הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור היברידים של RNA-DNA ברמה הכרומוזומלית בתאי שמרים חיים, על ידי טרנספורמציה של תאי השמרים עם אוליגו-נוקליאוטידים המכילים RNA. דבר זה מושג באמצעות הכנסת גדיל RNA בודד, המכיל אוליגו, לתאי שמרים הנמצאים בחלוקה. האוליגו יגבהש (anneal) עם האזור המשלים של גן מסמן מוטגנזי הממוקם על כרומוזום של השמרים כדי ליצור היבריד RNA-DNA; כשלב שני, תאי השמרים שעברו טרנספורמציה באמצעות האוליגו המכיל RNA נזרעים על מצע סלקטיבי.

דבר זה מאפשר גידול של תאים שבהם חלק ה-RNA של האוליגו משמש כתבנית לתיקון של הגן המסמן המוטה. לאחר מכן, נספרות מושבות שמרים הגדלות על המצע הסלקטיבי כדי לקבוע את תדירות תיקון הגן על ידי האוליגו המכיל RNA; התוצאות המתקבלות חושפות את העברת המידע הגנטי מקטע ה-RNA של האוליגו אל הגן המסמן המוטה בגנום השמרים. הדבר ניכר מניתוח עיכול רסטריקציה, ניתוח רצף ובדיקת יציבות בבסיס בסיסי (alkaline liability assay).

שלום, אני מייסד HIN, המעבדה של ד"ר Francesca בבית הספר לביולוגיה במכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה (Georgia Institute of Technology). היום נדגים לכם פרוטוקול ליצירת היברידים של RNA-DNA ברמה הכרומזומלית בתאי שמרים חיים. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים סובלים מנוכחות של RNA המשובץ בתוך DNA גנומי, וכדי לקבוע אילו גורמים משפיעים על יציבות היברידי RNA-DNA in vivo.

אם כן, נתחיל. לפני תחילת הפרוצדורה, נגב את כל החומרים שבהם ייעשה שימוש בניסוי, כולל מבחנות אוליגו, פפטים, מעמדי וורטקס, אתר העבודה והכפפות של החוקר, באמצעות תמיסה לדה-קונטמינציה של RNA. כדי למנוע זיהום פוטנציאלי ב-RNA, השתמש במים נקיים מ-RNA, בריאגנטים כימיים, במבחנות ובטיפים של פפטה לאורך כל הפרוצדורה.

השג אוליגו המכיל RNA להעברת מידע גנטי ל-DNA הגנומי של תאי שמרים. זן השמרים המשמש כאן מכיל גן trip five מוטנטי עם מחיקה של שני בסיסים ומוטציית nonsense אחת. זן שמרים כזה הוא מוטנט טריפטופן-אטרופי ואינו יוצר מושבות במצעים ללא טריפטופן.

האוליגו המכיל RNA הוא בעל אורך של 65 MER עם השחלה של שני בסיסי DNA שנועדה לתקן את מוטציית המחיקה. בנוסף, האוליגו כולל ריבנוקלאוטיד אחד לתיקון מוטציית הנונסנס של אלל trip five. לאחר קבלתו, הכין את האוליגו המכיל RNA כתמיסת מלאי בריכוז 250 micromolar כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. 16 שעות לפני הטרנספורמציה עם האוליגו המכיל RNA, בצע אינוקולציה.

העבירו חמישה מיליליטרים של מצע נוזלי rich yeast peptide dextrose או YPD עם תאי שמרים מוטנטים מסוג trip five וגדלו את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך לילה. לאחר דגירה של לילה, העבירו 1.5 מיליליטרים מהתרבית של הלילה לתוך 50 מיליליטרים של מצע נוזלי YPD. דגרו את התאים בשייקר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במהירות של 225 סיבובים לדקה למשך ארבע שעות, מיד לפני שלב הפשרת הטרנספורמציה.

השאירו את האוליגו-נוקלאוטידים המכילים RNA ואת האוליגו-נוקלאוטידים המכילים DNA בלבד על קרח. האוליגו-נוקלאוטידים המכילים DNA בלבד משמשים כביקורת חיובית. דללו את האוליגו-נוקלאוטידים לריכוז של 50 micromolar באמצעות מים נקיים מ-RNA במבחנות נקיות מ-RNA.

הכינו 70 µL מכל אוליגו כדי לאפשר דגימה מספיקה לשלוש טרנספורמציות של מול אחד עם עודף מסוים של דנטורציה; חממו את האוליגואים המכילים RNA ואת האוליגואים של DNA בלבד על בלוק חימום של 100 °C למשך שתי דקות כדי לסלק מבנים שניוניים של האוליגואים. מיד לאחר הדנטורציה, העבירו את המבחנות לקרח והשאירו אותן שם עד לטרנספורמציה. הכינו את תמיסה 1 ותמיסה 2 בתוך מבחנות נטולות RNA מיד לפני הטרנספורמציה. העבירו את תרבית התאים למבחנה של 50 mL נטולת RNA וסבבו במהירות של 3000 סל"ד, המקבילה ל-1,562 ×g, למשך שתי דקות.

הסיר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את התאים עם 50 milliliters של מים נקיים מ-RNA. סבב את התאים שוב ב-3000 rotations per minute למשך שתי דקות. חזור על תהליך זה חמש פעמים כדי להיפטר מתוצר המעבדה ומכל RNA שעלול להיות נוכח לאחר הסבב האחרון.

הסיר את הנוזל העליון ותלה שוב את התאים בחמישה מיליליטר של תמיסה. אחת. סבב את הדגימה ב-3000 rotations per minute למשך שתי דקות, השלך את הנוזל העליון והוסף 250 µL של תמיסה אחת לתאים. כמות תאים זו מספיקה לשבע עד שמונה טרנספורמציות.

העבירו מנה של 50 µL מהתמיס התאי לכל אחד משבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוזה נקיות מ-RNA. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL מהאוליגו בריכוז 50 µM המכיל RNA לשלוש מבחנות. הוסיפו 20 µL מהאוליגו בריכוז 50 µM המכיל DNA בלבד לשלוש מבחנות, ו-20 µL של מים סטריליים ללא אוליגו למבחנה אחת כביקורת שלילית.

לאחר מכן, הוסיפו 300 µL מתמיסה שתיים עבור כל אחת משבע תגובות הטרנספורמציה. ערבבו את הדגימות במכשיר וורטקס בעוצמה כדי לערבב את הרכיבים. דגרו את תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות בשייקר לאחר הדגירה.

בצעו הלם תרמי לדגימות בטמפרטורה של 42 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, סבבו את התאים במהירות של 5,000 סל"ד, המקבילה ל-2,236 ×g, למשך ארבע דקות. הסירו את ה-SUP agent ותלו את התאים מחדש ב-100 µL של מים סטריליים עבור כל אחד משלוש מבחנות.

קחו מנה (aliquot) של תרחיף תאים זה ודללו כל מנה במים סטריליים פי 100,000. הוסיפו כ-15 כדורי זכוכית סטריליים לכל צלחת, ופזרו 100 µL של התאים המדוללים פי 100,000 על שלוש צלחות YPD. פזרו 100 µL של התאים המשוחזרים (resuspended) מכל תגובת טרנספורמציה על צלחת פטרי אחת של מצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן, ונערנער את הצלחות באופן אחיד.

לאחר מכן הסר את החרוזים. דגרי את התאים בצלחות YPD בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים, ודגרי את התאים שהוצבו במצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך ארבעה עד חמישה ימים. ספור והשווה את מספר המושבות שגדלו במצע הסלקטיבי וכן במצע YPD כדי לחשב את תדירות תיקון הגן עבור האוליגו המכיל RNA, עבור האוליגו המכיל DNA בלבד ועבור בקרת ה"ללא אוליגו".

מצופה שלא ייווצרו מושבות על המצע הסלקטיבי כאשר לא נוספו אוליגו-נוקלאוטידים לתאים. יש לזרוע מספר מושבות טרנספורמיביות שנבחרו באופן אקראי על מצע YPD כדי לקבל בידוד של מושבות בודדות. יש לדגור את התאים למשך יומיים בטמפרטורה של 30 °C לצמיחת המושבות. לאחר הדגירה, יש לבחור מספר מושבות בודדות ולהכין מריחות (patches) על מצע YPD ועל המצע הסלקטיבי.

במצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן, לאחר דגירה של יום אחד, נצפה צמיחה עבור התאים שעברו טרנספורמציה עם האוליגוס, אך לא עבור זן הביקור ללא אוליגו במצע הסינתטי המלא והסלקטיבי ללא טריפטופן. לאחר מכן, תכננו זוג פריימרים להגברה של האזור שמטרתו האוליגו המכיל RNA באמצעות colony PCR כדי להתחיל את תהליך ה-colony PCR. השעיו את התאים שנלקחו מהפטצ'ים (patches) האינדיבידואליים ב-50 µL של מים המכילים יחידה אחת של liase, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן דגרו בבלוק חימום ב-100 °C למשך חמש דקות כדי לפרק את התאים ולשחרר את ה-DNA הגנומי לתמיסה.

הכינו את תגובות ה-PCR באנבובי PCR, תוך הוספת 10 µL מתלי suspension התאים לכל מערך אנبوب, ובצעו את תגובת ההגברה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הריצו את הדגימות שהתקבלו על ג'ל agarose בריכוז 1% כדי לצפות בתוצר ה-PCR. מכיוון שהמידע הגנטי שהועבר על ידי ה-oligo המכיל RNA בניסוי זה יוצר אתר restriction חדש של VAN 91 1 באזור המטרה הגנומי של השמרים, ניתן לאמת את ההעברה הנכונה של המידע על ידי עיכול של תוצר ה-PCR באמצעות אנזים ה-restriction מסוג van 91 1.

הכינו את תגובת העיכול כך שתכלול 6 µL של בופר לתוצר PCR, 0.5 µL של BSA, את אנזים ההגבלה ומים סטריליים עד לנפח של 15 µL. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. הריצו דגימה שאינה מעובדת יחד עם הדגימות המעובדות באותה שורה של ג'ל agarose בריכוז 2%, כדי לצפות במודיפיקציה הגנטית שהועברה על ידי רצף ה-RNA של האוליגו המכיל RNA.

טהרו את תוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR והכינו אותם לריצוף DNA. הגש את הדגימות לריצוף באמצעות אותם פריימרים ששימשו להגברה של התוצר. לבסוף, נתחו את תוצאות ריצוף ה-DNA באמצעות תוכנה המאפשרת יישור של רצפים מרובים מול רצף ייחוס נבחר, כדי לבצע טיפול בבסיס (alkali treatment) של האוליגו המכיל RNA עבור כל תגובה, בריכוז של 1 mol של האוליגו המכיל RNA או של אוליגו ה-DNA בלבד, לתוך מבחנה של 1.5 milliliter.

לאחר מכן, הוסיפו 4 µL של sodium hydroxide בריכוז 1 M לצורך הידרוליזה, או 4 µL של מים עבור הביקורת השלילית. דגרו את הדגימות בבן-מריא בטמפרטורה של 65 °C למשך שעה אחת לאחר הדגירה. העבירו את התגובה לקרח.

נטרלו את תגובת ההידרוליזה באמצעות 2 µL של חומצה כלורידית 1.2 M, 4 µL של tris hydrochloride בריכוז 1 M ו-4 µL של מים עבור הביקורת השלילית. הוסיפו 6 µL של מים ו-4 µL של tris hydrochloride בריכוז 1 M. שמרו את הדגימות על קרח עד לביצוע התרגום.

כפי שתואר הרגע, תאי שמרים שעברו טרנספורמציה ללא אוליגו אינם יוצרים מושבות על מצע מוצק סינתטי מאוזן (synthetic complete) ללא טריפטופן. לעומת זאת, תאים שגודלו על מצע מוצק סינתטי מאוזן ללא טריפטופן לאחר שעברו טרנספורמציה עם אוליגו אחד המכיל RNA, מראים כעת מושבות.

מושבות שמרים גדלו גם על מצע מוצק סינתטי מלא ללא טריפטופן לאחר שהתאים עברו טרנספורמציה עם ננומול אחד של אוליגו בקרת DNA בלבד; הזיהוי של העברה של מידע גנטי מהאוליגו המכיל RNA ל-DNA הכרומוזומלי של השמרים ניכר על ידי עיכול רסtriksjon של VAN 91 1 של תוצר ה-PCR המגביר את האזור הגנומי המטרה, כפי שמוצג; ניתן לראות את תוצר ה-PCR של לוקוס trip. Five שהוגבר מה-DNA הגנומי של זן מוטנט trip. Five.

מוצג גם תוצר PCR שהועשר מ-DNA גנומי שהופק ממושבת trip plus שסומנה על ידי ה-oligo של DNA בלבד. תוצרי ה-PCR שהועשרו מ-DNA גנומי שהופק ממושבות trip plus שסומנו על ידי ה-oligo המכיל RNA הורצו אף הם על הג'ל. תוצאות עיכור ה-van 91 1 של אותם תוצרי PCR חושפות פס PCR מועשר של 278 זוגות בסיסים ופסי תוצרי עיכור של van 91 1 של 177 זוגות בסיסים ו-101 זוגות בסיסים.

ריצוף DNA חושף את תיקון הגן על ידי האוליגו המכיל RNA כאן. מוצג אלקטרופורוגרם של DNA של האזור הגנומי שהיהו יעד לאוליגו המכיל RNA. ה-g ברצף ה-DNA נובע מה-RG שבאוליגו המכיל RNA go.

במסגרת מופיעה גם ההחדרה של רצפי הבסיסים CG באזור trip five של הטרנספורמנטים trip plus שנכוונו על ידי האוליגו של ה-DNA בלבד והאוליגו המכיל RNA; אלו תואמים לרצף הקונסנזוס ומושוואים לרצף של תאי מוטנט trip five לפני הכוונתם על ידי האוליגואים. לאוליגו המכיל RNA לתיקון, המופיע למטה, יש החדרה של שני בסיסי DNA והחלפה של בסיס RNA אחד.

האזורים המסוגרים בכחול עם גוון צהוב מראים כי הן האוליגו המכיל RNA והן האוליגו המכיל DNA בלבד תיקנו במדויק את מוטציית המחיקה ואת מוטציית ה-nonsense בכל הדגימות שנבדקו; הקווים המקווקוים מסמנים את מיקומו של רצף האוליגו המכיל RNA. טיפול בבסיס (Alkali) מונע תיקון גנתי על ידי האוליגו המכיל RNA; מוצגת תדירות הטרנספורמציה עבור האוליגו המכיל RNA ועבור האוליגו המכיל DNA בלבד. פסי השגיאה מייצגים את טעות התקן של הממוצע עבור שלוש טרנספורמציות עצמאיות לכל אוליגו.

האוליגו המכיל DNA בלבד מראה תדירות טרנספורמציה דומה עם ובלי טיפול בנתרן הידרוקסיד. לעומת זאת, תדירות הטרנספורמציה של האוליגו המכיל RNA יורדת לאפס לאחר טיפול בנתרן הידרוקסיד. לפיכך, התכשיר עם האוליגו המכיל RNA אינו מזוהם באוליגו המכיל DNA בלבד.

לפיכך, תדירות הטרנספורמציה שנצפתה היא ספציפית לאוליגו המכיל RNA. הרגע הצגנו כיצד ליצור היבריד RNA-DNA ברמה הכרומוזומלית וסקרנו את העברת המידע הגנטי מ-RNA ל-DNA גנומי בתאי שמרים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש באוליגואים מכيلي RNA באיכות מעולה ולעבוד בתנאים נקיים מ-RNA.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.