בדיקת פעילות של ליגנד Protozoacidal-ממוסס פפטידים נגד גוט הטרמיטים פרוטוזואה במבחנה (תרבות פרוטוזואה) ו In vivo (Microinjection לתוך טרמיטים במעי האחורי)

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים שליגנדים מסונתזים נקשרים באופן ספציפי לפרוטואזואה המפרקים תאית במעי של טרמיטים תת-קרקעיים מסוג form mosen, ושהליגנד המצומד לפפטיד ליטי הורג פרוטואזואה אלו in vitro בתרבית פרוטואזואה אנאירובית ו-in vivo על ידי הזרקה למעי האחורי של הטרמיט. דבר זה מושג תחילה על ידי מיצוי פרוטואזואה ממעי טרמיטים פועלים תחת תנאים אנאירוביים. השלב השני של ההליך הוא אישור הקישור של ליגנד מצומד לפלואורסצנט לפרוטואזואה ממעי טרמיטים in vitro.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא להראות שפפטיד ליטי המצומד לליגנד הורג פרוטוזואים של מעי הטרמיט in vitro. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא להזריק ליגנד מצומד לפלורוצור ופפטיד ליטי המצומד לליגנד למעי האחורי של הטרמיט כדי לאשר קישור והשמדה של פרוטוזואי המעי in vivo. באמצעות הזרקת תרביות של פרוטוזואים למעי האחורי של הטרמיט ומיקרוסקופיה פלורסצנטית, אנו מראים שליגנד המצומד לפפטיד ליטי נקשר ביעילות והורג פרוטוזואים של מעי הטרמיט in vitro ו-in vivo.

חיבור הליגנד לפפטיד הליטי העלה את הרעילות עבור הפרוטוזואה בהשוואה לפפטיד הליטי לבדו. בעוד שחיבור זה הפחית את הרעילות עבור אורגניזמים שאינםו יעד, כגון e coli, ככל הנראה מכיוון שהליגנד לא נקשר לממברנת התא הבקטריאלית, אובדן הפרוטוזואה מוביל למותם של הטרמיטים בתוך פחות משבועיים. הטכניקה המוצגת, המשתמשת בפפטידים ליטיים המצומדים לליגנד כדי להרוג את הפרוטוזואה הסימביוטית במעיים של טרמיטים תת-קרקעיים, היא חלק מהמאמץ לפתח טכניקות חלופיות להדברת טרמיטים.

בשל התלות המופחתת בחומרים כימיים, טרמיטים ללא הסימביונטים במעיים שלהם מתים. אנו מחלצים פרוטואזואים ממעי הטרמיט כדי להוכיח כי הליגנד נקשר לפרוטואזואים וכי הפפטיד הליטי של הליגנד הורג את הפרוטואזואים. חלקיקי עץ בתוך הפרוטואזואים מראים פלואורסצנציה עצמית. לכן, חשוב להשוות את התוצאות של פרוטואזואים שטופלו בליגנד פלואורסצנטי לפרוטואזואים שלא טופלו.

על מנת למנוע תוצאות חיוביות שגויות, אנו מזריקים את הפפטידים ישירות למעי האחורי, שכן אם הפפטידים יימסו לטרמיטים, הפרוטאז הנמצא במעי האמצעי ובמעי הקדמי יעכל אותם. באמצעות ספריות phage display מבית New England Bio Labs, זיהינו 19 רצפי פפטידי hep הנקשרים לפרוטוזואה. בחרנו באחד הליגנדים עם רצף פפטידי שהראה דמיון לגליקופרוטאינים משוערים המוכרים מממברנת ה-Trypanosoma brucei.

לאחר סינתזת הפפטיד, חיברנו את הפפטיד המסנתז למסמן פלואורסצנטי בקצה ה-C באמצעות סינתזת פפטידים במצב מוצק, תוך שימוש בשרף E-D-A-N-S novatech, כדי להעריך תכונות ליטיות של תצמידי פפטידים. בהליך זה, השתמשנו בתצמיד של הליגנד המסנתז והפפטיד הליטי ate, שסונתז מראש במתקן החלבונים של LSU יום אחד לפני הניסוי. השתמשו ב-sigma coat כדי לטפל בכל החומרים המשמשים למניעת ספיחה של protozoa או פפטידים לדפנות.

מרחו שכבה אחידה והניחו לייבש למשך הלילה לפני השימוש ביום למחרת. הכינו תיבת מאוורר בתוך תא כפפות (glove box) כדי להזרים אוויר באופן רציף בטמפרטורה של החדר דרך חומר מייבש ומארזי ערימה של זרז מסוג D, במטרה להפחית את רמות הלחות והחמצן למשך למעלה משעה. מלאו את תא הכפפות בזרם רציף של חנקן למשך 20 עד 30 דקות, והשתמשו בחנקן נוסף לשמירה על תנאים אנרוביים בעת הצורך.

בשלב הבא, הכין מצע Traeger U וכייל את ה-pH ל-7. סנן את המצע הסטרילי בתוך תא הכפפות באמצעות טיפ של 200 µL המחובר לצינור עם תערובת של 2.5% מימן, 5% פחמן דו-חמצני ו-92.5% חנקן למשך שעה אחת כדי להסיר שאריות חמצן בתא הכפפות. לאחר שהחומרים מוכנים, השתמש בפינצטה כדי להוציא פועלת טרמיט מתוך צלחת פטרי והטבל את הגוף כולו לתוך כוס כימית מלאה ב-70% ethanol, תוך החזקה עדינה של הטרמיט עם הפינצטה למשך כ-10 שניות. כדי להסיר מזהמי שטח, הוצא את הפועלת מה-ethanol והנח לה להתייבש על נייר Kim wipe נקי למשך כ-20 שניות.

בתוך תא הכפפות, הכין זכוכית מיקרוסקופ סיליקלית עם 100 µL של מצע Trager U לאיסוף מעי הטרמיט, ומבחנה עם 900 µL של מצע Trager U לאיסוף הפרוטוזואים. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה ופינצטה סטרילית בעלת חוד דק, החזק את בטן הפועל ותפוס את קצה הבטן עם זוג פינצטות נוסף כדי למשוך בעדינות את המעי כלפי מעלה או מטה בזווית של 45 מעלות; נסה לאסוף ארבעה מקטעי מעי, כולל המעי האמצעי והמעי האחורי, כחתיכה אחת. הנח את מקטעי המעי בטיפה של 100 µL של מצע Trager U על זכוכית המיקרוסקופ.

בשלב הבא, דקרו את המעיים האחוריים באמצעות זוג גששים סטריליים ועדינים לניתוח כדי לשחרר את הפרוטוזואה, והעבירו בעדינות את תכולת המעיים באמצעות פיפטה של 200 µL למבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 1 mL המכילה 900 µL של Traeger media. המתינו חמש שניות לשקיעת שברי דופן המעי והעבירו 900 µL של הנוזל העליון למבחנה חדשה. העבירו מיקרוליטרים של תרבית הפרוטוזואה למסכיד זכוכית מצופה סיגמה.

הכינו סרט פתוח ובדקו את מצב הפרוטוזואה תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 200 פעמים. הכינו תרביות ביקורת של פרוטוזואה אירובית, tetra piriformis, amoeba, ug, gleaner ו-paramecium, וכן תרבית לילה של e coli במצע גידול כפי שהומלץ על ידי הספק מיד לאחר קבלת הפרוטוזואה; קבעו פרוטוזואה ממעי טרמיטים, ביקורות פרוטוזואיות אחרות ו-e coli עם 10% formaldehyde בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר מכן, סובבו את תמיסת הפרוטוזואה בצנטריפוגה ב-30 times gravity למשך 10 דקות.

שפכו את הנוזל העליון ושטפו פעמיים את המשקע המכיל את הפרוטוזואים המקובעים עם מיליליטר אחד של מצע Traeger U, השביעו את המשקע במיליליטר אחד של Traeger Edia והדגירו את המיקרואורגניזמים המקובעים למשך שעה אחת עד שעתיים עם 100 microliters של תמיסה של ליגנד סינתטי המצומד לצבע הפלואורסצנטי E-D-A-N-S, בריכוז סופי של 50 micromolar ליגנד המומס במים. בחנו את המיקרואורגניזמים שטופלו בליגנדים ואת הביקורות שלא טופלו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 400 פעמים, עם מקסימום בליעה ב-341 nanometers ופליטה באזור הכחול ב-471 nanometers.

כדי להעריך את תכונות הליטיות של הפפטיד הליטי המשויך לליגנד, העבירו בפיפטה שש מנות של 198 µL של תרבית פרוטוזואה שהוכנה כפי שהוצג בסעיף שלוש אל מבחנות Eppendorf בנפח 0.5 mL. הוסיפו 2 µL של תמיסה בריכוז 100 µM של פפטיד ליטי המשויך לליגנד למחצית מהמנות של תרבית הפרוטוזואה ממעי הטרמיט. כדי להגיע לריכוז סופי של 1 µM, הוסיפו 2 µL של מים סטריליים כביקורת למחצית השנייה של המנות.

לאחר שעה, העבירו 10 µL מכל תרבית פרוטוזואה לסרטית. השוו תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 200 פעמים את הישרדות הפרוטוזואה שטופלה בפפטיד ליטי מצומד לליגנד לעומת קבוצות הביקורת. משכו מחטים באמצעות מכשיר משיכת מיקרופיפטות NGI PC 10 בעל רמת חימום דו-שלבית. כדי להגיע לגודל קצה של 20 עד 30 מיקרון, ודאו את גודל הקצה על ידי מדידתו תחת מיקרוסקופ.

באמצעות מיקרומטר, מלאו מחט אחת בכ-30 µL של ליגנד מסומן פלואורסצנטית בריכוז 50 µM התלוי במים. באמצעות מזרק נספח, מלאו מחט נוספת במים עבור הביקורת. חברו מיקרו-פיפט להחזקה ולמיקרו-מניפולטור. חברו מחט למחזיק של מערכת ההזרקה במיקרו-מניפולטור שני.

הגדירו את פרמטרי ההזרקה הראשוניים לאורך פולס של כשנייה אחת וללחץ הזרקה של 10 עד 12 PSI. לאחר מכן, הכניסו את המחט לאט לתוך המיקרו-פיפט והזריקו את התמיסה באמצעות דום רגל לאחר ההזרקה. הוציאו את המיקרו-פיפט ורשמו את אורך התמיסה שהוזרקה.

באמצעות מדף (caliper), חשב את הנפח המוזרק על סמך הפרמטרים הידועים של המיקרו-פיפט, וכוונן את הלחץ ואת אורך הפולס כדי להוציא 0.3 µL של תמיסה. לאחר מכן, הכן 20 טרמיטים לכל טיפול לצורך הזרקה. עשה זאת על ידי לחיצה תחילה על קצה הבטן בעזרת פינצטה רכה כדי להוציא הפרשות הנמצאות ברקטום.

לאחר מכן, השתחו את פועלי הטרמיטים על ידי קירור על קרח למשך חמש דקות עד להשתחייתם. הכינו קולטנים להחזקת פועלי הטרמיטים על ידי חיתוך קצוות של טיפי פיפטה של 100 microliter. בעזרת להב סכין מנתח, חתכו את הקצה לאורך של 10 עד 12 מילימטרים והשתמשו בהם בהתאם לגודל הטרמיטים, והניחו אותם בתוך מבחנה.

בעזרת בורג, חבר את המקלט למיקרו-מניפולטור. הנח פועלת על פטריה כאשר היא על גבה, ושאב את הפועלת לתוך המקלט, ראש תחילה, באמצעות משאבת שאיבת חנקן, כך שקצה הפועלת בולט מהמקלט. תוך כדי החזקת התרמייט במקלט, הזרק בזהירות את המחט המולאה באמצעות המיקרו-מניפולטור אל תוך פיטום הפועלת. הזרק 0.3 microliters של הליגנד המסומן פלואורסצנטית או בקרה של מים.

העבירו את הפועלות שהוזרקו בליגנד או במים לצלוחי פטרי נפרדים עם נייר סינון לח, והשאירו אותן למשך לילה בטמפרטורה של 26 degrees Celsius ובלחות יחסיות של 78%relative humidity. לאחר 24 שעות, הוציאו את המעיים מהטרמיטים שהוזרקו ואספו את הפרוטואזוא כפי שהודגם בעבר. בחנו את קישור הליגנד בפרוטואזוא מטרמיטים מוזרקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להעריך את התכונות הליטיות של פפטידים ליטיים מצומדים לליגנד בטרמיטים חיים.

הכינו את חומרי ההזרקה, הציוד והטרמיטים כפי שנעשה בעבר עבור הזרקות, והזריקו 0.3 µL של תמיסת פפטיד ליטי של ליגנד בריכוז 500 µM או מים כביקורת למעי האחורי של 20 פועלי טרמיטים. לאחר 24 שעות, הוציאו מעיים מכמה פועלים ובחנו את תכני המעי תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 200 פעמים, ברגע שווידוא מותם של כל הפרוטוזואים במעי הטרמיטים שטופלו הושלם. שמרו את הטרמיטים המטופלים והביקורות שנותרו בצלחות פטרי עם נייר סינון לח ובחנו את התמותה מדי יום. אנו מאשרים כי הליגנד המצומד לגשוש פלואורסצנטי נקשר לשלושת מיני הפרוטוזואים, *P. grassi*, *H. hartmanni* ו-*S. laevis*.

ממעי האחורי של ארבעה טרמיטים תת-קרקעיים מסוג mosson, בצפיפויות שניתן לזהותן, התרחש קישור של ליגנד על פני השטח של התא כולו, והוא היה מרוכז באזור הקדמי של הפרוטואזוא על הציר, עדיין יריעה של מיקרוטובוליים והגרעין MP grass eye. זיהינו פלואורסצנציה גם בכל מיני הפרוטואזואים האירוביים חופשיי המחיה שנבחנו, מה שמרמז על כך שהליגנד נקשר למבנים גנריים של פרוטואזואים. בעוד שלא נצפה קישור של ליגנד עבור e coli, ריכוז של one micromolar של פפטיד ליטי של הליגנד הרג את שלושת מיני הפרוטואזואים ממעי הפועלים של טרמיטים מסוג omo ותת-קרקעיים, וכן את ה-tea piriformis חופשי המחיה in vitro, בתוך פחות מ-10 דקות, בעוד שקבוצת הביקורת נותרה בחיים.

תמונה זו מראה את האובדן הפרוגרסיבי של שלמות הממברנה של פרוטוזואים ממעי הטרמיטים שטופלו בפפטיד ליטי עם ליגנד. לא נצפתה הבדל במספר מושבות ה-e coli בין טיפול בפפטיד ליטי עם ליגנד לבין מים; פפטיד ליטי ללא ליגנד הפחית באופןconsiderably את מספר מושבות ה-e coli. דבר זה מרמז כי חיבור של ליגנד לפפטיד הליטי מגן במידה מסוימת על מיקרואורגניזמים שאינםו מטרה מפני ליזיס. הזרקה של 0.3 µL של פפטיד ליטי עם ליגנד בריכוז 500 µM הרגה את שלושת מיני הפרוטוזואים במעי של טרמיטים מסוג foremost וסוב-טרמיטים (subterranean) בתוך 24 שעות, והטרמיטים מתו לאחר 10 ימים כאשר הוזרק פפטיד ליטי מצומד לליגנד.

פרוטואזואים וטרמיטים מתו במהירות גבוהה פי שלוש מאשר כאשר הוזרקו פפטידים ליטיים שאינם מצומדים לליגנד, כפי שהוצג ב-husen and Colia 2009, מה שמעיד על כך שהליגנד מגביר את היעילות הקטלנית של פפטידים ליטיים כלפי פרוטואזואים תחת תנאי תרבית אופטימליים. שלושה מיני פרוטואזואה שהוצאו מהמעי של טרמיטים תת-קרקעיים מסוג Omo צריכים להישאר חיים ובריאים למשך שלושה ימים לפחות.

עם זאת, אם נשארים שאריות של חמצן במצע, תנועת הפרוטוזואה נפסקת באופן מיידי. אם נעשה שימוש במצע שגוי והלחץ האוסמוטי בתאים הופך לגבוה מדי, קרומי הפרוטוזואה בולטים החוצה והפרוטוזואה נקרעים. אם הלחץ האוסמוטי בתאים הופך לנמוך מדי או אם הקרומים נפגעים, הפרוטוזואה מתקמטים ומتقلצים. קיבוע של פרוטוזואה מקל על זיהוי הקישור של ליגנד מצמד פלואורסצנטי לפרוטוזואה.

קשה לזהות פלואורסצנציה ולהבחין בינה לבין אוטופלואורסצנציה של חלקיקי עץ כאשר הפרוטוזואה נעים בחופשיות. לאחר ששולטים בטכניקה זו, ניתן להזריק לכ-30 טרמיטים בשעה בעזרת עוזר. למרות שהליגנד colitic peptide פותח כדי להרוג סימביונטים של פרוטוזואה במעי של טרמיטים תת-קרקעיים ובכך לשליטה בטרמיטים, הוא עשוי להיות שימושי גם לפיתוח תרופות נגד טפילים מסוג פרוטוזואה כגון slash mania, ponoma, te ו-odium, הגורמים למחלות רבות בבני אדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג ולשמר בתרבית פרוטוזואים שחולצו ממעי הטרמיט, כיצד להראות קישור ספציפי של ליגנד לפרוטוזואים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כיצד להדגים במבחנה (in vitro) את פעולת ההתאבדות של הפרוטוזואים כתוצאה מחשיפה לפפטיד קוליטי המשמש כליגנד, ואחרון חביב, כיצד להזריק פפטידים למעי הטרמיט לצורך אישור בתוך הגוף (in vivo).