עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע"י SCNT

עכברים טרנסגניים לרצפטורים של תאי T ספציפיים לאנטיגן היו חיוניים במחקרי התפתחות ותפקוד של תאי T, כדי ליצור מודלים של עכברים בעלי ספציפיות מוגדרת מראש של רצפטורי T באמצעות העברה גרעינית של תאים סומטיים או SCNT. עכבר מודבק בפתוגן הרלוונטי. תאי T מבודלים מהעכבר ולאחר מכן מטוהרים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטית (fluorescent activated cell sorting).

תאי ה-T המטוהרים משמשים לאחר מכן להעברה גרעינית של תאים סומטיים. לאחר שהעוברים מגיעים לשלב הבלסטוציסטה, מבודלים תאי גזע עובריים. תאים אלו מוזרקים לאחר מכן לבלסטוציסטות, אשר מועברות לאחר מכן לעכברים בהריון דמה.

הגורים המתקבלים מראים עלייה מובהקת באוכלוסיית תאי ה-T הרלוונטית, שניתן לאמת באמצעות אנליזת PAX. שלום, שמי Okta AK ואני פוסט-דוקטורית כאן במכון וייט למחקר ביו-רפואי. היום אראה לכם כיצד לבצע הזרקות סיוע בהבטחה (blast assist injections) להעברת CLE סומטית, כמו גם העברת עוברים.

היתרון העיקרי של העברה סומטית הוא שניתן ליצור מודלים של עכברים המבטאים את רספטור תאי T שלהם מהלוקוס האנדוגני, ולכן תחת בקרתו של הפרומוטור האנדוגני, וכן שניתן ליצור מודלים של עכברים במהירות רבה. ניתן להשתמש בהעברה סומטית של נוזלים ככלי ליצירת מודלים של עכברים עם ספציפיות מוגדרת מראש של רספטור תאי T או רספטור תאי B. נושא זה הוא בעל עניין מיוחד עבור חוקרים הפועלים בתחומים כגון אוטואימוניות, מחלות זיהומיות וסרטן.

כדי לבודד תאי T ספציפיים לנתיב של פתוגן כגון Toxoplasma Gandhi, המדמה זיהום באמצעות הזרקה תוך-פריטונאלית בשיאו של התגובה החיסונית, מבודד הטחול מהעכבר לאחר קריפה, ותאי תורם הומוגניזים מבודלים ולאחר מכן מדגגים עם נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית ועם הטטראמר המתאים. לבסוף, מבוצע מיון תאים (FACS) כדי להשיג תאי T ספציפיים לפתוגן. בערב שלפני פרוצדורת הוצאת הגרעין מהביצית (oocyte enucleation).

הכינו מחטי הזרקה של piso בגדלים של ארבעה, חמישה ושבעה מיקרומטר באמצעות מזרק כדי להטעין אותן בבנזיל-כספית בשיטה רטרוגרדית. למחרת, התחילו בפרוטוקול להעברת גרעין של תא סומטי על ידי איסוף ציטות, ולאחר מכן, באמצעות פיפט פה, העבירו אותן לטיפות של מצע K-S-O-M-A-A בתוך צלחת פטרי. במכסה של צלחת הפטרי.

הכינו פלטה לביצוע העברה גרעינית של תאי סומטיקה (SCNT) על ידי הנחת כ-10 טיפות של PVP, כ-10 טיפות של HCZB המכיל 5 µg/mL של cyto B וכ-10 טיפות של HCCB המכיל 2.5 µg/mL של cyto B. פלטה זו תיקרא פלטת S-C-N-T-A. הניחו את פלטת ה-S-C-N-T-A על הבמה של מיקרוסקופ פתוח (inverted compound microscope).

לאחר מכן, הכנס מחט דנוקליאציה של seven micrometer לתוך המיקרו-מניפולטור ושטוף אותה על ידי שאיבה לתוך תמיסת PVP להשלכה 5 עד 10 פעמים. לאחר מכן, העבר 10 עד 30 ציטות שעצורו בשלב metaphase two מתוך פטריית הבקרה לאחת טיפות ה-HCCB עם five micrograms per milliliter של Cyto B על לוח ה-S-C-N-T-A. דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; במהלך הדגירה, יישרו את הציטות באופן אופקי.

לאחר חלוף חמש דקות, השתמש במחט האנוקולציה (enucleation needle) כדי להניח אוציט לפני מחט ההחזקה. באמצעות מיקרו-מזרק, גרם לוואקום כדי לקבע את האוציט למחט ההחזקה של המיקרו-פיפט.

בשלב הבא, בעזרת מחט הדי-נוקליאציה (enucleation needle), סובב את הביצית עד שקומפלקס כישורי הכרומוזומים, הנראה שקוף יותר בהשוואה לציטופלזמה, נמצא בשעה שלוש, והפעל פולס פיזו (pizo pulse) על ידי לחיצה על הדוושה כדי לחדור את ה-zop lucida. פולס פיזו הוא פולס מכני הנע לאורכה ומרטט את קצה מחט הדי-נוקליאציה. רטטי הקצה מסייעים בקידוח דרך ה-zop lucida.

לאחר חדירה דרך ה-zona pellucida, מקמו את פתח מחט הגרעין (nucleation needle) בסמיכות לציר המטפאזה II (metaphase two spindle) והפעילו את הוואקום. קומפלקס הציר והכרומוזומים יספג לאט אל תוך המחט. לאחר הוצאת המחט, הממברנה צפויה להיסגר מעצמה.

לבסוף, העבירו באמצעות פיפט פה את התאים לאחר הפינוקליאציה חזרה אל טיפות ה-K-S-O-M-A-A. לאחר מכן, באמצעות אותו פיפט, שטפו אותם על ידי העברה מטיפה לטיפה של KSOM AA. כדי לבצע העברה גרעינית, החליפו את מחט הפינוקליאציה בקוטר 7 מיקרומטר על המיקרו-מניפולטור במחט העברה גרעינית בקוטר 4 עד 5 מיקרומטר. שטפו את המחט עם PVP כפי שנעשה קודם לכן.

העבירו שמונה תאי T חיוביים ל-CD שבודדו קודם לכן לתוך טיפה של PVP על לוח S-C-N-D-A. ערבבו היטב והדרימו למשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 10 עד 30 תאי cytes ENUCLEATED לתוך טיפה של HCZB בריכוז 2.5 micrograms per milliliter.

דגסו את ה-Cyto B על פלטת S ct. למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, השתמשו במחט להעברה גרעינית כדי לסדר את התאים בשורה אופקית באמצעות מחט ההזרקה.

שאבו תא תורם חיובי ל-CD8 מתוך תרחיף ה-PVP והניעו אותו פנימה והחוצה עד לפירוק הממברנה החיצונית. במידת הצורך, השתמשו בפולס פיזו (piezo pulse) עד שיהיו גלויים שברים של הממברנה והציטוזול. שאבו את הגרעין אל תוך המחט.

לאחר מכן, המשיכו לאסוף גרעינים עד להגעה ל-10 עד 30 גרעינים. לאחר מכן, עברו לטיפה המכילה את התאים המנוקלאים (enucleated cytes) המיושרים. הפעילו את הוואקום כדי לקבע ציטה אחת למחט ההחזקה.

לאחר מכן, מקמו את מחט ההעברה הגרעינית (NU nuclear transfer needle) בסמוך ל-zop lucita, כאשר הגרעינים מכוונים הרחק מהפתח. הפעילו פולס פיזו (pizo pulse) עד שהמחט תחדור דרך ה-zop lucita. הזיזו בזהירות את המיקרו-מניפולטור כדי להעביר גרעין אחד לקצה המחט.

דחפו את המחט לתוך הביצית עד ששני שלישים מקצה המחט נמצאים בתוכה. הפעילו לחץ שלילי קטן כך שחלק קטן מקרום הביצית יישאב אל תוך המחט. השלב הבא הוא קריטי ביותר.

מכיוון שזהו הזמן היחיד שבו התבצית פתוחה בפועל, יש להפעיל פולס ZO בודד. לאחר מכן, יש להפעיל לחץ חיובי כדי לדחוף את הגרעין החוצה מהמחט.

משכו לאחור בזהירות את המחט כך שהחוד יהיה בערך בשליש מדרכו בתוך האוציט, ולאחר מכן הפילו לחץ שלילי והמשיכו למשוך את המחט לאחור כדי לאטום את האוציט. חזרו על שלב זה עבור כל אוציט.

לאחר שכל התבويضות קיבלו גרעין, העבירו אותן לצלוחית פטרי ושטפו אותן על ידי העברה מטיפה לטיפה של מצע KS OM AA שהודגרה ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות לפחות. לאחר ההדגרה, העבירו את עוברי ה-SCNT לטיפות של מצע הפעלה נטול סידן המכיל strontium chloride. ה-strontium chloride מפעיל את התבציוה על ידי השראה של תנודות סידן שמתרחשות באופן דומה במהלך ההפריה.

דגרו למשך שש שעות. במידת הצורך, הוסיפו TSA, המהווה מעכב לא ספציפי של היסטון דאצטילאז, למצע ההפעלה. כדי לשפר את היעילות לאחר ההפעלה, בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע את מספר הפסאודו-פרונוקלאי או עוברי SCNT חיוביים ל-PPN. ניתן לזהות את ה-PPN על סמך מראהם.

הם נראים כמו ביצים. שטיפה ותרבית של צד אחד. העוברים וטיפות K-S-O-M-A-A למשך שלושה וחצי ימים ב-37 °C עד שהם מגיעים לשלב הבלסטוציסט.

בתחילה, עליכם להתמקד בביצוע נכון של הפרוצדורות שהראינו עבור גרעין (nucleation) והעברה גרעינית (NU nuclear transfer). לאחר שתשלטו בטכניקות אלו, יהיה קל יותר לנהל את הפרוצדורות הבאות. תאי הגזע העובריים (ES cells) ששימשו כאן הופקו באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

יש להכין אלו ביום ההזרקה בסיוע של blast, שלושה וחצי ימים לאחר הזיווג. הכינו את המכסה של צלחת בקטריאלית סטרילית על ידי מריחת טיפות המכילות PVP ו-HCZP. לאחר מכן, הכינו מחט הזרקה של 15 µm עבור פולס ה-piso כפי שבוצע קודם לכן.

בשלב הבא, מקמי את מחט ההזרקה במיקרו-מניפולטור ושטפי אותה באמצעות העברה של PVP. בצעי 10 עד 30 פולסים של עזר-הזרקה (blast assists) לתוך טיפה של HCZB. לאחר מכן, העבירי 5 עד 50 µL של תמיחת ה-ESL לתוך טיפה נוספת של HCZB.

יש להשתמש בכמות מספקת של תאי ES כך שניתן יהיה לשאוב אותם בקלות, אך ללא צפיפות יתרה. לאחר מכן, שאובו 30 עד 100 תאי ES באמצעות מחט ההזרקה. העבירו אותם לטיפה עם ה-blast assist.

יישרו את סיוע הפיצוץ (blast assist) באופן אופקי וקבעו אותו באמצעות מחט התמיכה על ידי הפעלת ואקום. השתמשו במחט ההזרקה כדי לסובב את סיוע הפיצוץ עד שהמסה התאית הפנימית (inner cell mass) תהיה בשעה תשע. מקמו את מחט ההזרקה בשעה שלוש.

ודאו שאין תאי ES בקצה המחט, והפעילו פולס של pico עד שמחט ההזרקה חודרת דרך ה zona lucida וה trifecta אל תוך ה blastocyst. שחררו בין 5 ל-15 תאי ES כך שיידבקו למסה התאית הפנימית. המשיכו עד שכל ה-blastocysts הוזרקו. לאחר סיום ההזרקות.

שטפו פעמיים ב-K-S-O-M-A-A והמשיכו להעברה כירורגית של העוברים לנקבות בהריון מדומם; הניחו עכברת מקבלת בהריון מדומם תחת הרדמה באזור הניתוח. בעזרת תספורת חשמלית, הסירו את הפרווה מהרביע הימני התחתון. חטאו את האזור באמצעות תמיסה מבוססת יוד ו-70% ethanol תחת מיקרוסקופ סטריאו.

השתמשו במספריים כדי לפתוח את העור, ולאחר מכן הניחו את המספריים במצב סגור בין העור לבין הפריטוניאום ופתחו אותם כדי להפריד את הפריטוניאום מהעור. אתרו את השחלה דרך הפריטוניאום, שצריכה להיראות כנקודה אדומה. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לפתוח את הפריטוניאום באזור זה.

השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בזהירות את ה-UCT או את השומן שמסביב, ושלפו את הרחם באמצעות קפילרה המחוברת למטפטפת פה (mouth pipette). אספו קבוצה של כ-10 בלאסטוציסטים תוך כדי החזקתו של השליח והרחם באמצעות פינצטה. השתמשו במחט כדי ליצור חור קטן ברחם.

לאחר מכן, הכניסו את הקפילרית עם הבלסטוציסט לתוך חלל הרחם ושחררו אותם. החזירו את הרחם אל חלל הבטן. אתרו את קצות הפריטונאום וסגרו אותו באמצעות מספר תפרים.

סגרו את עור העכבר באמצעות מספר סיכות. הגשו תרופה לשיכוך כאבים תת-עורית. לאחר מכן, העבירו את העכבר בחזרה לכלובו תחת מנורת חימום.

יש לעקוב אחר נשימת העכבר עד להתעוררותו. בעקבות תהליך ה-enucleation וההעברה של גרעין תא סומטי (somatic cell nuclear transfer), כ-70% מהעוברים היו חיוביים ל-pseudo pronuclei.

כפי שמוצג באיור זה. טיפול ב-TSA למשך שש או 10 שעות לא השפיע. לאחר שלושה וחצי ימים בתרבית, 5% עד 10% מהעוברים התפתחו לבלסטוציסטים.

שוב, להוספת TSA לא הייתה השפעה על קצב ההתפתחות לשלב הבלסטוציסט. הבלסטוציסטים שהופקו ב-SCNT שימשו לאחר מכן להפקת תאי גזע עובריים. TSA שיפרה באופן משמעותי את השיעור שבו הופקו ESL מהבלסטוציסטים.

תאי S-C-N-T-E-S משמשים ליצירת עכברים כימריים. דם נשאב מעכברים אלו ומנותח לנוכחות של תאי T ספציפיים באמצעות ניתוח facts כפי שמוצג כאן. כאשר הדם נצבע עם נוגדן anti CDA וטטראמר ספציפי, ניתן לזהות אוכלוסייה כפולה חיובית.

דבר זה מעיד על כך שתא התורמש ששימש ל-SCNT היה בעל הספציפיות הנכונה. כעת הצגתי בפניכם כיצד לבצע העברת תאי LU סומטיים, הזרקות סיוע בבלסטוציסט (blast assist injections) והעברת עוברים. הנקודה החשובה ביותר שיש לקחת בחשבון היא טהורות תאי ה-T או תאי ה-B שלכם.

לאחר שלמדת כיצד לבצע העברה סומטית והעוברים שלך הגיעו לשלב הבלסטוציסט, תוכל לבחור בין העברתם ישירה לנקבות בהריון מדומם (pseudo pregnant) לבין שימוש בהם להפקת תאי גזע עובריים וליצירת עכברים כימריים.