Name: תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למדו פרוטוקול להכנת תאים ראשוניים מעוברי Drosophila לצורך RNAi וניתוח הדמיה תאית. השיטה מאפשרת מחקר ביולוגיה תאית ומולקולרית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JB נתמכה על ידי דיימון רניון Cancer Research Foundation אחוות DRG-1716-1702. JZ נתמך על ידי NIH / NIGMS אחוות GM082174 F32-02. NP הוא חוקר של הווארד יוז רפואי במכון.

1. הכנת כלובים לעוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תסיסנית (wild-type זנים כגון אורגון-R או כל גנוטיפ) במיכלים נוח כמו 32 גרם כוסות חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים eclosed החדש לעובר איסוף כלובים גדולים או לטוס כלובים האוכלוסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הכלובים לחדר עם טמפרטורה של ~ 25 ° C ולחות ~ 65% באור 12 שעות ו מחזור כהה 12 שעות כדי להקל על אוסף של עוברי סינכרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על זבובים בכלובים מאכילים אותם הרג להדביק שמרים פסים על הצלחות מולסה. שנה את לוחות מולסה (עם שמרים להדביק הרוגים) פעם ביום במשך 2-3 ד </li></ol> 2. אוסף של עוברים סינכרוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ההכנה העיקרי תאים, להאכיל את הזבובים צלחות טרי wth מצופה שמרים נהרגו להדביק לתקופה 1-2 שעות, שכבה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני מחזור 12 שעות בחושך, להחליף את צלחות להניח מראש עם צלחות מולסה טרי מפוספס עם כמות מינימלית של להדביק שמרים. מחק את האוסף להניח מראש, אשר מכיל יותר עוברים אסינכרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים לתקופה של 1-2 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות המכילות את האוכלוסייה סינכרוני יחסית של עוברים חנות של 25 מעלות צלזיוס במשך 5-6 ח עוברים יהיה בשלב מתקדם gastrula בשלב זה. </li></ol> 3. איסוף כביסה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים מן צלחות עם מכחול רטוב, ולשטוף היטב במי ברז פושרים דרך להגדיר מוערמים הנפות, כך העוברים לאסוף במסננת רשת הטובים ביותר בתחתית. לשטוף למשך כמה דקות כדי להסיר כמו שמרים הרבה ופסולת לטוס ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצה מסננות כך העוברים לצבור בצד אחד, לשטוף אותם בעדינות מן המסננת לתוך סל dechorionation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר אל אזור בתרבית רקמה מכסה המנוע מבלי לאפשר העוברים להתייבש. </li></ol> 4. Homogenization של עוברים ציפוי של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטאים dechorionate את העוברים על ידי שיקוע שלהם ב -50% (כרך / כרך) מלבין 5-10 דקות. שוטפים את העוברים מהקיר סל עם 70% (כרך / כרך) אתנול. לחלופין, לשטוף באקונומיקה את העוברים עם מים מזוקקים לפני הטיפול אתנול. מנקודה זו ואילך העוברים צריכים להיות מטופלים בתנאים סטריליים ועל מכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו ביסודיות את העוברים כדי להסיר את אקונומיקה ו / או אתנול במים מזוקקים autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב dechorionation, למלא homogenizer Dounce עם נפח של המדיום המתאים לטמפרטורה M3 חדר מבוסס על כמות העוברים. היחס בין נפח של עוברים ושל התקשורת לא צריכה להיות על עוברי 0.5-מ"ל: 40 מ"ל התקשורת (או ~ 100-200 עוברי / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים שטפה בכוס מעוקר עם כמות של M3 התקשורת מספיק כדי להטביע את העוברים. בואו העוברים להשרות 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את סל dechorionation ומוחה את רשת Nitex יבש עם מגבות נייר מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים לתוך homogenizer עם מכחול מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize בעדינות בתנועות קצרות באמצעות העלי משוחרר בלי להגיע לתחתית של התחתית עד שכל העוברים מושעים. ואז בעדינות אך בתקיפות, homogenize עם שמונה משיכות מלא. אין לסובב את העלי כפי שהוא נע מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את homogenate לתוך צינור 50 מ"ל סטרילי לצנטריפוגה חרוטי או על ידי שפיכת או pipetting, והכובע את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דקות על 40 גרם, בטמפרטורת החדר כדי גלולה הפסולת רקמות, תאים גושים גדולים ממברנות vitelline. מעבירים את supernatant המכיל את התאים חלמון לצינור נקי לחזור על השלב צנטריפוגה דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת supernatant ידי שפיכת או pipetting לתוך צינור ספין נקי במשך 10 דקות ב 360g, בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. בטל supernatant. Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (סרום ללא בינוני ניסויים RNAi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים קיימא באמצעות hemocytometer להעריך את צפיפות התאים. בינתיים, חזור על שלב 4.10 ל גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים לריכוז הרצוי. כדי להתחיל, לנסות מגוון של 1 ~ 5 x10 6 תאים / מ"ל ו - צלחת החוצה 1.7-2.5 x10 5 תאים / 2 ס"מ. </li></ol> 5. Primary-RNAi התא בתאי צמח על צלחת 384, גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 5 μl של dsRNAs לבאר כל בריכוז הסופי של ng 250 ~ לכל היטב צלחת 384 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרובת ערוצים פיפטה, לוותר על 10 מ"ל (1 ~ 4x106 תאים / מ"ל) של תאים ראשוניים לכל טוב בינוני M3 סרום ללא בצלחת 384-היטב המכיל dsRNA שונים גם כל אחד. לחלופין, ניתן תאים בתרבית על 8-היטב קאמרית שקופיות הזכוכית הדמיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות דקות 1 ב 300 גרם, בטמפרטורת החדר. התרבות התאים בינוני סרום ללא במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות או 18 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ"ל של מדיום סרום המכיל תרבות היטב כל אחד. </li> צנטריפוגה צלחות דקות 1 ב 300 גרם, בטמפרטורת החדר. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמי את הצלחות בתא תרבות לחים התאים העיקרי 5 ~ 7 ד נוסף של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים תמונה או לחיות או הכתמה לאחר immunofluorescence. </li></ol> 6. נציג תוצאות: בתנאים אופטימליים, התאים בתרבית ייראה בריא עם מורפולוגיה עגול. התרבות תהיה פסולת התא הקטן, להיות 50 ~ 80% ומחוברות לאחר ציפוי ראשוני. תאים אלה יעברו שינויים מורפולוגיים לאחר בתרבית במשך תקופה ארוכה של זמן. בדרך כלל לוקח כ 5-8 ימים התאים בתרבית כדי להיות מובחן מלא של 25 ° C. תרבויות באיכות טובה העיקרי נשפטים בדרך כלל על ידי כמה תאים של עניין הם מובחנים בתרבות. לדוגמה, לתאי השריר העיקרי לעתים קרובות יש מורפולוגיה הסניף כמו ולהיות myotubes multinucleated עם פס דמוי myofibrils המורכב מסדרה של sarcomeres. Myotubes מובחן לגמרי בדרך כלל באופן ספונטני להזיז בתרבות. לעומת זאת, הנוירונים העיקרי מובחן הטופס אשכולות עם גופי התא שלהם, להתחבר עם אשכולות אחרים עם כבלים האקסון שלהם. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תאים ראשוניים עוברים שינויים מורפולוגיים לאחר מצופה בתרבות (א) התמונה בשדה בהיר של תאים ראשוניים ימין לאחר מצופה בבאר צלחת 384 היטב. רוב התאים הם עגולים שלמים מופרדים היטב. (ב) התמונה בשדה בהיר של תרבית תאים ראשונית 20 שעות לאחר ציפוי. תאים ראשוניים כבר הטופס אשכולות (חץ גדול) ואת שרירי עם מורפולוגיה ענף דמוי (חץ ארוך) ניתן לזהות בשלב זה. (ג) תמונה שלב ניגודיות של התרבות העיקרי 5 ימים לאחר ציפוי. התרבות נראה הרבה יותר מתקדם, עם סיומות עצביות (חיצים קטנים), צבירי נוירונים (ראשי חץ גדול) והשרירים (בגודל בינוני החץ). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמאות של תאים ראשוניים שטופלו dsRNAs בתרבית צלחת 384, באר תאים ראשוניים בודדו מן העוברים נושאת Dmef2-Gal4, D42-Gal4, כטב"מ-Mito-GFP transgenes, שבו Dmef2 Gal4-D42 ו-Gal4 ביטוי הכונן של מיטו-GFP בשרירים הנוירונים המנוע, בהתאמה. התאים טופלו dsRNAs מיקוד או lacZ (AC) או מנופח (אם) (DF). שני השרירים הראשי נוירונים ניתן לראות על ידי ה-GFP (A, C, D, F). החצים הלבנים מצביעים על סיומות עצביות. מכתים Phalloidin של אקטין (ראשי חץ) מגלה מבנה הענף, כמו שריר בתרבות שטופלו lacZ dsRNAs (B ו-C), אבל מסביב את המורפולוגיה שרירים בתרבות שטופלו אם dsRNAs (E ו-F). בתמונות הממוזגת (C, F), השרירים מוכתמות צהוב, אדום אבל מראה נוירונים שלילי הרחבות שלהם (חצים לבנים). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Micrographs Confocal של השרירים העיקריים תרבותי על האנושית vitronectin מצופה זכוכית לכסות שקופיות השרירים העיקריות היו מוכתמים immunofluorescently עם אנטי תסיסנית Titin (KZ) (אדום במיזוג) ועם phalloidin עבור אקטין (ירוק במיזוג). לוחות העליון הם שרירים wild-type מלאה אלה התחתונה הם סאלס (CG31374) שריר RNAi עם sarcomeres מקוצר.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דפוס התפתחותי של תרבויות העיקרי של תאים תסיסנית יכול להשתנות במידה רבה, ככל הנראה בשל מספר משתנים במהלך תהליך התא הראשוני הכנה. קודם כל, זבובים המשמשים להנחת ביצה צריך להיות צעיר (בתוך שבוע הישן) ובריא (ללא זיהום נגיפי או חיידקי). עוברים מופרית או נגוע יש להימנע, שכן הם חסרי תועלת בתאים שמקורם בעוברים אלה לא ניתן להבדיל רק לשרוד במשך 1-2 ימים. שנית, במהלך תהליך homogenization, חשוב לא להעמיס homogenizer עם עוברים מדי. העמסת homogenizer עם עוברים מדי תגרום לעלייה בכמות הפס...

<table><tbody><tr><td>מצע Shields and Sang M3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי של בקר</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>כלובים גדולים לאיסוףו של עוברים</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>נפה בנ"ט (standard testing sieve) מס. 25</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>נפה לבדיקה בתקן ארה"ב מס' 45</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>נפה לבדיקה בתקן ארה"ב מס' 120</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>מאכלה למרקמות מסוג Dounce, Wheaton 7 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>מקריש רקמות דונס (Dounce), Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמה מסוג Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar, פלטה בעלת 384 בארות</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עם תאי Lab-Tek II</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית gastrula עוברים

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

כאן אנו מתארים שיטה להכנת ותאי culturing העיקרי ניתק מעוברים תסיסנית gastrula. בקיצור, כמות גדולה של עוברי מבוים מפני זבובים צעירים ובריאים נאספים, מעוקר, ולאחר מכן ניתק פיזית לתוך ההשעיה תא בודד באמצעות homogenizer זכוכית. לאחר מצופה על צלחות תרבות או שקופיות קאמרית בצפיפות המתאים בינוני תרבות, תאים אלה יכולים להתמיין עוד כמה סוגי תאים מורפולוגית-ברורים, אשר ניתן לזהות על ידי סמנים ספציפיים שלהם התא. יתר על כן, אנו מציגים תנאים לטיפול תאים אלה עם גדילי כפול (DS) RNAs לעורר מציאה גן. RNAi יעיל בתאים תסיסנית העיקרית נעשית פשוט על ידי רחצה התאים בינוני dsRNA המכילים תרבות. היכולת לבצע יעיל ההפרעות RNAi, יחד עם אחרים מולקולרית, מנתח ביוכימיים הדמיה התא, יאפשר מגוון של השאלות ייענו בתאים תסיסנית העיקרי, במיוחד אלה הקשורים שריר מבודל תאים עצביים.

אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תאים ראשוניים ניתק מן<em&gt; Drosophil</em&gt; עוברים. היכולת לבצע את ההפרעות יעיל RNAi, יחד עם אחרים שיטות הדמיה מולקולרית, ביוכימיות תא תאפשר מגוון של שאלות להתייחס אליה<em&gt; תסיסנית</em&gt; תאים ראשוניים.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

כאן אנו מתארים שיטה להכנה ולגידול של תאי מקור (primary cells) שפוּרקו מעוברים של דרוזופילה (Drosophila) בשלב הגסטרולציה. בקצרה, כמות גדולה של עוברים בשלבים מוגדרים...

המטרה הכללית של הליך זה היא להראות כיצד להכין תאים ראשוניים שפוזרו מעוברים של דרוזופילה (drosophila) לצורך RNAi ואנליזה של דימוי תאים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת כלובים לזבובים. לאחר מכן נאספים עוברים סינכרוניים, נשטפים ומעבירים אותם הומוגניזציה כדי לפרק את התאים.לאחר מכן, התאים הראשוניים נזרעים ועוברים טרנספקציה עם מבני RNAi. לבסוף, ניתן להפיק תוצאות באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה המראות את השפעות ה-RNAi על תאים ראשוניים מובדלים. שמי הוא Namo.אני פרופסור במחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של הרווארד וחוקר במכון הרפואי Overuse. היום אני, יונתן, עמית במעבדה, וכן עמית בוגר לשעבר במעבדה, נציג בפניכם את הטכניקה להפקת תאים ראשוניים מעוברי עכברים. טכניקה זו חשובה עבור מספר יישומים בביולוגיה של התא ובביולוגיה התפתחותית, ובפרט, כפי שהראה ג'נו לפני מספר שנים, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו לסריקות CRISPR רחבות גנום בתאי שריר ראשוניים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח של שורות תאים מונחליים (immortalized) מבוססות, הוא שתרבית תאים ראשונית משקפת באופן מדויק יותר את הביולוגיה של האורגניזם. באופן כללי, מי שינסה להוציא את השיטה זו אל הפועל יתקשה, כיוון שלא ניתן ללמוד מספר שלבים פשוט על ידי קריאת הפרוטוקול. כדי להכין משחה של שמרים שהורגו, גרסו תחילה שמרים חיים גרנולריים לאבקה דקה באמצעות מטחנת קפה, לאחר מכן הניחו אותם בכלי ביקר והעבירו אותם באוטוקלבה במחזור ייבוש של 20 דקות. מיד לאחר העיקור באוטוקלבה.הוסיפו מספיק מים חמים סטריליים לשמרים כדי להכין משחה במרקם של משחיית שיניים. להכנת תאים ראשוניים המופקים מעוברי זבובים, גדלו זן פראי של דרוסופילה כגון orgon R בבקבוקוני זבובים טריים; העבירו זבובים שזה עתה בקעו (ELOs) לכלובים גדולים לאיסוף עובריים או לכלובי אוכלוסיית זבובים. לאחר מכן, כדי להקל על איסוף עובריים סינכרוניים, העבירו את הכלובים לחדר בטמפרטורה של כ-25 °C ו-65% לחות, עם מחזור אור-חושך של 12 שעות, והאכילו את הזבובים במזון דומם.משחת שמרים שנמרחה על מצעי דבס. יש להחליף את מצעי המזון פעם ביום למשך יומיים עד שלושה ימים. ביום ההכנה הראשוני של התאים, יש להאכיל את הזבובים במצעים טריים למשך תקופת טרום-הטלה של שעה אחת עד שעתיים.ממש לפני מחזור החשיכה בן 12 השעות, החליפו את פלטות ההכנה (pre lay plates) בפלטות מולס טריות, ששורטטו עם כמות מינימלית של משחת שמרים. השליכו את דגימת האיסוף הראשונית המכילה עוברים ישנים שאינם סנכרוניים.אספו עוברים למשך תקופה של שעה עד שעתיים. הוציאו את הפלטות המכילות אוכלוסייה סינכרונית יחסית של עוברים ואחסנו אותן בטמפרטורה של 25 °C למשך חמש עד שש שעות. בשלב זה, העוברים יהיו בשלב הגסטולציה המתקדם לצורך איסוף העוברים.לאחר דגירה של חמש עד שש שעות, השתמשו במכחול רטוב כדי לשחרר אותם מהצלחות. לאחר מכן, הניחו אותם במערכת של נפות מוערמות ושטפו היטב כדי להסיר כמה שיותר שאריות של שמרים וזבובים, ובכך אפשרו לעוברים להתרכז בנפה התחתונה.הטה את המסננת כך שהעוברים יצטברו בצד אחד, ושטוף אותם בעדינות מהמסננת אל תוך סל קישוט. לאחר מכן, עקר ומעט את העוברים על ידי טבילה ב-50% volume per volume. הלבן במשך חמש עד 10 דקות בזמן שהעוברים מדגדרים.מלאו את ההומוגניזר במדיום בטמפרטורת החדר. השתמשו במדיום בינוני כדי להגיע לנפח שאינו עולה על 0.5 מיליליטר של עוברים ל-40 מיליליטר של מדיום. לאחר מכן, שטפו את העוברים מדופן הסלסלה באמצעות 70% Ethanol נפח לנפח.בעזרת מים מזוקקים שעברו עיקור באוטוקלב, שטפו את העוברים ביסודיות כדי להסיר את הבליץ' או האתנול. לאחר מכן, טבלו את העוברים השטופים בתמינת M3. בכלי זכוכית סטרילי, השאירו את העוברים להשריה למשך שתיים עד חמש דקות; בזמן שהעוברים מדגריים, פרקו את סל הדקורציה וייבשו את רשת ה-NYX בעזרת נייר סופג סטרילי.לאחר שהעוברים השתרו במצע M three, העבירו אותם אל ההומוגניזר באמצעות מברשת צבע סטרילית. בצעו הומוגניזציה בעדינות בתנועות קצרות באמצעות פסטל רפוי, והימנעו מדחיפת הפסטל לתחתית המבחנה; כאשר כל העוברים תלויים בנוזל, בצעו הומוגניזציה בעדינות אך בנחישות בשמונה תנועות מלאות. אין לסובב את הפסטל בעת תנועתו למעלה ולמטה. העבירו את התוצר ההומוגני למבחנת צנטריפוגה קונית סטרילית בנפח 50 milliliter, באמצעות מזיגה או פיפטינג, וסגרו את המבחנה במכסה. סובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-40 cheese בטמפרטורת החדר כדי להשקיע את ששאירי הרקמה, גושי תאים גדולים וממברנות פטל.העבירו את ה-snat המכיל את התאים והחלמון לפרוביטה נקייה וחזרו על שלב הצנטריפוגציה למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו בזהירות את הסופרנאט על ידי מזיגה או שאיבה באמצעות פיפט לפרוביטה נקייה, וסבבו למשך 10 דקות ב-360 Gs בטמפרטורת החדר כדי לשקיע את התאים; השליכו את הסופרנאט. השעיקו מחדש את משקע התאים ב-10 milliliters של מצע גידול נטול סרום עבור ניסויי RNAi.כדי להעריך את צפיפות התאים, ספרו את התאים החיים באמצעות המוסייטומטר (hemo cytometer). לאחר מכן, שקעו שוב את התאים ב-360 ×g. השביעותו את התאים במצע M3 נטול סרום בריכוז של 1-5 × 10⁶ תאים למילליטר, והעבירו אותם לפלטה בריכוז של 1.7-2.5 × 10⁵ תאים לסנטימטר רבוע לכל באר בפלטת 384.העבירו לפלטת בארות חמישה µL של RNA דו-גדילי בריכוז סופי של כ-250 ng לבאר. באמצעות פפטה רב-ערוצית, העבירו 10 µL של תרחיל תאי ראשוניים בריכוז של 1-4 × 10⁶ תאים למל', במדיום M3 נטול סרום, לכל באר בפלטת ה-384 בארות. לחלופין, ניתן לגדל את התאים על שקופיות עם תאי זכוכית בני 8 בארות לצורך דימיון קונפוקאלי.סובב את הפלטות בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-300 Gs בטמפרטורת החדר. הנח את הפלטות ב-25 °C למשך 22 שעות או ב-18 °C למשך יום עד יומיים. הוסף לכל אחת 30 µL נוספים של סרום המכיל מצע גידול M3.צנטריפוגו את הפלטות למשך דקה אחת ב-300 Gs בטמפרטורת החדר. דגרו את התאים הראשוניים למשך חמישה עד שבעה ימים נוספים ב-25 degrees Celsius בתא לחות. לבסוף, דגמו את התאים במיקרוסקופ, או כשהם חיים או לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית.בתנאים אופטימליים, התאים והתרבית ייראו בריאים. עם מורפולוגיה עגולה, בתרבית יהיו מעט ששאירי תאים והיא תהיה ב-50 עד 80% confluent. לאחר הזריעה הראשונית, התאים יעברו שינויים מורפולוגיים ויהיו מובחנים באופן מלא לאחר כחמישה עד שמונה ימים בתרבית בטמפרטורה של 25 °C. תמונת שדה בהיר זו מציגה דוגמה לתאים ראשוניים מיד לאחר הזריעה.מרבית התאים הם עגולים, שלמים ומופרדים היטב 20 שעות לאחר הזריעה. התאים הראשוניים כבר יוצרים צבירים, וניתן לזהות בשלב זה שרירים בעלי מורפולוגיה דמוית ענף. בשלב זה, תאים ראשוניים שגודלו במשך חמישה ימים נראים בתמונת ניגודיות מתקדמים הרבה יותר, עם שלוחות נוירונליות, צבירים נוירונליים ושרירים.בדוגמאות אלו, תאים ראשוניים בודדו מעוברי עוברים הנושאים את הגנים התעתוקיים DMF2-GAL4, D42G4 ו-UAS-mitoGFP, כאשר DMF2-GAL4 ו-D42G4 מניעים ביטוי של mitoGFP בשרירים ובנוירונים מוטוריים בהתאמה. התאים טופלו ב-RNAs דו-גדיליים המכוונים ל-LAc או ל-inflated. תמונת פלואורסצנציה זו מראה הן שרירים ראשוניים מובחנים והן נוירונים המבטאים GFP בתרבית שהותעתקה עם RNAs דו-גדיליים של בקרה המכוונים ל-LAc; החץ הלבן מצביע על שלוחות נוירונליות בעוד ראש החץ מצביע על מבנה שרירי דמוי-ענף. כאשר השריר המובחן נצבע ב-Phalloidin, יותר ממחצית מהשרירים מראים מבנה דמוי-ענף בעוד שהשאר מראים מורפולוגיה עגולה.בתמונה הממוזגת, השרירים צבועים בצהוב והמבנים הנוירונליים צבועים בירוק. תמונת פלואורסצנציה זו מציגה הן שרירים ראשוניים מובחנים והן נוירונים המבטאים GFP בתרבית המכילה RNA דו-גדילי המכוון ל-inflated או if; החץ הלבן מצביע על שלוחות נוירונליות בעוד ראש החץ מצביע על שריר כאשר אלו מודגשים בצביעת phin. בניגוד לבקרי הטיפוס הפראי (wild type) שיש להם שרירים דמויי ענפים, כל השרירים כאן הם מעוגלים; בתמונה ממוזגת זו, השרירים צבועים בצהוב בעוד המבנים הנוירונליים בירוק.שימו לב כי בתרבית זו שטופלה ב-double stranded RNAs ניתן לראות רק מורפולוגיית שריר מעוגלת. בעוד שהשלוחות העצביות נראות דומות לאלו של בישורי ה-wild type, תמונות אלו מציגות תאי שריר ראשוניים שנצבעו פלואורסצנטית עם anti drosophila titan באדום ו-Phin המסמן actin בירוק. פאנלים אלו מראים שריר ביקורת wild type, ואלה מייצגים שריר שטופל ב-RNAi, אשר התפתח לשרירים עם סרקומרים מקוצרים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעקוב אחר הפרוטוקול בעקביות כדי להשיג תוצאות ברי-השוואה בין הניסויים השונים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שעתיים עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

וידאו זה מדגים את הכנת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. צפיות של תרבויות לחיות להראות תאים 1 שעה לאחר ציפוי הנוירונים הבדיל אחרי 2 ימים של גידול בינוני ביקרבונט מבוססי מוגדר. הנוירונים הם להתרגש חשמלית וליצור קשרים סינפטיים.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

תאי דרוזופילה S2 ונוירונים בתרבית הם מערכות גדולות להדמיה של תחבורת אברון המונע באמצעות מנוע in vivo. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לculturing שני סוגי התאים, ההדמיה והניתוח של תחבורה שלהם.

אברון תחבורה בתרבית דרוזופילה תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

פרוטוקול זה מתאר את הנתיחה והטיפוח של אשכים שלמים וציסטות בקו הנבט מגלמים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת תצפית מיקרוסקופית על זרע הזרע ex vivo. יתר על כן, אנו מתארים בדיקה פרמקולוגית של השפעת המעכבים על שלבים ספציפיים של התפתחות תאי נבט באשכים גולמים.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

כאן אנו מתארים הליך ללכידת תמונות חיות של גסטרולציה של דרוזופילה. זה אפשר לנו להבין טוב יותר את ההתכווצות האפיקלית הכרוכה בהתפתחות מוקדמת ולנתח עוד יותר מנגנונים השולטים בתנועות התאים במהלך שינוי מבנה הרקמה.

הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב תסיסנית Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

שורות תאים דרוזופילה הם ריאגנטים חשוב למחקר בסיסי והן ביו. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפשיר, subculturing של הקפאה קריוגנית של שורות תאים דרוזופילה נפוץ כדי לסייע לחוקרים שילוב השימוש האלה ריאגנטים במחקר שלהם.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

שיטת שימור ארוכת טווח לזני דרוזופילה כחלופה להעברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון טריים רצויה מאוד. פרוטוקול זה מתאר שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים של דרוזופילה והחייאת זנים באמצעות השתלתם בעוברים מארחים אגמטיים.

שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים והחייאת זני דרוזופילה

למדו פרוטוקול להכנת תאים ראשוניים מעוברי Drosophila לצורך RNAi וניתוח הדמיה תאית. השיטה מאפשרת מחקר ביולוגיה תאית ומולקולרית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

גלה סרטונים נוספים