Name: עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: חקור מודל חיתוך עצב הראייה לחקר מוות נוירונלי אפופטוטי במערכת העצבים המרכזית של מבוגרים. שיטה זו מאפשרת מניפולציות ניסיוניות ב-RGCs עם שכפוליות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PDK נתמך על ידי מענק ההפעלה CIHR (MOP 86523)

<ol><li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li>
<li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development%2C+survival%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li>
<li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons%3A+where+have+they+gone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li>
<li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Restor.+Neurol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li>
<li>Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li>
<li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump%3A+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li>
<li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li>
<li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10%2C+interleukin-4%2C+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li>
<li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנן וריאציות רבות של הליך זה כירורגית כמה צעדים בפרוטוקול זה לא הכרחי. הוא רק צריך לחזור בו השרירים לשכב על עצב הראייה על מנת לקבל גישה העצב. עם זאת, התוצאות במרחב עבודה מוגבל מאוד סביב העצב שהופך בשלבים הסופיים קריטית של חיתוך רוחב קשה יותר. במצבים מסוימים רצוי transfect את התאים מן הגדם עצב הראייה ואת חלל גישה מוגברת המוענקת על ידי retracting כל שרירי extraocular ואת בלוטת הדמעות מועיל במקרה זה. השלבים הקריטיי...

<table><tbody><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסכת גז לחולדה</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>איזופלוראן (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter International Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כירורגי</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold -(הידרוקסיסטילבמידין ביס(מתנסולפונט))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרוביודין</td><td>Medline Industries</td><td>MDS093945H</td><td></td></tr><tr><td>מספרי קפיץ מסוג Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>פינצטות Dumont בעלות קצה דק</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>קרס למיקרו-כירורגיה</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה משוננת לחבישות עיניים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumont #7b, חדה, מעוקלת ומשוננת</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר כויתה</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr></tbody></table>

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

בתאי גנגליון רשתית (RGCs) הם נוירונים במערכת העצבים המרכזית, כי פלט מידע חזותי מהרשתית אל המוח, באמצעות עצב הראייה. העצב האופטי ניתן לגשת בתוך מסלולו של העין transected לחלוטין (axotomized), חיתוך האקסונים של האוכלוסייה RGC כולו. חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל לשחזור של מוות תאים אפופטוטיים נוירונים ב CNS הבוגרת 1-4. מודל זה הינו אטרקטיבי במיוחד מאחר קאמרית הזגוגית של העין פועלת כמו כמוסה עבור משלוח הסמים אל הרשתית, המתיר מניפולציות ניסיוני באמצעות זריקות התוך עיני. דיפוזיה של חומרים דרך הנוזל הזגוגי מבטיחה כי הם פועלים על האוכלוסייה RGC כולו. יתר על כן, RGCs ניתן transfected סלקטיבי על ידי יישום RNAs התערבות קצר (siRNAs), פלסמידים, או וקטורים ויראליים לסוף חתך של וקטורים עצב הראייה 5-7 או הזרקה לתוך היעד שלהם, colliculus מעולה 8. הדבר מאפשר לחוקרים לבחון מנגנונים אפופטוטיים באוכלוסייה העצבית הרצויה ללא תופעות בלבול על נוירונים אחרים או עובר אורח גליה שמסביב. יתרון נוסף הוא הקלות והדיוק שבה הישרדות התא ניתן לכמת לאחר פציעה. הרשתית היא רקמה שטוח, שכבות RGCs מרוכזים בשכבה הפנימית ביותר, השכבה תא גנגליון. ההישרדות של RGCs ניתן לעקוב לאורך זמן על ידי יישום נותב ניאון (3% Fluorogold) בסוף לחתוך של עצב הראייה בזמן axotomy, או על ידי הזרקת נותב אל colliculus מעולה (יעד RGC) שבוע לפני axotomy. נותב מועבר retrogradely, תיוג האוכלוסייה RGC כולו. מאחר השכבה תא גנגליון הוא monolayer (תא אחד עבה), צפיפות RGC ניתן לכמת ברקמות שטוח רכוב, ללא צורך stereology. חיתוך רוחב עצב הראייה מוביל למוות אפופטוטיים של 90% RGCs פצוע בתוך 14 ימים postaxotomy 9-11. RGC אפופטוזיס יש מאפיין זמן כמובן לפיה מוות של תאים מתעכב postaxotomy 3-4 ימים, אחרי אשר התאים להידרדר במהירות. זה מספק חלון הזמן מניפולציות ניסיוני נגד מסלולים מעורב אפופטוזיס.

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל בשימוש נרחב של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מבוגר. תשעים אחוז של תאים הגנגליון ברשתית (RGCs) הם אשר אקסונים transected לחלוטין (axotomy) למות בתוך 14 ימים לאחר axotomy. מודל זה מקובל בקלות מניפולציות ניסיוני לשעתקו מאוד.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

תאי גנגליון של הרשתית (RGCs) הם נוירונים של מערכת העצבים המרכזית המעבירים מידע חזותי מהרשתית אל המוח, דרך העצב האופטי. 
ניתן להגדיר את העצב האופטי כ...

תאי עצבי רשת רטינאליים, או RG Cs, הם נוירונים של מערכת העצבים המרכזית המעבירים מידע חזותי מהרשתית למוח דרך העצב האופטי Optic nerve. קטיעה של העצב האופטי היא מודל הניתן לשחזור של מוות תאי נוירונלי אפופטוטי במערכת העצבים המרכזית בבגרות. כאן, קטיעת העצב האופטי מבוצעת על ידי פתיחת החלק העליון של מחסום העין (superior orbit), כדי להשיג גישה למבנים המכסים את העצב האופטי.מסיטים את בלוטת הדמעות ואת השרירים החוץ-עיניים ופותחים את קרומי העטיפה (meninge) של העצב האופטי. לאחר מכן מרימים את העצב האופטי מתוך קרומי העטיפה וחותכים אותו. בסופו של דבר, 90% מתאי הגנגליון ברשתית שנפגעו, שאקסונום שלהם מרכיבים את העצב האופטי, מתים בתהליך של מוות תאי מתוכנן בתוך שבועיים מהפגיעה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מודלים אחרים של פגיעות מוחיות הוא שניתוק העצב האופטי הוא הדיר יותר, וניתן להכווין מניפולציות ניסיוניות אל הנוירונים הפגועים בצורה קלה יותר. ההשלכות של טכניקה זו חלה על טיפולים בפגיעות ומחלות של מערכת העצבים המרכזית, מכיוון שהרשתית העצבית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית של המבוגר. את הפרוצדורה זו ידגימו פיליפ דונופריו ומארק מאגוס, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי.התחילו את ההליך על ידי הנחת חולדה בתיבת ההרדמה וכיוון ריכוז isof fluorine ל-4%. לאחר שנשימת בעל החיים תהיה איטית יותר, העבירו את זרימת הגז לחיבור מסכת הגז של המסגרת הסטריאוקסית והניחו את בעל החיים במכשיר הסטריאוקסי. לאחר מכן, הנמיקו את ריכוז ה-isof fluorine ל-2%. מקמו את קונו האף ועקבו אחר ההרדמה. הרטיבו את הפרווה בחלק העליון של הראש ב-70% ethanol כדי להקל על גזירת הפרווה.לאחר מכן, בעזרת מכשיר גילוח, הסירו את הפרווה שבין העיניים באמצעות פדי גזה סטריליים. נקו את אזור החיתוך בשלוש מריחות לסירוגין של Betadine, ולאחריהן אתנול 70%. לאחר מכן, מרחו משחה לעין (ophthalmic eye ointment) על הקרנית כדי למנוע את התייבשותה במהלך הניתוח, והפיצו את המשחה על פני השטח על ידי פתיחה וסגירה של העפעפיים.באמצעות להב מספר 11, בצעו חתך לאורך קו האמצע של הראש, מכ-0.5 סנטימטרים לפני העיניים ועד לסנטימטר אחד מאחורי העיניים. באמצעות פינצטה, הסיטו את מקרי העור מעל העין. השתמשו בגב הסקלפל כדי להפריד בעדינות את רקמת החיבור שמתחת לעור ולשחרר את העור העוטף.לאחר מכן, הרחיקו את מקולף העור לצד ולמטה והחזיקו אותו במקומו באמצעות רטרקטור כירורגי. הדביקו את הרטרקטור לבסיס המכשיר הסטריאוטקסי, ובזמן שאתם מושכים את הפסיה העליונה באמצעות פינצטה חדה, בצעו חתך לאורך השפה העליונה של עצם העין. פעולה זו תסיר את הפסיה המכסה את מחסום העין.השתמשו בפינצטה כדי להסית למטה את הפסציה המכסה את מכתש העין (orbit), ובעזרת מכשיר כווייה קטן, סמנו בבירור את שולי עצם המכתש. השימוש במכשיר הכווייה ימנע דימום מכלי דם תחתונים המקשרים לסינוסים הוורידיים. השתמשו ב-PBS סטרילי קר כדי לנקות את אזור הניתוח משאריות דם.יש לנקות את אזור הניתוח באופן תקופתי בדרך זו כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של המבנים במסלול העין. לאחר ניקוי החתך, השתמש בפינצטה ובגב הסכין כדי לנקות את רקמת החיבור בחלק האחורי של העין המכסה את תוכן מסלול העין. פעולה זו תפתח את חלל מסלול העין ותספק חלון ניתוחי רחב יותר לעבודה.בשלב הבא, בעזרת פינצטה משוננת עקומה מסוג Dumont number seven B, הסר את רקמת החיבור המקיפה את הענף האופתלמי של עצב הטריגמינוס, הנמצא סמוך לקו האמצע, והסר את העצב באמצעות פינצטה. אף ששלב זה אינו הכרחי, הסרת העצב תספק חלון גישה רחב יותר לעצב האופטי בשלב מאוחר יותר, לאחר הסרת העצב. השתמש בפינצטה כדי להסיט את כלי הדם שמתחתיו, ובצע צריבה מלאה של כלי הדם.שלב זה אינו הכרחי גם הוא, עם זאת, צריבה של כלי הדם מאפשרת להזיזו קדימה, ובכך ליצור חלון רחב יותר. ברגע שהגעת לעצב האופטי, השתמש בצבת שקצותיה כופפו פנימה, כדי להסיר בזהירות את שכבת רקמת החיבור הדקה המכסה את השרירים החוץ-עיניים ואת בלוטת הדמעות.הסיטו את השרירים חוץ-עיניות מהחלק הקדמי לחלק האחורי של המערכת העצמית (orbit). תפסו את החלק הפרוקסימלי של השריר באמצעות פינצטה, והשתמשו בזוג שני של פינצטות לבדיקת עיניים, מעוקלות ומשוננות, המכוונות לאותו כיוון של השריר כדי להפעיל מתיחה החוצה. הסירו את השריר הקדמי ביותר של המערכת העצמית, השריר האלכסוני העליון (superior oblique).שוב, תוך שימוש באותה טכניקה, הסירו את השריר הרכטוס המדיאלי (medial rectus) הממוקם בין האונות של בלוטת הדמעות ואת הבלוטה הקשה הסמוכה לקו האמצע של פני השטח הגבייים של העין. בעזרת פינצטה, הסירו בעדינות כל רקמה חיבורית שנותרה על פני השטח של בלוטת הדמעות והרימו את הבלוטה כלפי מעלה. אין לדחוס או לסחוט את הבלוטה כדי להסיטה.הרמו את הקצה האחורי של בלוטת הדמעים כלפי מעלה ולאחר מכן בצעו כוויה של כלי הדם בקוטב האחורי. לאחר מכן, הזיזו את בלוטת הדמעים קדימה כדי לפתוח את החלק האחורי של המ orbital, ובכך לאפשר גישה ללא הפרעה לשרירים המכסים את העצב האופטי. שוב, מרחו PBS סטרילי כדי לשמור על האזור לח, ונקו דם באמצעות תחבושות כירורגיות בעזרת פינצטה חדה.שוב, הסירו את רקמת החיבור הדקה המקיפה את שרירי המסלול האחורי והפרידו את צרורות השרירים שמתחתיה באמצעות פינצטת עיניים משוננת ועקומית. משכו בכיוון סיבי השריר כדי להסית את השרירים באופן עצמאי או יחד. לבסוף, הצמידו את עדשת השריר שנותרה אל המסיח יחד עם השרירים שהוסטו, והדביקו את המסיח בעזרת סרט דביק כדי להפעיל מתיחה.פעולה זו תסובב את העין קדימה והחוצה כדי לחשוף את הנרתיק המכיל שומן העוטף את העצב האופטי. בעזרת פינצטת Dumont בעלת חוד דק, משכו כלפי מעלה את רקמת החיבור המכסה את נרתיק השומן של העצב האופטי באמצעות מספרי קפיץ לוורידים בעלי חוד דק. בצעו חתך אורכי.הרחיבו את החתך במידת הצורך. השומן הכלוא בתוך הנרתיק יתחיל לבלוט החוצה. לאחר מכן, משכו בזהירות כלפי מעלה מהשוליים והסִירו את כישורי הרקמה בצורת סהר, תוך שימוש בפינצטה כדי למשוך את השומן.גזרו את השומן המכסה את העצב האופטי באמצעות מספרי קפיץ מסוג Venice. בעזרת PBS סטרילי ומטבונים כירורגיים, נקו את כמויות הדם הקטנות שנוצרו כתוצאה מהסרת הרקמה. העצב האופטי גלוי כעת לצורך גישה אליו.יש להסיר את המעטפת הקרומית העוטפת את העצב מבלי לפגוע בעורק האופתלמי, המזין את הרשתית הפנימית. בעזרת פינצטה, סובב אותה בעדינות ובחן את דפוס כלי הדם של המעטפת הקרומית באמצעות פינצטת Dumont בעלת קצה דק. צבט את הקרומית ומשוך אותה כלפי מעלה, כך שייווצר פתח בצורת טריז ליד בסיס הטריז.השתמשו במספריים כדי לבצע חיתוך אורכי קטן במעטפת הקרומית (meningeal sheath), תוך הקפדה שלא לפגוע בכלי הדם. הכניסו את הלהב התחתון של המספריים לתוך החיתוך וגזרו את המעטפת במקביל לכיוונו של העצב האופטי.השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי להרחיק את הקשיחה (dura) לשני צדדיו של העצב האופטי. הכיסוי היחיד שנותר על העצב הוא קרום העכביש (arachnoid membrane) השקוף והדק. כדי לקבוע אם הקרום עדיין קיים, השתמשו בפינצטה חדה כדי לצבוט את פני העצב ולמשוך הרחק מהשטח. אם כיסויי הקשיה עדיין קיימים, הם יהיו נראים לעין.אם קרום העכביש (arachnoid) נוכח, צבטו את הממברנה ומשכו אותה כלפי מעלה. כדי ליצור נתח רקמה בצורת משולש, בצעו חתך קטן בעזרת קצה המספריים. לאחר מכן, הכניסו את הלהב התחתון של המספריים ובצעו חתך לאורך קרום העכביש.בשלב הבא, השתמש במספריים ובפינצטה כדי להסיט את העכביש (arachnoid) לשני צדי העצב האופטי. בעזרת וו מיקרו-כירורגי, הרם את העצב האופטי מתוך מעטפת הקרומים (meningeal sheath). העבר את קצה הוו מסביב לקצה החיצוני של העצב וודא שהוו נשאר במגע עם העצב.הימנעו מתפיסת קרומי העטיפה של המוח (meningeal membranes) עם הוו וחתרם בטעות. הרימו בעדינות את העצב האופטי אל מחוץ לנשך המנינגיאלי וחתרו את העצב באופן מלא מאחורי הנקודה הנתמכת על ידי הוו. לקצה החתור של העצב האופטי יהיה כעת קצה חופשי.הסיר את התליה אם תבוצע סימון רטרוגרדי של תאי ה-RG. כדי לכמת את השרידות, הנח פיסה קטנה של ספוג ג'ל הספוג ב-3% fluoro gold או בסמן רטרוגרדי אחר על השארית של העצב האופטי שנכרת. שחרר את המתיחה מהשרירים חוץ-עיניות ולחץ על פני השטח העליונים של העין לכיוון קו האמצע כדי להחזיר את העין למצב ניטרלי.במקביל, דחפו את ג'ל-פום (gelfoam) למסלול העין. פעולה זו מבטיחה שהעין תסתובב חזרה למקומה ושהג'ל-פום יישאר מסביב לקצה עצב הראייה. החזירו את בלוטת הדמעות ואת השרירים החוץ-עיניים למקומם הטבעי, החזירו את פתח העור לקו האמצע ותפרו את הפצע.מרחו פומדת עיניים לטיפול אופתלמי בשתי העיניים. עם סיום הניתוח, כבו את זרימת ה-isoflurane ואפשרו לבעל החיים לנשום חמצן במשך מספר דקות. הוציאו את בעל החיים מהמכשיר הסטריאוקטקסי.הניחו את החיה בכלוב תחת מנורת חימום להסחקה, כדי למנוע את הסיכון שהחולדה תשאף מצע במהלך ההתאוששות. ודאו שאין מצע בכלוב ההתאוששות. ניתן משככי כאבים לאחר הניתוח.בהתאם להנחיות המוסדיות, יש לנטר את בעל החיים בקפידה לאחר הניתוח. חיתוך של העצב האופטי מוביל לאובדן של 90% מה-RGC הפגועים תוך 14 ימים לאחר ה-taxotomy. המנגנון העיקרי למות ה-RGC הוא אפופטוזיס.הצפיפות הנורמלית של תאי R GCs היא בערך 2,500 תאים לסממ"ר. ניתן להשתמש בדימוי Epi, פלואורסצנטי או קונפוקאלי כדי להדגים תאי RG cs שסומנו באופן רטרוגרדי. לאחר ביצוע taxotomy.אפופטוזיס של RGC עיכב בערך בארבעה ימים לאחר OX otomy, מה שמותיר חלון זמן למניפולציות ניסיוניות יום אחד לאחר ה-ox otomy, וסימון רטרוגרדי באמצעות Flora Gold; גופי התאים של RGC בשכבת תאי הגנגליון של הרשתית וצמתי axon בשכבת סיבי העצב של הרשתית נראים בבירור. בעת דימוי של דגימה שטוחה (flat mounted) 14 ימים לאחר OX otomy, רוב ה-RGC כבר מתו ומספר מצומצם של RGC שנותרו מפוזרים בין מיקרוגליה רשתית. כאשר RGC עוברות אפופטוזיס, המיקרוגליה פגוציטוטית את התאים המתים וכתוצאה מכך הן מסומנות תאיית עם הסמן הפלואורסצנטי ששימש לסימון ה-RGC, כפי שמצוין כאן על ידי חצי החצים האדומים.מראה הסמן בפגוזומים של המיקרוגליה שונה מזה שמופיע בתאי RGC ששרדו. במיקרוגליה הסמן נמצא בפגוזומים ריכוזים מאוד ובהירים במיוחד, שהם גדולים יחסית ומפוזרים ברחבי הציטופלזמה שלהם. לתאי RGC יש תבנית צביעה דיפוזית יותר, עם שלפוחיות נקודתיות קטנות שהועברו באופן רטרוגרדי לאורך האקסונים שלהם וממלאות את הציטופלזמה של התא.שלפוחיות אלו, המסומנות בחצים הלבנים, קטנות בהרבה ובעלות פלואורסצנציה פחות עזה, מה שמאפשר להבחין בין תאי RGC ששרדו לבין מיקרוגליה. יתר על כן, לתאי מיקרוגליה גופי תאים קטנים בהרבה והם נוטים להציג מורפולוגיית לוח ST או AME, בניגוד לתאי RGC בעלי גופי תאים גדולים ועגולים יחסית. לאחר מיסוך, ניתן להשלים טכניקה זו בהצלחה תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כהלכה; בעת ביצוע הליך זה, חשוב למנוע נזק לאספקת הדם לרשתית, שכן הרשתית תעבור דגנרציה אם כלי הדם ייפגעו בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הזרקות תוך-עיניות או הזרקות לבסיס העצב האופטי לאחר חיתוך, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון מהם המנגנונים המעורבים באפופטוזיס של תאי גנגליון הרשתית.

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל בשימוש נרחב של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מבוגר. מודל זה הוא אידיאלי עבור ביצוע מספר מניפולציות ניסיוני כי היעד של הרשתית גלובלי או ישירות ליעד אוכלוסייה של תאים עצביים נפצעו הגנגליון ברשתית.

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

פרוטוקול זה מראה כיצד retrogradely תווית בתאי הגנגליון ברשתית, וכיצד לאחר מכן לבצע פגיעה בעצב הראייה לרסק על מנת לנתח הגנגליון ברשתית בתא הישרדות אפופטוזיס. זהו מודל מחלה ניסויית עבור סוגים שונים של נוירופתיה אופטית, כולל גלאוקומה.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

מקור: Portela-Lomba, M., et. al. קוקולטורה של נוירונים של גנגליון רשתית של חולדה עם גליה מעטפת ריח, כמודל במבחנה של התחדשות אקסונלית בוגרת. J. Vis. exp. (2020). סרטון זה מדגים הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בתאי עצב גנגליון רשתית של חולדות אקסוטומיות (RGNs) בתרבית משותפת עם תאי גליה עוטפים ריח אנושיים אימורטליים. RGNs הם בעלי תווית חיסונית, עם סומות אדומות ואקסונים ירוקים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, ואחוז הנוירונים עם אינדקס התחדשות אקסוני ואקסונלי כומת באמצעות תוכנת...

הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בנוירונים של גנגליון רשתית של חולדה

תאי ensheathing חוש ריח (OECs) הם תאי רכס עצביים המאפשרים צמיחה של תאי עצב ההרחה הראשוניים. נכס ספציפי זה יכול לשמש להשתלת תאים. אנו מציגים כאן מודל של השתלה סלולרית המבוסס על השימוש בOECs במודל פציעת עצב בגרון.

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

כדי לטפל במנגנונים של דה-מיאלינציה ואפופטוזיס עצבי בנגעים בקליפת המוח של הפרעות דמיאלינטיות דלקתיות, נעשה שימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אנו מתארים כאן גישה ex vivo על ידי שימוש בתאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים על פרוסות מוח, וכתוצאה מכך מוות אוליגודנדרוגליאלי ועצבי. נדונים יישומים ומגבלות פוטנציאליים של המודל.

Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

אנו מציגים פרוטוקול כירורגי המפרט כיצד לבצע אקסוטומיה של חתך או ריסוק על עצב הפנים בעכבר. ניתן להשתמש באקסוטומיה של עצב הפנים כדי לחקור את התגובה הפיזיולוגית לפגיעה עצבית ולבדוק טכניקות טיפוליות.

Axotomy פנים עצב של עכברים: דגם לחקר תגובת Motoneuron לפגיעה

משני ניוון של תאי גנגליון (RGCs) מתרחשת בדרך כלל גלאוקומה. מחקר זה מתאר גישה חדשנית פעיל עבור חיתוך חלקי עצב הראייה. השימוש של החוסך הגישה מרחיב טווח היישום של המודל, מאפשר חקר מנגנוני פגיעה משנית ב RGCs בצורה חדשה.

חיתוך חלקי עצב הראייה אצל חולדות: מודל הקים עם גישה חדשה פעיל כדי להעריך משני ניוון של תאי גנגליון

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר מערכת אוויר מותאמת אישית בלחץ יתר שנועדה לגרום לפציעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) במערכת סגורה בעכברים, כולל טראומות עיניים, מוח וחוט השדרה. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת לחוקרים להתאים ולהרחיב בקלות את המערכת למחקרי הטראומה הייחודיים שלהם במערכת העצבים המרכזית.

מערכת לפגיעה מוקדית וסגורה במערכת העצבים המרכזית

מאמר זה מציג הוראות מפורטות לביצוע ריסוק עצב הראייה במודל ארנב באמצעות טכניקות כירורגיות עיניים סטנדרטיות.

גישה כירורגית לריסוק עצב הראייה במודל ארנב

חקור מודל חיתוך עצב הראייה לחקר מוות נוירונלי אפופטוטי במערכת העצבים המרכזית של מבוגרים. שיטה זו מאפשרת מניפולציות ניסיוניות ב-RGCs עם שכפוליות גבוהה.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

גלה סרטונים נוספים