פרוטוקול לגידול יתושים (א gambiae)

שמי שיש ואני פוסט-דוקטור במעבדה של ד"ר George OU בבית הספר לבריאות הציבור של John Hopkins. במחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה, אראה כיצד לגדל יתושים מהמין *Anopheles gambiae*. במעבדה, אנו מחזיקים אותם בחדר גידול חרקים, אשר מתוחזק בדרך כלל בטמפרטורה של 27 °C ובלחות של 80%.

חדר גידול החרקים מתוחזק גם הוא במחזור של 12 שעות יום ולילה, כדי שנוכל לחקות את התנאים השוררים בטבע. זהו חדר גידול החרקים שברשותנו, המהווה מתקן מרכזי כאן לגידול החרקים הללו. כפי שניתן לראות, ישנן כאן מגשים שונים המכילים את הפיתומיות בשלבים שונים: הביצה, השלבים השונים של הזחלים והבופות.

במגשים אלו ישנן זחלים, בני כ-11 או 12 ימים, וזוהי כלוב שבו אנו אוספים את היתושים הבוגרים ומחזיקים אותם בתמיסת סוכרוז 10%.

ביום הראשון יש להאכיל את היתושים בדם, ומכאן הצורך בהאכלה בדם באמצעות ממברנה מלאכותית. זהו מאכיל זכוכית, המשמש להאכלת היתושים באמצעות ממברנה. אנו מחדירים את הדם פנימה דרך החור הקטן שרואים, והוא נשמר בתוכו.

בתחתית הצד נמצאים שני פיתולי יציאה (nozzles), המחוברים לאמבט מים השומר על טמפרטורה של 37 °C. כדי לשמור על הדם חם ב-37 °C ולהכין את המזין להזנה, לוקחים פיסה קטנה של פריל (peril). מותחים אותה משני הקצוות ומכל ארבעת הצדדים, ואז מניחים אותה על הצד הפתוח של המזין הזכוכית כדי ליצור שכבה דקה של ממברנה, באופן המדמה את העור.

זהו מה שנקרא הזנת ממברנה. זהו אמבט מים עם סירקולציה, השומר על טמפרטורת המים ב-37 °C ומזרים את המים דרך המזין הזכוכית, כך שהדם נשמר חם ב-37 °C. אנו מחברים את המזין הזכוכית באמצעות קפילריות קטנות ומחברים אותן לאמבט המים עם הסירקולציה, ומפעילים את אמבט המים כך שהמים יזרמו; המים והדם אינם מתערבבים לעולם מכיוון שהם נמצאים בשני תאים נפרדים.

זהו כלוב של יתוש adulto מסוג Phis Gambi. זהו מאכיל הזכוכית, המחובר למסבב תרמי (circulating bath), אנו מניחים סגור בחלקו העליון של הכלוב ומוסיפים 200 µL של דם. הכלוב מכיל הן יתושים זכרים והן יתושים נקבות.

רק הנקבה מגיעה להזנה בדם. ההזנה נמשכת כ-30 דקות. יומיים לאחר ההזנה בדם, הנחנו כוסות ביצים בתוך כלוב הפסולים עבור הגשת הביצים.

כך מבצעים זאת. לוקחים כלי זכוכית קטן וממלאים אותו חלקית במים מזוקקים, לוקחים נייר ומספיגים אותו במים, לאחר מכן מקפלים אותו לצורת חרוט ומניחים אותו בתוך הכלי המכיל את המים המזוקקים, תוך וידוי שהנייר נרטב. כעת פותחים באיטיות את כלוב הפשיתיות, תוך הקפדה שלא לאפשר לאף פשית לצאת, ומניחים את כוסות הביצים בפנים.

ביום למחרת להנחת הכוסות בתוך הכלוב, כלומר ביום הרביעי, הן מוצאות מהכלוב באיטיות. אלו הם הביצים, השחורות, שביניהן נמצאים גם מספר יתושים מתים. לאחר שהביצים מוכנות, מניחים אותן על מגש פלסטיק.

ממלאים את מגש הפלסטיק במים מזוקקים. מוציאים את נייר המסנן עם הביצים ומניחים אותם בפנים. כמו כן, מוסיפים קורט של מזון, A, שהוא מזון דגים טחון, ומכניסים את המגש למדף.

עלינו להשוות את התבנית ביום שבו אנו מתחילים את העבודה עם התבנית, וכן לציין אילו מינים נמצאים כאן. זהו השלב שלאחר הנחת הביצים בתבנית, כלומר למחרת. אלו בני יום אחד, אך הפרוטוקול הממשי הוא ביום החמישי למחזור חיי היתוש.

אלו השחורים הם הביצים, שעומדות לבקוע לזחלים. ואלו הם המזונות עבור הפיתוייים. לגידול יתושים, אנו משתמשים בדרך כלל בשלושה סוגי מזונות שונים.

מזון A הוא למעשה מזון דגים טחון, ואנו מוסיפים מזון זה כאשר אנו מתחילים את תרבית היתושים, בשלב X, כך שבכל יום אנו מוסיפים שתי טבליות של מזון C, שהוא מזון חתולים שנרכש מ-Purina. לאחר שמונה או תשעה ימים, אנו מחליפים את המים במגש ומספקים מים טריים. ובזמן זה, במקום מזון A, אנו מוסיפים קמצוץ של מזון B, שאינו אלא מזון C טחון, כלומר מזון חתולים טחון, וכן מוסיפים שתי טבליות של מזון C, הביצים הבוקעות לזחלים.

קיימים שלושה שלבים שונים של הזחלים. הראשון בהתקנה, השני בהתקנה, והשלישי בהתקנה. אלו הן מגשים המכילים זחלים, אשר בני חמישה או שישה ימים.

אלו הם ה-Ravi, הנמצאים בשלב מאוחר בהרבה, גיל של תשעה עד 10 ימים. במהלך הזמן פעם אחר פעם הוחלף המים והתווספו מים טריים ומזון טרי. מגש זה מכיל הן את הבוגרים והן את ה-ppe.

אלו הם הבוגרים, כפי שניתן לראות, מעופפים תחת רשתות היתושים. ובקצה ניתן לראות את כל הפופות כהות הצבע, אשר יבקיעו לבוגרים. לאחר קבלת הבוגרים, הם מוכנים לאסוף לתוך כלוב, הנראה כך.

בתוכו ישנה ריפוד של נייר סופג ובקבוק קטן המכיל 10% super solution וקופסת סבון מכותנה, אשר ישמשו כמקור מזון עבור היתושים. כיסينا את המכסה, וזהו המכשיר, השואב, המחובר לוואקום שדרכו נאסוף את הבוגרים מהמגשים הללו. חלק זה של השואב מחובר כאן ובקצה השני.

מחובר לוואקום. נכניס את הכלוב, אליו נאסוף את הבוגרים לתוך הקופסה הקטנה הזו. זהו חלק נוסף מהשואב, הכולל צינור ארוך, שיוכנס לתוך מגש הפשישנקיות.

הצד השני יחובר לכלוב. יש לוודא שהכל מהודק, כדי שהוואקום יעבוד כראוי. אנו סוגרים את המכסה ומוודאים שהכל אטום היטב.

הפעילו לאט את מערכת האחורי (backend). ברגע שההגדרה מוכנה, נכניס לאט את הצינור הארוך הזה לתוך מגש היתושים, תוך כדי וידוא שאתם סוגרים את הרשת ושאינכם מאפשרים ליתושים לברוח. וכפי שניתן לראות, היתושים נאספים אל תוך הכלוב הקטן.

העבירו את השואב לאורך כל השטח באיטיות כדי לאסוף את כל הפרטים הבוגרים. כעת כמעט סיימתי. כל הבוגרים נאספו, והם כולם נמצאים בכלוב הזה, כפי שניתן לראות.

לאחר מכן, נשחרר באיטיות את הוואקום ונפרק את מכשיר האיסוף. אלה הם היתושים הבוגרים מסוג An. gambiae, שיהיו בכלוב זה למשך מספר ימים. הם יזינו תמיסת סוכרוז בריכוז 10%, ויינתן להם דם להזנה רק כאשר נרצה שהם יטילו ביצים.

הראיתי לכם כעת כיצelijk לגדל Mosquitoes. בתנאי מעבדה, השלבים החשובים הם אספקת הדם, לאחר מכן הנחת כוסות הביצים, מעקב אחר הביצים, ולאחר מכן הם עוברים שלבים שונים כגון לרוות, pupae ומבוגרים.

ולסיום, אנו אוספים את הבוגרים. חשיבותה של טכניקה זו היא שעלינו לחקות את התנאים הקיימים בחוץ, בתנאים טבעיים, כדי שנקבל יתושים בריאים, ולאחר מכן אנו מדביקים אותם ב-plasmodium ומבצעים סוגים שונים של מחקרים על המלריה, שמטרתם העיקרית היא למגר את המחלה מהעולם.