Name: פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: למדו את פרוטוקול הזיהום של יתושים בטפילי Plasmodium falciparum לחקר מלריה. השיטה כוללת הכנת תרביות גמטוציטים והאכלה באמצעות ממברנה לקביעת פנוטיפ זיהום במעי היתוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

א הכנת תרבות gametocyte: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו דם אדם טרי בסרום עד 37 מעלות צלסיוס בתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף קטר, בתנאים סטריליים, pipet 1 מ&quot;ל של דם חם לתוך צינור Eppendorf. ספין הדם בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2200 סל&quot;ד. אריתרוציטים יש pelleted, להסיר ולסלק את הנסיוב ברור. לשטוף erythocytes עם נפח שווה של חדש 3 פעמים כדי לקבל נסיוב הדם כולו gametocytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את התרבות gametocyte מן CO 2 באינקובטור או צנצנת נר. תרבות זו יש לשמור על RPMI התקשורת נמאס היתושים ביום 16 של התרבות. כדי לקבוע את% gametocytemia (ביום 16 של התרבות) להפוך את כתם דק בשקופית זכוכית עם דם טיפה אחת ולבצע Geimsa כתם. לקבוע את מספר הגמטות בשדה התרבות הטפיל. זה בדרך כלל בטווח של 2-4%. חשב את נפח הדם כולו כי תצטרך להשיג את הרצוי gametocytemia% הסופית (0.3 -1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של התקשורת מתרבות gametocyte שלך ​​באמצעות pipet, נזהרת שלא להפריע או למצוץ את הטפילים (פרזיטים יופיעו שחור בעוד התקשורת יהיה ורוד בהיר / אדום). Pipet את שאר כלי התקשורת וטפילים לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל בז. ספין בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2200 סל&quot;ד. טפילים ו אריתרוציטים גלולה יהיה, להסיר ולסלק התקשורת supernatant ללא טפילים מטרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב טפילים עם נפח הדם כולו מוכן (מ A2 צעד) לתת לך את gametocytemia הסופי הרצוי על פי חישובים קודמים. Pipet לערבב היטב. (~ 1 דקה) </li></ol> זהו עכשיו המדגם תוכלו להאכיל את היתושים שלך. שמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט של מים. ב יתושים האכלה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים יתושים אנופלס שלך (~ 30-50) לתוך שעווה מצופה כוסות קרטון מכוסה רשת רשת מאובטחת על ידי גומייה או מכסה קרטון מסופק עם כוס. אנו משתמשים aspirator המופעל באמצעות סוללה נטענת עבור שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את זרימת המים באמבט ידי הוספת חרירי משני צדי ניזונים זכוכית צינור גומי. חבר כמו ניזונים רבות ככל שאתה צריך בסדרה: קצה אחד של הסדרה צריך להיות שמחוברות בצינור circulator האמבט במים (החלק דוחף מים דרך ניזונים), את הקצה השני של הסדרה צריכה להיות מורכבת צינורות גומי שקוע באמבטיה כדי לאפשר את המים שהופץ לרוקן לתוך אמבטיה. הפעל את האמבטיה במים עד כ 37 מעלות צלסיוס ומים הוא מחזורי דרך ניזונים וחזרה לאמבטיה. זה חיוני כדי לשמור על חם הדם ולשמור פרזיטים בחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הממברנה (אנו משתמשים ריבועים קטנים של parafilm נמתח) על ידי מתיחת סביב מזין את הממברנה זכוכית, תוך שימוש בלחץ לאטום בחוזקה פתיחת מזין. קרום זה יהיה לחקות את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד מזין קרום בצד למטה על כל כוס יתושים ניזונים מאובטח באמצעות מלחציים או קלטת. הממברנה צריך לשבת מיושר עם הרשת כך יתושים יכול לגשת אליו מבפנים הגביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה טפיל דם ארוחה (מ A5 צעד) לתוך צווארו של מזין, מוודא דם הולך כל הדרך דרך הצוואר אל תוך המאגר, פנייה קרום כך היתושים יכולים לגשת דם. אנו משתמשים על 200 μl של דם לכל מזין, אבל זה יכול להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להאכיל את היתושים. אנו מאפשרים להם להאכיל עבור ≈ 30 דקות (משתנה, בהתאם theexperiment, כי רוב הניסויים, לעתים ניטור כמה כבר עברו ארוחה מלהסתכל תוכן הדם בחלל הבטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האכלה, להסיר ניזונים מן כוסות יתושים. כבה את האמבטיה במים לנתק ניזונים מן צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום ולספוג ניזונים ב אקונומיקה 10% לטהר ולשטוף עם מים. המקום מזוהם החומר (ממברנות, מגבות נייר, כפפות, וכו &#39;) לתוך שקית פיקדון Biohazard קטן ב קיבול Biohazard גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי יתושים על ידי הצבת כוסות במקרר או בחדר קר. לאחר יתושים מורדמים לגמרי, להעביר אותם על צלחת פטרי מוטבע בתוך דלי קרח. יתושים מיין, והביטה בזהירות אל הבטן לכל סימן של ארוחה הדם, וזורקים אותם כי לא להאכיל. יתושים חלקם יהיו צבה מלא בעוד שאחרים יציגו רצועה צרה של דם בלע; כל מקובלות כמו &quot;נמאס&quot;. שים את היתושים נמאס חזרה לתוך כוסות קרטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק ארוחה סוכר (פיסת צמר גפן טבול סוכרוז 10%) על יתושים, ועל דגירה בתנאים insectary נורמלי למשך 7 ימים. כל יום, היתושים יש לעקוב לשיעור התמותה. בנוסף, הכותנה צריכה להיעשות רטוב עם סוכרוז, כך שהם אינם מקופחים של מזון. זה יותר טוב, ובכל זאת, כדי להוסיף מגבת נייר ספוגה במים מזוקקים, כדי לשמור על היתושים לח. יתושים אלה פ falcipraum נגוע, כך שכל הטיפול חייב להילקח כך יתושים לא יכול escapדואר מהספל. מומלץ לשים את כוסות הגנה cagefor קטן כפול. </li></ol> ג הביתור midguts יתוש והערכת המון oocyst: <ol style="margin-top: 0in;text-align:right;direction:rtl"><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> לשאוב יתושים (מ-B צעד) מן כוסות קרטון באמצעות aspirator המופעל באמצעות סוללה נטענת. הרדימי יתושים, אשר נמצאים בתוך המאגר aspirator נשלף, על ידי הזזת לחדר קר או לקבור את מאגר בקרח במשך לפחות 5 דקות או עד יתושים להפסיק לנוע. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> העברת יתושים הרדים מן המאגר אל צלחת פטרי זכוכית מוטבע קרח. מורחים את היתושים כדי בשכבה אחת ומכסים במכסה פלסטיק צלחת פטרי. יתושים כי לא ניתן לאכלס על הצלחת להישאר המאגר, אשר חזר לחדר קר או קרח. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, העברת יתוש אחד מצלחת עד 100 ul PBS הכלול בשקופית זכוכית רכוב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. השאירו את השאר מכוסה בצלחת פטרי צונן. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, החזק יתושים בבית החזה ואת הבטן האחורי. משוך את הגוף בנפרד עד midgut חשוף. שימוש במלקחיים כדי להסיר עודפי רקמה מהבטן gut.The נראה כמו לבן, דמויי גוף. הסרת רקמה עודפת מן gut.Mount המעיים אחד טוב של שקופית 12-היטב זכוכית לטבול μl 5-10 של 0.2% יוד. סקווש נבלת וזורקים על towel.Continue נייר לחה יתושים אחרים, עד 12 שקופיות גם מלא. מכסים את האומץ רכוב עם coverslip זכוכית. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> בדוק אומץ תחת מיקרוסקופ אור, מחפש שביצים עגול כתם ורוד בהיר נגד רקמת ברור / חלש המעיים ורוד. הרוזן שביצים, שיא ולהמשיך מדגם הבאה. המשך לכל היתושים מכל טיפולים ניסיוניים. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> בסיום, למחוק שקופיות לנקות עם מגבת נייר. מניחים את מגבת נייר עם אומץ, וגם מגבת נייר עם פגרים, לשקית Biohazard קטן וזורקים לפח. כפפות שחוקים לאורך ההליך. הטיפול נלקח לא לתת כל לברוח יתושים נגועים. </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
<li>Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step%2C+PCR-based+method+for+the+detection+and+differentiation+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax.</a> Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

לא יכול להיות כמה וריאציות הזיהום Plasmodium לבין פנוטיפ נחישות זיהום מעבדות שונות עשוי לעקוב בטכניקות שונות.

פרוטוקול זיהומים plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

ברגע שג'ן מזוהה כבעל פוטנציאל לעמידות למלריה, יש להעריך את תפקידו במניעת זיהומים של Plasmodium בתוך ה...

אני ג'ורג' דימופולוס ממכון לחקר המלריה בבית הספר לבריאות הציבור של ג'ונס הופקינס, וכעת נראה לכם הליך להדבקת יתושי Anopheles gambiae בטפילי Plasmodium falciparum, וכיצד לקבוע את הפנוטיפ של ההדבקה במעי האמצעי של היתוש. עבור הליך זה, הציוד הבסיסי הדרוש הוא אינקובטור CO2 לתרבית הטפילים. לחלופין, אם אין ברשותכם אינקובטור CO2, ניתן להשתמש בצנצנת נר.כמובן, אנו זקוקים גם למדבבת (insectary), לציוד סטנדרטי של ביולוגיה מולקולרית וביולוגיה של התא כגון מיקרוסקופי dissection ומיקרוסקופי אור. אנו זקוקים למכשירי חימום של מים (water baths). כמו כן, אנו זקוקים למערכת האכלה של יתוש באמצעות ממברנה ולסנטריפוגות.שלום, שמי ISH ואני עובד במעבדה של ד"ר George Depos. אני פוסט-דוקטורנט. שמי Lindsay Garver ואני דוקטורנטית לתואר PhD.השלב הראשון של הדבקת הפלסמה הוא הכנת תרבית הפלסמה. אם אין ברשותכם דגרה עם פחמן דו-חמצני, ניתן להשתמש בצנצנת נר שבה ניתן להניח את הפלטה בעלת ששת הבארים המכילה את תרבית ה-gato, לאחר מכן להדליק את הנר ולאטום את הצנצנת. השלב הראשון הוא להכין דם וסרום אנושיים טריים ולהניח אותם תחילה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי להפשיר אותם וגם כדי לחמם אותם, כיוון שנדרשים דם וסרום חמים מאוד.להכנת הדם, יש להקצות דגימה אחת של דם אנושי טרי במבחנה. יש לסובב את הדם הטרי בצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך חמש דקות כדי לשקיע את האריתרוציטים. לאחר סיום הסבב, יש להסיר את העלייה הצלולה ולשטוף את המשקעים האדומים, שהם ה-RBC, שלוש פעמים בסרום אנושי.אנו מוסיפים נפח שווה של סרום אנושי למשקע, מערבבים אותם וסובבים שוב במהירות של 2000 RPM למשך חמש דקות. שלב זה חוזר על עצמו שלוש פעמים. לבסוף, מתקבלים משקעי תאי דם אדומים שמוכנים להוספה לתרבית הגנוטים.בסדר, את תרבית הפלסמודיום (plasmodium), שנמצאת באינקובטור CO2, יש לתחזק במצע RPMA למשך 16 ימים, וביום ה-16 הן יהיו מוכנות להדבקה. מכיוון שאנו עובדים עם תרבית פלסמודיום, יש לנקוט זהירות בכל שלב. השלב הראשון הוא שהטפילים צריכים לגדול במעבדה ברמת בטיחות BSL-2 והעבודה צריכה להתבצע במabilis (hood).יש להשליך את כל קצות הפיפט והכלים החד-פעמיים (append offs) למכל פסולת ביולוגית, וכל הפתרונות האחרים, כמו קצות הפיפט, חייבים להישטף ב-10%bleach; יש להשתמש בכפפות ובחלוק מעבדה. עבור תרבית מיום 16, יש להניח טיפה קטנה של דם על תגית זכוכית, להכין מריחה ולבצע צביעת גימזה (giemsa stain), וכן לבחון תגית נוספת תחת מיקרוסקופ אור.ניתן לקבוע את אחוז ה-GAMMAT מתרבית גמטוציטים בת 16 ימים. הסר את רוב המצע, תוך הקפדה לא להפריע או לשאוב טפילים, הנמצאים בקלות בתחתית הבאר; העבר את שאר המצע והטפילים. ערבב את הטפילים עם תאי הדם האדומים לתוך מבחנה, ואז הנח את התערובת בצנטריפוגה לסבב במהירות של 2000 RPM למשך חמש דקות.לאחר הצנטריפוגה, הפרזיטים ישקעו יחד עם כדוריות הדם האדומות. הנוזל העליון הוא מצע ה-RPMI, ובתחתית נמצא המשקע המכיל את הפרזיטים. יחד עם ה-RBC, הסירו את הנוזל העליון, שהוא ה-RPMI.יש להקפיד על טיפול זהיר במצע כדי לא להפריע לטפיל ולתאי הדם האדומים. אחוז ה-GATOT, הנקבע על ידי GIMs 10, נע בדרך כלל בטווח של 2% עד 4%. לאחר מכן, כאשר תאי הדם האדומים והטפילים מוכנים לאחר הסבב (spin), הם מעורבבים יחד, ונפח הדם שיש להוסיף נקבע לפי אחוז ה-gatot הסופי. הוא חייב להיות מדויק, ובדרך כלל הוא נע בטווח של 0.3% עד 1%, וזהו הנפח שישמש להאכלת יתוש ה-phys.עבור הדבקת ה-Presidium S, זהו מאכיל זכוכית, המשמש להאכלה דרך ממברנה עבור היתושים. אנו מחדירים את הדם פנימה דרך החור הקטן שרואים, והוא נשמר בתוכו. בתחתית, בצד, ישנם שני פתחים המחוברים למקלחית המים שלנו, שמוגדרת ל-37 °C.כדי להכין את המזין להאכלה, ניקח פיסה קטנה של affil. נמתח אותה משני הקצוות ומרבעי הצדדים, ולאחר מכן נניח אותה על הצד הפתוח של המזין הזכוכית כדי ליצור שכבה דקה של ממברנה המדמה את העור. זהו התהליך המכונה האכלת ממברנה.זהו מקלח מים עם סירקולציה, השומר על מי המקלח בטמפרטורה של 37°C ומזרים אותם דרך מזיף הזכוכית, כך שהדם נשמר חם בטמפרטורה של 37°C. אנו מחברים את מזיף הזכוכית באמצעות קפילריות קטנות למקלח המים עם הסירקולציה ומפעילים את המקלח כדי שהמים יזרמו, כאשר המים והדם אינם מתערבבים כיוון שהם נמצאים בשני תאים נפרדים. זוהי כוס קטנה המכילה יתוש *Anopheles gambiae*.ראשית, מניחים את המזין הזכוכית על הכלוב ומניחים משקולת על המזין כך שהממברנה, שהיא הפילם, תהיה בקו אחד עם רשת המסננת. מוסיפים למזין כ-200 µL של דם המכיל את הפרזיטים באחוז הגמבוטו הנדרש, תוך וידוא שהדם מגיע עד למטה ושהיתושים יכולים לגשת אליו.ההשקיה נמשכת כ-30 דקות. עם השלמת ההשקיה, שוטפים את המזין הזכוכית ביסודיות ב-10% bleach, ואת שאר הממברנות והסרטים מסירים ומשליכים לסל מיחזור פסולת ביולוגית. לאחר ההשקיה בדם, יש להפריד את הפיתוחיות שלא ניזונות מאלו שהניזונות.כדי לעשות זאת, הרדמנו את היתושים על ידי הנחת הכוסות הקטנות המכילות את היתושים שהוזנו בדם בחדר קירור למשך 5 עד 10 דקות. כפי שניתן לראות, היתושים כבר מושבתים בגלל הקור. אנו פותחים את המכסה ומעבירים את היתושים לצלוחית פטרי קטנה, המוצבת על דלי קרח, כדי שהיתושים יישמרו בקור לאורך כל התהליך ולא יוכלו לברוח.זכרו, אלו הם יתושים שנדבקו ב-plasmodium, לכן יש לנקוט בכל אמצעי הזהירות כדי למנוע את בריחתם. ברגע שהיתושים נמצאים בחדר הקירור, אנו מעבירים אותם למדבקת החרקים הרגילה, המוחזקת בטמפרטורת החדר, אך אנו מניחים את היתושים תמיד בתוך צלחת פטרי, שמונחת בדלי קרח, כדי להבטיח שיישארו תמיד במצב של טמפרטורה נמוכה. ניתן לראות כיצד ניתן להפריד את היתושים שהוזנו מאלו שלא הוזנו.אלו שהוזנו מכילים דם. הן מלאות לחלוטין. חלקן הוזנו חלקית בדם ולכן אינן מלאות לחלוטין.יש להם כמות קטנה של דם בבטנם, אך לאחרים יש כמות גדולה של דם בבטן. לאלו שאינם מוזנים אין דם בבטנם, ולכן ניתן להבחין בקלות רבה בין אלו שהוזנו לאלו שאינם מוזנים. כאן מוצגות נקבות יתושים בוגרות שהוזנו בדם, לכן נעביר יתושים אלו מתוך צלחת הפטרי לכוסות קרטון עם שכבת שעווה.לאחר הנחת היתושים שהוזנו בדם אל תוך הכוסים, הנחנו פיסה קטנה של צמר גפן ספוגה ב-10% sucrose, כדי שיוכלו להזין מה-10% sucrose במהלך שבעת ימי הדגירה הבאים, וכן הנחנו נייר סופג מקופל כדי לשמור על הלחות בתוך הכוס, וכיסינו בצלחת פטרי. היתושים שהודבקו ב-Plasmodium הוכנסו לכלוב קטן נוסף, על מנת להבטיח הגנה כפולה, והנחנו את הכלוב במעבדה B3, המתוחזקת בטמפרטורה של 27 °C ובלחות של 80%. שבעה ימים לאחר ההזנה בדם, היתושים שנשמרו בחדר הגידול (insectory), בתוך קופסת הכלוב הכפולה, הוצאו מחדר הגידול והועברו לחדר הקירור כדי להרדימם.לאחר שהיתושים הושבתו, הם מועברים לפיתרי (petri dish), שמונחת בתוך דלי קרח. כעת אנו נערכים לניתוח היתושים. נבצע דיסקציה של המעי האמצעי ונחפש את הציסטה.השלב הראשון הוא הוספת 100 µL של PBS על גבי פלטה של זכוכית המונחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השלב הבא הוא שימוש בפינצטה. נעביר יתוש בודד מתוך צלחת פטרי אל ה-PBS שעל פלטת הזכוכית המונחת תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.את השאר השאירו בתוך פטרי הפטרי המקוררת. כדי לבצע נתיחה ליתושים, החזיקו את היתושים באזור החזה באמצעות פינצטה אחת ואת החלק האחורי של הבטן באמצעות פינצטה שנייה. לאחר מכן, משכו את חלקי הגוף באיטיות עד לחשיפת המעי האמצעי.זה נראה כשקיק לבן, בדומה לגוף; השתמשו בפינצטה כדי להסיר את עודפי הרקמה ואת שאר חלקי הגוף. כן, זהו המעי האמצעי, שנראה כגוף דמוי שקיק לבן, שבו נמצאים הביצים. כעת נעביר את המעי האמצעי לפלטת זכוכית בעלת 12 בארות ונטבע אותו ב-5 עד 10 µL של 0.2% micro pro, אשר יקבע את המעי האמצעי על העגילה.בעזרת זכוכית הכיסוי, אנו מבצעים שלב זה עבור כל היתושים המודבקים. המעי נראה בצבע ורוד בהיר, ואנו נעביר את הפסלורה זו למיקרוסקופ אור כדי לספור את עומס ה-OS. אנו בוחנים כעת את המעי האמצעי שחו dissection מהיתושים המודבקים.המעי האמצעי נראה כגוף חלק, ובעקבות צביעת ה-rom, הוא מקבל גוון ורוד חלש מאוד, כאשר ה-O SST אמור להופיע בצבע ורוד בהיר על רקע רקמת המעי הוורודה העמומה. עם זאת, מעיים אמצעיים אלו הגיעו מיתושים נגועים, אך הם אינם מראים SST, ולכן ייתכן שהם אינם נגועים. אילו מעי אמצעי היה נגוע, ה-S היה מופיע כעיגול קטן וורוד בהיר, ולעתים יכולים להיות בין 22 ל-500 כאלו בתוך מעי אמצעי אחד.הליך זה כלל הדבקה של דם אנושי בטפילים מסוג plasmodium rum, האכלת יתושי Gambian בדם המודבק, הוצאת המעי האמצעי מהיתושים אלו, וקביעת ספירות ה-OSIS בתוך המעי האמצעי המודבק. טכניקה זו חשובה מכיוון שהיא מהווה את הקירוב הקרוב ביותר להעברת מלריה בבני אדם שניתן לשחזר במעבדה.

protocol-for-plasmodium-falciparum-infections-mosquitoes-infection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

ליתושים המעבירים מלריה יש מספר מאפיינים חשובים מבחינה אפידמיולוגית שניתן לזהות רק באמצעות טכניקות מולקולריות. תוך שימוש בפלטפורמת גנוטיפ SNP מבוססת MALDI-TOF, פיתחנו בדיקה לזיהוי בו-זמנית של תכונות מפתח מרובות (מינים, עמידות לקוטלי חרקים, זיהום טפילים ובחירת מארח) של וקטורים למלריה.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum.  בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.

פלסמודיום פאלציפארום תרבות המשחק וזיהום יתושים באמצעות האכלה מלאכותית של ממברנה

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

התפתחות מינית של פלסמודיום מתרחשת במעי האמצעי של היתוש. התמקדות בשלבים המיניים של הטפיל היא אסטרטגיה מבטיחה לחסימת ההדבקה. פיתחנו את Ookluc, P. berghei טרנסגני המבטא ננו-לוציפראז לאחר היווצרות זיגוטה, המאפשר סינון בתפוקה גבוהה של תרכובות חוסמות העברה. מאמר זה מפרט את שיטות הבדיקה באמצעות Ookluc.

Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

למדו את פרוטוקול הזיהום של יתושים בטפילי Plasmodium falciparum לחקר מלריה. השיטה כוללת הכנת תרביות גמטוציטים והאכלה באמצעות ממברנה לקביעת פנוטיפ זיהום במעי היתוש.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

גלה סרטונים נוספים