול בנתרן הידרוקסיד. לעומת זאת, תדירות הטרנספורמציה של האוליגו המכיל RNA יורדת לאפס לאחר טיפול בנתרן הידרוקסיד. לפיכך, התכשיר עם האוליגו המכיל RNA אינו מזוהם באוליגו המכיל DNA בלבד.לפיכך, תדירות הטרנספורמציה שנצפתה היא ספציפית לאוליגו המכיל RNA. הרגע הצגנו כיצד ליצור היבריד RNA-DNA ברמה הכרומוזומלית וסקרנו את העברת המידע הגנטי מ-RNA ל-DNA גנומי בתאי שמרים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש באוליגואים מכيلي RNA באיכות מעולה ולעבוד בתנאים נקיים מ-RNA.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת...

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ"א שונה ב C2'- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

במאמר זה, אנו מציגים ולדון התפתחויות חדשות סינתזה ויישומים של חומצות גרעין מיקרומערכים מפוברק באתרו. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד הפרוטוקולים לסינתזה DNA ניתן להרחיב RNA וכיצד מיקרו מערכים ניתן להשתמש כדי ליצור לאחזור ספריות גרעין של חומצה.

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.

גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

למד ליצור כלאי RNA/DNA ברמה הכרומוזומית בתאי שמרים חיים באמצעות טרנספורמציה עם אוליגונוקליאוטידים המכילים RNA. שיטה זו מאפשרת העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA גנומי ותיקון מוטציות בגנים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

גלה סרטונים נוספים