Name: Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למד כיצד להשתמש באדנובירוס להעברת Cre recomבינאז לפיברובלסטים עובריים של עכברים עם אלל Rac1 מוקף ב-loxP. שיטה זו מאפשרת מחיקת גנים מותנית יעילה לחקר דינמיקת אקטין ותפקיד Rac1 בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Rizaldy סקוט בהר סיני החולים בטורונטו, אונטריו עבור מתנתו של הראשוני Rac1 flox / flox fibroblasts העכבר עובריים. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקים NJ מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, MOP 2009-93526) ואת מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, RG 327372-06). SH ו MW נתמכים על ידי CGSMA ו cgs-M פרסים CIHR ו NSERC, בהתאמה. סטיב צוואות האולי ומלאני תרמו באופן שווה על הנייר הזה.

הפשרת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג fibroblasts עכבר קפוא עובריים (MEFs) (שנוצר בעבר מתרבויות העובר הפרט העיקרי) של חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הפשירי ידי טבילה בקבוקון מים ב 37 ° C עד מתערבל עם תוכן הם מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9mL של DMEM כי כבר השלימו עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תא 10 ס"מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא מופשר ירידה מבחינת הצלחת, סלע את הצלחת בעדינות לפיזור תאים צלחת מקום 37 ° C CO, 5% 2 החממה לילה. שים לב שאם תאים רגישים DMSO (מתהליך קריותרפיה), אמצעי התקשורת הראשוני יכול להיות מוחלף עם התקשורת לאחר טרי התאים דבק הצלחת (כארבע שעות ציפוי לתגובה). כמו כן שים לב כי מפגש של התאים לאחר ההפשרה תלויה במספר תאים קפואים, קצב התאוששות של תאים לאחר הקפאה, ושיעור הצמיחה של התאים. </li></ol> Passaging תאים <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים גדלו למעשה 100% confluency (כלומר: למחרת), לשאוב את התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ"ל של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 1mL של טריפסין המכיל 10mm EDTA צלחת מקום בחממה במשך כ 5 דקות, כדי לאפשר לתאים לנתק מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 9mL התקשורת לתאי trypsinized, פיפטה 2-3 פעמים כדי לפזר גושים, מוסיפים 1mL של השעיה זו ירידה מבחינת לצלחת חדש המכיל 9mL של התקשורת, במקום הזה לתוך 37 ° C חממה לילה . הנוכחות של FBS בתקשורת יהיה להשבית טריפסין לחילופין, תאים ניתן לכבס הראשון לדלל את טריפסין. </li></ol> ספירת תאים ו ציפוי על גבי תלושי לכסות <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים חממה, לרחוץ trypsinize כמו קודם, אלא שהפעם להוסיף 5-6mL התקשורת חזרה את התאים trypsinized במקום 9mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיפטה ביסודיות כדי להבטיח ניתוק מוחלט לתוך ההשעיה תא בודד, ולהסיר 15μL לשלב עם 15μL של trypan כחול בצינור microfuge נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה תא / trypan כחול על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, כדי להוסיף 15μL hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע כחול. ספירת התאים ברור / צבע (חי) באחד רשתות 4X4 על hemocytometer. חזור על פעולה זו מספר על שלוש רשתות אחרות 4X4 (מצוין, B, C ו-D) ולהשתמש המשוואה הבאה כדי לחשב את מספר התאים לכל μL של השעיה: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="משוואה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 1"></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקול, יש לנו קבעו כי ציפוי 30,000 תוצאות תאים צפיפות התאים המתאימים להדמיה בסיומו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את נפח תא ההשעיה הדרושים 30,000 תאים, השתמש המשוואה הבאה: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="משוואה 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 2"></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו במקום זכוכית סטרילית לכסות להחליק לתוך היטב כל מנה שישה היטב ולהוסיף 2ml של התקשורת זה היטב, ולאחר מכן להוסיף טיפה חכם מן ההשעיה הסלולרי שלך נפח הנדרש 30,000 תאים לתוך כל טוב. שים לב לכסות תלושי כוס משמשים בניסוי זה כפי שאנו יהיה לדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב מאוחר יותר, לא כל היישומים דורשים בהכרח מיקרוסקופ, ובכך מכסה מחליק לא ייתכן שתידרש. </li></ol> וירוס התמרה <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כמה שעות (או זמן מספיק על מנת להבטיח כי התאים לדבוק תלושי כיסוי) למשך הלילה, להסיר ולשטוף התקשורת תאים עם 1mL של סרום ללא DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של סרום ללא מדיה גם עבור כל תוספת של הנגיף. לצורך ניסוי זה, adeno-Cre וירוס הושג מסחרית מן Biolabs וקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטימיזציה של פרוטוקול קודם הראה כי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 500 מספק התמרה גן היעילה ביותר תוך MEFs ראשוני עם מעט או ללא השפעה על כדאיות התא. משרד הפנים יכול להיות מחושב באופן הבא: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="משוואה 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="משוואה 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 4"></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח מחושב של הנגיף ישירות היטב כל זה להיות נגוע, רוק בעדינות את הצלחת לפזר את התאים וירוס מקום לתוך 37 ° C חממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את הווירוס המכילים מדיה מן התאים ולשטוף תאים 1mL סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 2ml התקשורת קבוע היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של Rac1 תאים שהודגם בניסוי הזה, התרחשו שינויים מורפולוגיים בתאים על כ 72 שעות שלאחר התמרה. </li></ol> נציג תוצאות תאים היו לדמייןד על ידי צביעה עם צבע אקטין phalloidin (למטרות הדמיה בלבד) צילמו באמצעות TCS-Leica SP5 multiphoton מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר במרכז ניתוח מתקדם באוניברסיטת Guelph. איור 1 מציג את המורפולוגיה התכווצה מוארכת של Rac1 flox / flox תאים שנחשפו לנגיף adeno-Cre לעומת התאים אותו לא נחשף לנגיף. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. השוואה בין תאים Rac1 flox / flox נגוע adeno-Cre וירוס (משמאל) לעומת תאים נגוע מאותו מקור (מימין).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית על בריאות בעלי חיים.

הסרטון מלווה מדגים כיצד וירוס רקומביננטי יכול לשמש גן הבלו ספציפי במבחנה באמצעות Cre recombinase. הפיתוח של פרוטוקול זה אך לא לחשוף כמה נקודות מסוים ראוי להתייחסות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלי בטיחות פרופר תמיד צריך להיות מועסק בעבודה עם adenoviruses. חלוק מעבדה וכפפות יש ללבוש כל הזמן תוך כדי עבודה עם הנגיף. מדיה כלי פלסטיק צריכים להיות מטופלים עם אקונומיקה 10% לפחות במשך 30 דקות, כלי פלסטיק צריכים להיות autoclaved לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע חזר להקפיא הפשרת המניה וירוס כמו זה יכול להשפיע על titer וירוס ובכך להפחית את היעילות התמרה. כמויות קטנות של המניה אמור בתחילה להיות וירוס aliquoted לתוך צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MOIs החל 5-50 נבדקו במהלך התפתחות שיטת ושיעורי התמרה יעיל נצפו ברוב המקרים, ללא השפעות שליליות על כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Adeno-GFP נעשה שימוש גם במהלך פיתוח שיטה מהירה מסך יעילות התמרה. שליטה זו (או וקטור ריק) צריכה להתנהל במהלך הניסוי על מנת להבטיח כי זיהום ויראלי לבד אינו תוצאה של השינויים התאיים. באופן דומה, אם מוציא את הגן floxed עניין בתאים שלך אינו תוצאה של שינויים הסלולר (כלומר שינויים במורפולוגיה או הכדאיות), ואז מדביק את סוג התא אותו עם adeno-GFP הוא פקד חשוב להשתמש על מנת להוכיח כי התמרה וירוס התרחשות. </li></ul> מעבר לבחינת איתות מפלי בתרבות, הגישה adeno-Cre גם הועסק in vivo כדי להסיר תנאי גנים מחיות הניסוי 3,4, ו לתייג אוכלוסיות ספציפיות של תאים בתוך האורגניזם 6. המערכת adenovirus יכול גם להיות מותאם להציג גנים אחרים מאשר Cre recombinase לתאי המארח. שני היתרונות העיקריים של שימוש זה וקטור משלוח הם התמרה גבוהה ואספקה ​​יעילות גן, וחוסר אינטגרציה עם ה-DNA המארח. אולם, את הדור של adenoviruses רקומביננטי רומן יכול להיות עבודה אינטנסיבית. הפרוטוקול המתואר כאן ולכן רותמת את העוצמה של המערכת adenoviral ידי ניצול שפותחו בעבר adeno-Cre וירוסים, צימוד זה עם אלל floxed שלנו של עניין, Rac1. דרך לדפוק את הניסוי הזה מותנה, יש לנו אישר כי התמרה באמצעות וירוס adeno-Cre של MEFs נושאת אלל Rac1 floxed אכן לגרום כריתה של Rac1 המוביל את השינויים האופייניים מורפולוגיה תאית של תאים Rac1 מחסר 2,5.

<table><tbody><tr><td>נגיף Ad-CMV-Cre</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>מצע DME עם ריכוז גלוקוז גבוה, 500 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS ממקור קנדי, 500 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת PEN-STREP בריכוז 1X, נפח 100 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב cultured fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

היכולת גנטית להסיר רכיבים ספציפיים של מפלי איתות שונים בתא כבר כלי אינטגרלי ניתוח אות המודרנית התמרה. שיטה אחת מסוימת כדי להשיג זאת היא באמצעות מחיקה מותנה שימוש במערכת Cre-loxP. שיטה זו כרוכה איגוף את הגן של עניין עם אתרי loxP, שהם רצפי הכרה ספציפית לחלבון recombinase Cre. חשיפה של ה-DNA המכונים (מוקף אתר loxP) floxed זה תוצאות האנזים במקרה Cre בתיווך רקומבינציה באתרי loxP, ואת הבאים כריתה של הגן להתערב 3. קיימים מספר שיטות שונות כדי לנהל Cre recombinase לאתר של עניין. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השימוש adenovirus המכיל את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי עובריים (MEFs) המתקבלים עוברים המכילים אלל floxed Rac1 1. הרציונל שלנו לבחירת Rac1 MEFs לניסויים שלנו היא כי שינויים מורפולוגיים ברור ניתן לראות על מחיקה של Rac1, עקב שינויים cytoskeleton אקטין 2,5. 72 שעות לאחר התמרה ויראלי ביטוי Cre, התאים היו מוכתמים באמצעות צבע אקטין phalloidin הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. היה נראה כי MEFs שנחשפו לנגיף adeno-Cre הופיע התכווץ ומוארך במורפולוגיה לעומת תאים נגוע, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 2,5. השיטה adenovirus המסירה recombinase Cre יתרון כמו וירוס adeno-Cre זמין בקלות, באמצעות מחיקת הגן Cre של כמעט 100% של התאים ניתן להשיג עם זיהום adenoviral אופטימיזציה.

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

היכולת להסיר גנטית רכיבים ספציפיים של שרשראות העברה שונות של אותות תאיים היוותה כלי בלתי נפרד במחקר המודרני של העברת אותות...

ניתוח גנטי מודרני נשען במידה רבה על טכניקות המאפשרות הסרה ממוקדת של גנים ספציפיים מתאים, איברים או אורגניזמים שלמים. ניסויי knockout אלו מסייעים בחשיפת תפקידו של הגן בהקשרו התאי. הפנוטיפים המולקולריים, המורפולוגיים והפיזיולוגיים של ה-knockout מספקים רמזים לגבי תפקידם של תוצרי הגנים המקודדים על ידי הרצף שנמחק.באורגניזמים מודל כגון עכברים, שיטה נפוצה להשגת מחיקה מותנית של גן היא על ידי הקיפת הגן או האקסון הרלוונטי עם אתרי loxP, המשמשים כרצפי זיהוי עבור האנזים Cre Recombinase. כריתה בלתי הפיכה של האלל המוקף (floxed allele) מזורזת לאחר מכן על ידי Cre, ובכך מוסר הרצף מהגנום. קיימות מספר שיטות שונות להחדרת Cre Recombinase למערכת, כולל שיטות המבוצעות in vivo ושיטות העובדות ישירות עם תאים מבוססים.עבור יישום זה, נשתמש באדנו-וירוס כדי להוביל Cre לתאי פיברובלסט שבודדו ותורבדו מעכבר טרנסגני הנושא אלל flox. שיטה זו מביאה ליעילות של כמעט 100% בהעברת הטרנסגן. כאשר הווירוס מוחדר לתאים, הוא נבלע בתוך שלפוחית אנדוציטוטית ומועבר למעטפת הגרעין, שם ה-DNA שלו, כולל הטרנסגן הרלוונטי, יכול לחדור לגרעין דרך קומפלקס התאיים (pore complex).המכשור התאי יכול אז לתמלל את הגן המוזרק ולאפשר לתוצרי החלבון שלו לפעול על התא. במקרה זה, אנזים ה-Cre Recombinase המקודד ויראלית גוזר את האלל המסומן (flocked allele) מגנום תא המאחס. אנחנו ממעבדת ג'ונס באוניברסיטת גואלף בגואלף, אונטריו, קנדה.במעבדתנו, אנו מתעניינים במושג של העברת אותות ובמה שקורה כאשר מסירים רכיבים ספציפיים משרשראות שונות של העברת אותות. היום נבחן שרשרת הקשורה לארגון אקטין. העברת אותות מתבצעת על ידי סדרה של רכיבים ביוכימיים המעבירים מידע ומעוררים שינויים פנוטיפיים, כגון ארגון מחדש של אקטין.החלבון הנחקר שלנו הוא RAC1, חלבון GTPase קטן החשוב בתיווך דינמיקת אקטין, כולל היצמדות תאים, נדידה ומורפולוגיה. בחקירה זו, נשתמש במערכת CRE LAX P כדי להסיר גן זה ולאשר את תפקידו בתא. בעבר, תאי פיברובלסט מעכברי עוברים עם אלל floxed של RAC1 בודד, בודדו 12 ימים לאחר ההפריה.תאים אלו הועברו לאחר מכן לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך, ונתחיל על ידי הפשרת מבחנה בודדת של תאים אלו המייצגים עובר אחד. בעת ביצוע ניסויי תרבית תאים, חשוב לשמור על סביבה סטרילית. פעולה זו כוללת ניגוב של המשטחים החשופים של מנשף זרימה מאושר, וכן ריסוס של כל בקבוקי הריאגנטים וציוד המעבדה הנכנסים למנשף ב-70% ethanol.לאחר הכנת מנדף הזרימה, הפשיתו את התאים על ידי טבילת המבחנה בכלי עם מים בטמפרטורה של 37 °C עד שהתוכן יהיה נוזלי. לאחר מכן, סטריליזו את המבחנה ב-70% ethanol והוסיפו את תגלי התאים. טפטפו אותם על צלחת של 10 ס"מ המכילה 9 mL של DMEM, מצע עם רמות גלוקוז גבוה שתוספו לו 10% fetal bovine serum ו-1% penicillin.סטרפטומייצין, נער את הפלטה בעדינות כדי לפזר את התאים והכנס אותה למדגרה בטמפרטורה של 37 degree עם 5%CO2, וזכור לסמן את הפלטה עם המידע המתאים. התאים מגיעים בדרך כלל ל-100%co fluency בתוך 24 שעות. בנקודה זו, ניתן להעביר את התאים לפלטה חדשה.כדי לבצע זאת, התחילו בשאיבת המצע הישן. הוסיפו 5 ml של PBS סטרילי כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן הסירו גם אותו. כעת הוסיפו 1 ml של trypsin המכיל 10 mM EDTA.הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך כחמש דקות כדי לאפשר לתאים להיפרד מהסובסטרט. החזירו את הצלחת למנדף הזרימה (flow hood) והוסיפו תשעה ml של מצע חזרה לצלחת שעובדה בטריפסין, ובכך דללו את התאים ביחס של 1:10; העבירו את הנוזל באמצעות פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפרק גושי תאים, ולאחר מכן הוציאו 1 ml מהסספנסיות והוסיפו אותה בטפטוף לתשעה ml של מצע טרי בצלחת חדשה בקוטר 10 cm. שוב, נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים והניחו אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C.כאשר התאים הגיעו למצב של התמזגות (confluence), השלב הבא הוא זריעתם על לבישי זכוכית כדי שניתן יהיה לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה. הכינו את התאים באמצעות אותה טכניקה המשמשת לאריזה, עד לשלב הוספת ה-trypsin לתאים והנחתם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. בזמן שהתאים נפרדים מהצלחת, הכינו צלחת שש-בארים עם לבישי זכוכית, כאשר משתמשים בלביש זכוכית שעבר עיקור באוטוקלאב לכל באר.לאחר שהתאים התנתקו מהפלטה, הוסיפו חמישה עד שישה מיליליטרים של מצע גידול חזרה לתאים שעוברו בטריפסינציה. בשלב הבא של הניסוי, תבוצע ספירת תאים כדי שניתן יהיה להושיב מספר מתאים של תאים להדבקה ויראלית יעילה. כדי לספור את התאים, ערבבו 15 µL מהדגימה עם כמות שווה של tripan blue באמצעות שאיבה ופליטה בפיפטה לערבוב, והוסיפו 15 µL מתמיסה זו להמוציטומטר.תאים מתים ייראו ככחולים. בהכנה זו, ספרו רק את התאים החיים או חסרי הצבע ברשת של ארבע על ארבע כדי לחשב את מספר התאים למיקרוליטר. התחילו בספירת תאים בארבע רשתות נפרדות, A עד D, וחשבו את הממוצע. לאחר מכן, הכפילו ערך זה בשניים כדי להתחשב בדילול ב-trian blue.מכיוון שהסריג מכיל עשירית מיקרוליטר, הכפילו ב-10 כדי לבטא את המספר כתאים למיקרוליטר. לאחר מכן, קבעו את הנפח הנדרש על ידי חלוקת מספר התאים הרצוי בריכוז התאים שחושב קודם לכן. הוסיפו את הנפח המחושב של ת сусפנזיית התאים בטיפות לכל באער של צלחת ששת הבארים.השאירו תאים אלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, יתווסף נגיף לתאים. ה-den creek virus שהושג מ-Vector B labs חולק לאליקוטים ואוחסן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.הוציאו את הווירוס הזה והחזירו אותו למכבסת הזרימה הלמינרית. הוציאו את הצלחת בעלת ששת הבארים מהאינקובטור והעבירו אותה למכבסת הזרימה. שאבו את המצע ושטפו את התאים עם 1 mL של DMEM נטול סרום.כעת הוסיפו 1 ml של מצע ללא סרום לכל באר לצורך הוספת הנגיף. עבור יישום הנגיף, אנו משתמשים בריבוי זיהום (multiplicity of infection) או MOI של 500. אופטימיזציה של הפרוטוקול בוצעה בעבר באמצעות MOIs שונים, ומצאנו כי MOI של 500 סיפק שיעורי זיהום יעילים ביותר עם השפעה מועטה או ללא השפעה על חיות התאים.כדי לחשב את ה-MOI השתמשו במשוואה הבאה. התחילו בחישוב מספר הנגיפים הדרושים, זאת על ידי הכפלת ה-MOI המבוקש, במקרה זה 500, במספר התאים לבאר, כלומר 30,000. כדי לקבוע את נפח מלאי הנגיפים שיש להשתמש בו, הכפילו את מספר הנגיפים ב-1000 וחלקו זאת בריכוז הראשוני של הנגיף. במקרה זה, נוסיף 1.5 µL ממלאי הנגיפים לכל באר שנועדה להדבקה.נענעו בעדינות את הפלטה כדי לפזר את הווירוס והניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. למחרת בבוקר, הסירו את מצע הווירוס מהתאים, שטפו עם PBS והוסיפו לתאים 2 mL של מצע רגיל. בניסוי זה, מצאנו כי שינויים פנוטיפיים התרחשו בתאים תוך כ-72 שעות.תאים שנצבעו באמצעות Acton din דומו באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקאלי רב-פוטוני מסוג Leica T-C-S-S-P five במרכז האנליזה המתקדמת באוניברסיטת Guelph. הדבר חשף שינויים במורפולוגיה בין תאים נגועים לתאים שאינם נגועים. אלו שחסר בהם RAC one נראים מוארכים ודקים בהשוואה לתאים רחבים ושטוחים שלא נגועו.כאן הראינו שמערכת ה-ADOC crease היא שיטה חסונה להעברה יעילה של גנים לתאים, מעבר לחקר העברת אותות. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לבצע נשקיפת גנים (knock out) בבעלי חיים ניסייניים, או אולי כדי לסמן אוכלוסיות תאים ספציפיות באורגניזם. ניתן להשתמש במערכת האדנו-וירוס גם כדי להחדיר גנים אחרים מלבד Cree באופן עקרוני.היתרונות בשימוש בשיטת הובלה זו כוללים יעילות גבוהה, אפקטיביות והיעדר אינטגרציה עם ה-DNA של תא המארח. עם זאת, ייצור של אדנו-וירוסים נפוצים עלול להיות תובעני מבחינת כוח אדם. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן רותם את עוצמתו של המערכת האדנו-ויראלית באמצעות וירוס ה-ocre שפותח בעבר עם ה-RAC one mes המצומצם שלנו; באמצעות נטרון מותנה זה, הראינו ש-.אם כן, המורפולוגיה אכן תלויה באופן חלקי ב-GTP קטן כגון RAC. לסיכום, אנחנו ממעבדת ג'ונס נרצה רק לומר תודה שצפיתם בסרטון שלנו ובהצלחה בכל המחקרים העתידיים שלכם.

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף...

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח...

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייצור והאפיון של אורגנואידים אורותליאליים של עכברים, תוך מחיקות בגנים בעלי עניין. השיטות כוללות קצירת תאי אורותל של עכבר, התמרת ex vivo עם אדנו-וירוס המניע את ביטוי Cre עם מקדם CMV, ואפיון in vitro כמו גם in vivo .

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

פרוטוקול זה מתאר כיצד הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המועברת על ידי AAV8 משיגה את אותה יעילות הפלת גנים בכבד כמו הזרקת וריד פורטלי, המייצגת הליך פשוט יותר עם תמותה וסיבוכים נמוכים בהרבה סביב הניתוח ואחרי הניתוח.

הפלת גנים יעילה בכבד באמצעות הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המסופקת על ידי נגיף הקשור לאדנו Serotype 8 (AAV8)

למד כיצד להשתמש באדנובירוס להעברת Cre recomבינאז לפיברובלסטים עובריים של עכברים עם אלל Rac1 מוקף ב-loxP. שיטה זו מאפשרת מחיקת גנים מותנית יעילה לחקר דינמיקת אקטין ותפקיד Rac1 בתאים.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

גלה סרטונים נוספים