שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק
28 באוגוסט 2010
טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה לשעבר vivo מצב בתקופות מוגבל המתאים בשלבים midgestation. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים תקן של התרבות שלנו עובר שלם חולדה לאחר E12.5 באמצעות המפרק מסוג התרבות מערכת בקבוק.
בביולוגיה התפתחותית, נעשה שימוש בבעלי חיים מגוונים עבור ניסויים. טכניקת גידול עובריים בחוץ (ex vivo) בוטאה כבר בשנות ה-50 והתפתחה לפני ביסוס המניפולציות הגנטיות המודרניות בחקלאות הוואית. ניתן להכווין באופן ישיר אזורים ספציפיים של העובר באמצעות הזרקה או טרנספקציה של גנים, ומכיוון שניתן לבצע מניפולציות בעובריים תחת מיקרוסקופ, תרבית עוברית שלמה מהווה כלי שימושי מאוד.
כאשר ברצוננו לחקור את תהליך הפיתוח הדינמי של עוברי ማוריאן לאחר ההשתחלה. צמיחתם של עוברי מאוריאן תלויה באופן קריטי בתפקוד ה-presenter, המגביל את תקופת התרבית. באופן כללי, ניתן לגדל עוברי חולדה בתרבית במהלך הימים העובריים 8.5 עד 14.5, ועוברי עכבר בימים E 6.5 עד 12.5.
במעבדה, אנו מגדלים עוברי חולדה ועכבר באמצעות מערכת תרבית מסתובבת. מערכת תרבית זו היא הנפוצה והמתאימה ביותר לתרבית של עוברי חולדה ועכבר במהלך תקופת ההריון המאוחרת, כלומר לאחר E 11.5 בחולדות ו-E 9.5 בעכברים.
בסרטון זה, נבקש להציג את הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו לתרבית רעבה (hungry culture) באמצעות עוברים של E 12.5 RU. בתנאי זה, ניתן לגדל את העובר למשך יומיים, זמן המספיק כדי לבחון מניפולציות יעילות שונות בתרבית עוברים. ישנם שני שלבים קריטיים להצלחת התהליך.
ראשית, יש לבצע את הליך הניתוח בדיוק רב כדי לא לפגוע בעובר, ובמיוחד בכלי הדם הראשיים (rod vessels). שנית, יש לבצע את ההליך במהירות המרבית, ודבר זה נכון במיוחד עבור עוברים מבוגרים יותר.
לדוגמה, במקרה של עוברי עכברים ביום E 10.5, יש להעבירם תוך 30 דקות. יישמנו טכניקה של תרבית עוברית שלמה עבור עוברי מוטציה של pack six. לדוגמה, ניתחנו את תבנית הנדידה של תאי נוירו-רדיאלים במוטנט על ידי סימון מספר קטן של תאים בצבע או על ידי השתלת תאים בעוברי רקע של wild type ושל מוטנט.
בנוסף, ביססנו שיטה להעברת גנים לעוברים של עכברים ושל דגי דניו (red embryos) בתרבית באמצעות אלקטרופורציה, המשתמשת בהלם חשמלי. אנו יכולים להחדיר באופן פשוט מבנים של גנים אקסוגניים, צורות דומיננטיות-שליליות ו-siRNAs לאזור המוחות המתפתחים. לפיכך, אנו יכולים לנתח בקלות תפקודי גנים באמצעות ניסויי אובדן תפקוד (loss of function) והגברת תפקוד (gain of function).
אנו חוקרים גם את התנהגותם של תאים המסומנים ב-GFP או RFP באמצעות תרבית איברים או תרבית פרוסות בעקבות השתלה או גידול. לפיכך, ניתן לבצע מגוון ניסויים תוך שימוש בתרבית איברים בשילוב עם טכניקות אחרות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מדגים את טכניקת תרבית העובר השל עבורו עוברים של חולדה לאחר שלב E12.5, תוך שימוש במערכת תרבית בבקבוק מסוג רוטטור. שיטה זו מאפשרת תרבית ex vivo במהלך שלבי אמצע ההיריון הקריטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
- טכניקות תרבית ex vivo
רקע
- טכניקת תרביות עוברים שלמים קיימת מאז שנות ה-50 של המאה העשרים.
- היא מאפשרת מניפולציות של עוברים לצורך מחקרים גנטיים.
- ניתן לגדל עוברים בתרבית במהלך תקופות התפתחותיות ספציפיות.
- הצמיחה תלויה בנוכחותו התפקודית של העובר.
מטרת המחקר
- לחקר תהליכי התפתחות דינמיים של עוברים לאחר השתרעות.
- לספק פרוצדורה סטנדרטית לתרבית של עוברים שלמים.
- להקל על המחקר בתחום הביולוגיה ההתפתחותית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת תרבית עוברים שלמים
- מערכת תרבית בבקבוק מסוג מסובב (Rotator)
- תנאי ex vivo עבור עוברים של חולדה
- תקופות תרבית מהיום העוברי 8.5 עד 14.5
תוצאות עיקריות
- גידול מוצלח של עוברי חולדה לאחר E12.5.
- הדגמה של פרוצדורות סטנדרטיות למניפולציה של עוברי חולדה.
- תובנות לגבי תקופות גדילה קריטיות של העוברים.
- ביסוס שיטה מהימנה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- טכניקת תרבית העובר השלם היא כלי בעל ערך בביולוגיה התפתחותית.
- היא מאפשרת את חקר ההתפתחות העוברית בתנאים מבוקרים.
- שיטות סטנדרטיות משפרות את השחזוריות במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת תרבית עוברית שלמה (WEC) מסוג רוטטור מאפשרת מניפולציה ותצפית ישירה על עוברי מכרסמים במהלך שלבים קריטיים של אמצע ההיריון, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. פלטפורמה זו, הפועלת ex vivo, מאפשרת התערבויות גנטיות ותאיות מדויקות, המקלות על תיקוף תפקודי של מטרות ובחינת מסלולים לפני ביצוע מחקרים in vivo. יכולת השחזור וההתאמה שלה הופכות אותה לנכס בעל ערך למחקר תרגומי ולסינון תיקי מחקר במידול התפתחותי ומחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מניפולציה גנטית או תאית ישירה לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות בעוברים של יונקים.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי אפשרות לביצוע מחקרי אובדן-תפקוד (loss-of-function) והגברת-תפקוד (gain-of-function) במערכת ex vivo מבוקרת.
- מסייע בהבהרת מסלולים ובבדיקת היפותזות בנקודות מפנה התפתחותיות מרכזיות.
- מספק פלטפורמה להערכת ההשפעה של התערבויות מועמדות על התפתחות עוברית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות עובריות עובדות וניתנות למניפולציה לצורך סריקה פנוטיפית או בדיקות מכניסטיות בהמשך.
- מאפשר הערכה כמותית וניתנת לשחזור של תוצאות התפתחותיות בעקבות הפרעה גנטית או כימית.
- תומך בסטנדרטיזציה ובמתיחות של הבדיקה לצורך מחקרים השוואתיים בין גנוטיפים או התערבויות שונות.
- מאפשר הערכה אמינה של תפקוד תרכובת או גן בהקשר רלוונטי פיזיולוגית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם שלבי התפתחות הרלוונטיים למחלה לצורך מידול של הפרעות מולדות או תפקודי גנים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למחקרים מנגנוניים בעוברי עוברים שלמים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות הבהרה מוקדמת של פגמים התפתחותיים בשלבי הפיתוח.
- מקל על גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים במערכת מבוקרת וניתנת למניפולציה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מערכת WEC מסוג רוטטור מגשרת על הפער שבין הגילויים הראשוניים למחקר הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת מניפולציה מונחית-השערה וניתוח כמותי של ההתפתחות העוברית. המערכת, הממוקמת בין בדיקות in vitro למודלים in vivo, מציעה פלטפורמה ייחודית למחקרים מכניסטיים ולהורדת סיכונים של מטרות טיפוליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות התערבות גנטית או תאית ישירה.
- סקר (Screening): מספק מערכות עובריות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, לצורך קריאות פנוטיפיות כמותיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של תוצאות התפתחותיות, נדידיות או מולקולריות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מנגוניים מוקדמים לבין מידול מחלות פרה-קליני ותיקוף של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וגמישה לשימוש חוזר במספר תוכניות גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, הדירים וניתנים להרחבה ex vivo למחקרים התפתחותיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי הבהרה מוקדמת של סיכון ביולוגי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של נכסים בשלב הגילוי בהתאמה לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באמבריולוגיה, מיקרו-דיסקציה וטכניקות מניפולציה ex vivo.
- נדרשת תשתית מיקרוסקופיה וציוד מיוחד לתרבית בבקבוקי סיבוב (rotator-type bottle culture).
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility) והשוואתיות של הנתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני מכרסמים שונים או שלבים התפתחותיים שונים.
- תקופת התרבית מוגבלת בשל התלות העוברית בתפקוד השליה, מה שמגביל את חלון הניתוח.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
