פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

אני ג'ורג' דימופולוס, ועכשיו נראה לכם נוהל כיצד להדביק את יתוש Aidas GTI בנגיף דנגי. והדבר הראשון שנצטרך לעשות הוא להפיץ את הנגיף בקו תאים של Aidas Aus. שמי חוזה לואיס רמירז, ואני דוקטורנט במעבדה.

לצורך הליך זה, נצטרך מתקן BSL 2 עם מכסה מנוע לתרבית רקמות, אינקובטור CO2 המוגדר ב-37 מעלות צלזיוס. אנו זקוקים לצינורות חרוטיים מפלסטיק של 50 מ"ל. אנחנו צריכים נסיוב אנושי, אנחנו צריכים אמבט מים, 37 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה.

אנו זקוקים ל-96 צלחות באר וביולוגיה מולקולרית סטנדרטית אחרת וביוכימיה, ריאגנטים וחומרים מתכלים. אז זהו הוד תרבית רקמה רגיל במתקן BSL 2, והצעד הראשון הוא להוציא את התאים שגדלו לשטף של 80% בבקבוק של 75 סנטימטר רבוע. זוהי מדיית MEM עם 10% חום, חום וסרום בקר עוברי פעיל בתוספת 1% L-גלוטמין וחומצות אמינו לא חיוניות.

אוקיי, עכשיו נוסיף את וירוס הדנגי לתאים. הוצאנו את מלאי הנגיפים מהמקפיא מינוס 80 והפשרנו אותו באינקובטור של 37 מעלות. אנו מוסיפים לתאים כ-0.5 מיליליטר וירוס מלאי כדי להשיג ריכוז של כ-1.5 חלקיקי וירוס לתא.

לאחר מכן מניחים את התאים על שייקר למשך כ-15 דקות בקצב ניעור איטי. לאחר מכן, התאים ממוקמים באינקובטור CO2 למשך כ-45 דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ריכוז ה-CO2 הוא 5%לאחר הדגירה של 45 דקות, נוציא את התאים ונוסיף 30 מ"ל מדיום, ואז נניח את התאים בחממה שוב ונדגור עוד חמישה ימים.

כעת נכין את חלקיקי הנגיף לזיהום. ראשית, עלינו לנתק את התאים מהבקבוק בעזרת מגרד ואז להעביר אותם יחד עם מדיה לצינור חרוטי של 50 מ"ל. עכשיו יש לנו תאי צנטריפוגה במהירות של 12,000 סל"ד למשך 10 דקות כדי להטיל אותם.

בתחתית הבקבוק הזה, אתה יכול לראות את הגלולה. לאחר מכן, נסיר את הסופרנטנט ונשאיר רק מ"ל אחד עם התאים על מנת לשחרר את הנגיף מהתאים. נקפיא אותם.

זה יקרע את התאים, ואז נפשיר אותם ואז נקפיא אותם שוב ונחזור על ההליך הזה שלוש עד ארבע פעמים וההקפאה נעשית על קרח יבש. לאחר ההקפאה, כדור התא מונח על אמבט מים של 37 מעלות כדי להפשיר אותם, ואז הם מוקפאים שוב על העיניים היבשות בין כל שלב הקפאה, WEP משהה את התאים באמצעות מערבולת. כעת אנו אוספים את הווירוס שמכיל סופרנטנט ומוסיפים אותו לסופרנטנט מהצנטריפוגה הקודמת, שמכילה גם חלקיקי וירוס.

תכשיר וירוס זה מוכן כעת לשילוב עם כמות שווה של דם אנושי מלא וסרום. כאן שילבנו את הכנת הנגיף עם דם אנושי מלא בתוספת 15% סרום אנושי. תמיסת וירוס הדם הזו תשמש כעת להאכלת היתושים ולהדבקתם.

אנו הולכים להוסיף את הדם הזה למזין ממברנה ומזין הממברנה הזה יונח על המכילה את היתושים וניתן ליתושים לאכול מהדם הזה במשך כ-25 דקות. הנחנו קליפ על מזין הממברנה על מנת לייצב אותו. זה מכביד אותו בעצם על הרשת, ועכשיו נוסיף את הדם למזין.

במקרים מסוימים, ניסוי זה עשוי לעבוד טוב יותר כאשר הוא נעשה בחושך מכיוון שבאופן טבעי יתושים ניזונים לעתים קרובות בחושך. זה תלוי כמובן באופן שבו מושבת היתושים הותאמה. היתושים ניזונו כעת במשך כ-25 עד 30 דקות, ואנו יכולים להסיר את מזין הממברנה ולהניח אותו במיכל בטוח לטיהור.

לאחר התאמת הדם, יש להוציא את היתושים הלא כשירים מהפד. כדי לעשות זאת, הפלנו את היתושים על ידי הנחת הכוסות הקטנות המכילות את היתושים הניזונים מדם בחדר קר למשך חמש עד 10 דקות. כפי שאנו רואים, היתושים כבר שקועים בקור.

אנו פותחים את המכסה ומעבירים את היתושים בכלי בנזין קטן, שנשמר על דלי קרח כך שהיתושים נשמרים בקור לאורך כל הדרך והם לא יכולים לברוח. זכרו, מדובר ביתושים נגועים, ולכן יש להקפיד לא לתת להם להשתחרר. ברגע שהיתושים נמצאים בחדר הקירור, מה שמעביר את היתושים למגזר הרגיל, שנשמר בטמפרטורת החדר, אבל אנחנו שמים את היתושים תמיד בצלחת הפטרו, שנשמרת בדלי הקרח, כך שהם שם כך שהם תמיד למטה.

אתה יכול לראות כיצד ניתן להסיר את יתושי הפד מאלה של UNFI. לאלה של הפד יש את הדם בתוכם. הם מלאים לגמרי.

חלקם ניזונו מדם באופן חלקי כך שהם לא מלאים לגמרי. יש להם דם קטן בבטן, אבל לאחרים יש הרבה דם בבטן. ל-UNFI אין דם בבטן, ולכן אתה יכול בקלות להבחין בין הפד לאלה שאינם מתאימים.

אז נעביר את היתושים האלה מצלחת הבנזין לכוסות הקרטון של קו השעווה. השלב הבא הוא בדיקת זיהום נגיף הדנגי ביתוש. אם אנו רוצים לבחון את זיהום הנגיף במעי האמצעי של היתוש, עלינו לנתח את היתושים בסביבות היום השביעי לאחר שהם לקחו את ארוחת הדם.

ואם אתה רוצה לבדוק את זיהום הנגיף בבלוטת הסאלי, עלינו לנתח את היתושים בסביבות 14 יום לאחר האכלת הדם, חוזה יראה לך כעת כיצד לנתח את המעיים מהיתוש. היתושים הורדמו כעת על קרח, ואנו נהרוג אותם באמצעות דגירה באתנול 70% למשך כדקה. לאחר מכן, אנו מעבירים את היתושים לשתי אמבטיות מים רצופות.

דקה אחת כל אחד. זאת כדי לשטוף את האתנול מהיתושים. כעת ננתח את היתושים ב-PBS בשקופיות מיקרוסקופ.

הדרך הטובה ביותר לנתח את המעי האמצעי מיתוש זמן גבס היא להניח את היתוש הפוך על כנפיו ולתפוס את חלק הבטן במלקחיים אחד ואת בית החזה במלקחיים אחרים, ואז למשוך את היתוש. עכשיו חוזה מפרק את היתוש והמעיים יופיעו בין הבטן לחלק בית החזה של היתוש. כעת המעי הוא הרקמה השקופה למחצה שהופיעה בחלקו העליון של היתוש.

כעת נעביר את המעי המנותח לתווך קו תאים ונביא אותו למכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי לבודד את חלקיקי הנגיף מהמעיים. אנו מביאים את המעיים האמצעיים המנותחים לחדר תרבית הרקמה ואנו מבצעים הומוגניזציה עם עלי על מנת לשחרר את חלקיקי הנגיף. לאחר הומוגניזציה של המעי האמצעי, אנו מוסיפים מדיום להומוגנאט כדי להשיג דילול של 1 עד 100 של חלקיקי הנגיף.

לאחר מכן אנו ממשיכים לדלל את זה עוד יותר לאחד ל-10, אחד ל-101 עד 1000. בצלחת 96 בארות, הכנו את קו התאים של אלבה פיקטו לשטף של 80% בצלחת של 24 בארות. לאחר מכן אנו מסירים את ה-sup natant מתאי ה-hiatus alba picto ולתאים אלה אנו מוסיפים את חלקיקי הנגיף המדוללים על מנת לקבוע את ריכוז חלקיקי הנגיף בכל דילול.

זה יאפשר לנו לקבוע את רמת ההדבקה של הנגיף. במעי האמצעי של היתוש, התאים מנערים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לאט. לאחר מכן אנו מניחים את התאים למשך 45 דקות באינקובטור CO2 של 37 מעלות.

לאחר מכן אנו מוסיפים מ"ל אחד של שכבת מתיל תאית 1% לכל באר, ואז הצלחת מודגרת שוב בחממת CO2 של 37 מעלות למשך חמישה ימים. לאחר הדגירה של חמישה ימים, אנו מוסיפים מ"ל אחד של מקבע מתנול אצטון לכל באר. לאחר מכן אנו דוגרים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במקרר למשך שעה.

לאחר מכן, אנו מסירים את הקיבוע ושוטפים כל באר פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, אנו מבצעים דילול של 1 עד 1000 של הנוגדן הראשוני נגד דנגי בתמיסת דם של 5%. לאחר מכן, אנו מוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים זו.

לכל אחד מהם, ובכן הזיזו את הראש. תודה. לאחר מכן, אנו דוגרים על הצלחת למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אנו מסירים את הנוזל ההיפר-אימוני ושוטפים כל אחד היטב עם XPBS אחד.

לאחר מכן, אנו חוזרים על ההליך בדיוק באותו אופן עם נוגדן משני. אנו מכינים 20 מ"ל מהמצע על פי הפרוטוקול, ואנו מוסיפים אותו למיכל. לאחר מכן אנו מוסיפים 200 מיקרוליטר מהמצע לכל באר.

בשלב הבא אנו עוצרים את התגובה על ידי הסרת המצע ומוסיפים מ"ל מים מזוקקים לכל באר. לאחר מכן אנו משליכים את המים מהצלחת ונותנים לצלחת להתייבש. כל נקודה צבעונית מייצגת רובד של וירוסים, ועל ידי ספירת הפלאקים הללו, אנו יכולים להעריך את מספר חלקיקי הנגיף שהיו במעי האמצעי המקורי של היתוש שהפכנו להומוגניים.

זה עתה הראינו לך את הנוהל כיצד לבצע זיהום בנגיף דנגי ביתוש מצרי. פרוטוקול זה כרוך בייצור וירוס בקו תאי היתושים. לאחר מכן מטוהרים חלקיקי הנגיף מקו התאים ומבודדים, והם מעורבבים בדם מלא אנושי ומוזנים ליתושים.

הנגיף ידביק את היתושים וברגע שההדבקה התבססה, הראינו לך כיצד לבודד את רקמת המעי האמצעית של היתוש וכיצד לקבוע את רמת הזיהום של המעי האמצעי הזה. אנו בעצם הופכים את המעי האמצעי להומוגניזציה ומשתמשים בהליך כדי לשחרר את חלקיקי הנגיף מהמעי האמצעי הזה. לאחר מכן אנו משתמשים בחלקיקי הנגיף הזה כדי להדביק שוב את קו תאי היתוש על מנת לקבוע את רמת הזיהום של המעי האמצעי, מספר חלקיקי הנגיף שהדביקו את המעי של היתוש.