שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

תאי גנגליון של הרשתית, או RGCs, הם נוירונים של מערכת העצבים המרכזית המעבירים מידע חזותי מהרשתית אל המוח דרך העצב האופטי. בסרטון הנלווה הודגם שיטה לביצוע ex sodomizing, או חיתוך של האקסונים של כל אוכלוסיית ה-RGC, כמודל למות תאים עצביים אפופטוטי במערכת העצבים המרכזית של המבוגר. כאן, שיטה זו משולבת עם פרוצדורות המכוונות באופן ישיר גורמים נוירוטרופיים, RNA מפריע קצר (siRNAs), פלסמידים או וקטורים ויראליים המקודדים לחלבונים אנטי-ATO לתאי גנגליון פגועים של הרשתית או לרשתית עצמה כדי לטרגט את הרשתית באופן גלובלי.

מכשיר להזרקה תוך-עינית מורכב ומשמש להזרקת חומרים לתוך הלשכה הזגוגית של העין כדי להתמקד באופן ספציפי בתאי העצב הרשתיתיים. נעשה שימוש ב-Gelfoam או במזרקי Hamilton להזרקת חומרים לעצב האופטי. תוצאות דימות של השארית (stump) מעידות כי ניתן להגביר את הישרדות תאי העצב הרשתיתיים על ידי הזרקה של גורמים אנטי-אפופטוטיים.

באמצעות טכניקות אלו, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות חלבונים המעורבים באפופטוזיס של נוירונים בוגרים במערכת העצבים המרכזית. ההשלכות של טכניקה זו חולשות לכיוון של טיפול או אבחון של מחלות במערכת העצבים המרכזית, מכיוון שניתוק העצב האופטי הוא מודל הניתן לשחזור עבור אפופטוזיס נוירונלי ב-CNS של בוגרים. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בטכניקה זו מתקשים מכיוון שהם פוגעים בעדשה בעת הכנסת פיפטת הזכוכית לתא הוויטריאית של העין. כדי להכין את מערכת המזרק להזרקות תוך-עיניות, התחילו בהסרת כל מחט או אום RN.

הצמד מזרק Hamilton 1701 עם אטם RN בנפח 10 microliter. הכנס את טבעת ה-PFA לתוך טבעת הכוס של מחבר הלחיצה. לאחר מכן, הכנס את המחבר המלא לקצה המזרק והברג בעדינות את אום ה-RN מעל.

הכנס קצה אחד של צינור PEEK בקוטר 1/16 אינץ' אל תוך מחבר הלחיצה דרך הפתח באום ה-RN. ודא שצינור ה-PEEK יושב במקומו באופן מלא. הדק את אום ה-RN כדי לדחוס את הטבעת (ferrule), שתאטום את צינור ה-PEEK.

חזר על תהליך זה בשני הקצוות של מחבר הזכוכית הכפול RN. חבר את הקצה החופשי של צינור השיא (peak tubing) לקצה אחד של מחבר הזכוכית הכפול RN על ידי הידוק אום ה-RN. מיקרו-פיפט הזכוכית ישמש כמחט וכגליל עבור מערכת ההזרקה.

החדירו את פיפטת הזכוכית אל הקצה החופשי של מחבר הזכוכית הכפול (dual RN glass coupler). הדקו את אום ה-RN כדי לקבע את הפיפטה במקומה. תחת מיקרוסקופ סטריאומטרי, צרו חוד בקוטר המתאים על ידי החזקת מיקרו-פיפטה שנמשכה בזווית ושפשוף החוד לאורך הגיבשושים של שקופית זכוכית כדי ליצור שבירה.

באופן אידיאלי, הקצה הסופי צריך להיות משופע מעט. לאחר מכן, השתמש בערכת ה priming של חברת Hamilton Syringe הכוללת מזרק, מחבר צינור peak, מחבר זכוכית כפול RN ומיקרו-פיפטת זכוכית, ומלא אותם בשמן מינרלי לשימוש. במערכת ההזרקה ההידראולית, החלף את המחט במחט Hamilton 9 0 0 3 0.

כעת הניחו ספטום גומי מעל מחט ה-Hamilton 9 0 0 3 0 כדי לספק איטום בזמן הזרקת השמן המינרלי. הכניסו את מחט ה-Hamilton 9 0 0 3 0 של מזרק ההכנה לחלק האחורי של גוף המזרק של מזרק ה-Hamilton בנפח 10 µL של מערכת ההזרקה. לחצו את הספטום בחוזקה אל קצה המזרק כדי ליצור איטום.

לחץ באיטיות על הבוכנה עד ששמן מינרלי יעבור דרך רכיבי הזכוכית של מערכת ההזרקה, ובכך ימלא את פיפטת הזכוכית. דחף את כל השמן דרך מערכת ההזרקה כדי להסיר בועות אוויר לאורך הנתיב.

אם שמן המינרלים במזרק המילוי עומד להיגמר, משכו לאט את המחט תוךما Dispensing רציף של שמן. כדי למנוע היווצרות בועות אוויר, מלאו מחדש את מזרק ההכנה והזריקו שוב. כאשר כל המערכת מלאה בשמן מינרלים, הכניסו את הבוכנה המקורית של ה-10 µl.

לחץ באופן מלא על הבוכנה של מזרק Hamilton כדי להוציא שאריות של שמן מינרלי מהמערכת. נקה את המיקרו-פיפטה מזכוכית ואת קצה המזרק. בעזרת 70% ethanol, משוך את הבוכנה עד לסימון של 2 µL על גוף המזרק.

קצה המיקרו-פיפטית מזכוכית יתמלא באוויר, ובכך יספק אזור חיץ בין השמן המינרלי לבין הנוזל להזרקה. מלאו את גוף הפיפטה על ידי הנחת קצה המיקרו-פיפטה בתמיסה הרצויה ומשיכת הבוכנה של מזרק ההמילטון (Hamilton). לצורך ביצוע ההזרקה התוך-עינית, יוזרקו לא יותר מ-4 עד 5 µL מהתמיסה לעינו של חולדה בוגרת.

התחילו בהעברת זרימת הגז לחיבור מסכת הגז של המסגרת הסטריאוטקסית. לאחר מכן, מקמו חולדה המורדמת ב-isof fluorine במכשיר הסטריאוטקסי. הנמיכו את ריכוז ה-isof fluorine ל-2% ועקבו אחר ההרדמה.

כסו את בעל החיים בשמיכה כירורגית. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאורך הניתוח, פתחו את העפעליים והניחו טיפה אחת של תמיסת אלחוש. לצורך הזרקה אל פני הקרנית נדרשים שני אנשים, אחד להחדרת פיפטת הזכוכית אל תוך הלשכה הזגוגית ושמירת מיקום הפיפטה.

ואחד נוסף כדי ללחוץ על הבוכנה במזרק, המעביר את התמיסה הרצויה. תחת מיקרוסקופ כירורגי, אחזו במיקרו-פיפטת הזכוכית ובמחבר הזכוכית הכפול של ה-RN; פתחו את העפעפיים לצורת V מול נקודת ההזרקה. בעזרת האצבעות, העין תורם מהמ Orbita. הכניסו בעדינות את קצה מיקרו-פיפטת הזכוכית דרך אזור נטול כלי דם ודרך הסקלרה בזווית כלפי מטה.

כאשר הפפיטה חודרת ללחמית, יורגש "פופ" קטן. על האדם האוחז במזרק להזריק כעת ארבעה מיקרוליטרים של תמיסה על ידי לחיצה על הבוכנה עד לסימון של שני מיקרוליטרים במזרק. ההזרקה צריכה להימשך כמעך שנייה אחת עד שתיים.

התמיסה שהוזרקה בהצלחה תשטוף את חלל הזגוגית; החזיקו את המיקרו-פיפט בצורה יציבה למשך כחמישה שניות, ולאחר מכן משכו אותו החוצה באותו הכיוון שבו הוכנס המחט. הלבט (conjunctiva) יסגור חזרה על הפתח הקטן, ויסייע באיטום של נקב הסקלרה. עם סיום הניתוח, כבו את ה-isof fluorine ואפשרו לבעל החיים לנשום חמצן למשך מספר דקות. מרחו משחה עינית על פני הקרנייה כדי למנוע התייבשות של הקרנייה במהלך ההחלמה, ולאחר מכן הוציאו את בעל החיים מהמכשיר הסטריאוטקסי והחזירו אותו לכלוב ההחלמה.

על מנת לבצע מניפולציה של תאי קשרית הרשתית באמצעות הובלה רטרוגרדית לאחר כריתה. ראשית, בצעו חיתוך של העצב האופטי בהתאם להוראות בסרטון הנלווה לפרוטוקול חיתוך העצב האופטי, 2, 2 4, 1 סומנים תרופות. ניתן להחיל פלסמידים, siRNAs או וקטורים ויראליים על השארית של העצב האופטי.

ישנן שתי שיטות עיקריות לביצוע הליך זה: שימוש בספוג ג'ל (gel foam) או הזרקה ישירה לעצב האופטי. אם נעשה שימוש בשיטת ספוג הג'ל, יש לוודא שתאי הגנגליונים של הרשתית סומנו מראש באמצעות הזרקת סומנים רטרוגרדיים לקולוביקולוס העליון (superior colliculus) שבוע לפני הטקסונומיה. מיד לאחר חיתוך העצב האופטי, יש להניח חתיכה קטנה של ספוג ג'ל ספוג בתמיסה הניסויית מעל קצה העצב האופטי החתוך, ולאחר מכן מחזירים את תכולת המסלול למקומה הקודם.

כאשר מחזירים את העין למצב ניטרלי, השתמשו בפינצטה כדי לדחוף את פיסת ספוג הג'ל למטה אל תוך המ Orbita, תוך הבטחה שהיא נשארת מעל קצה העצב האופטי. טכניקת ההזרקה יעילה יותר להחדרת חומרים שחייבים להגיע לציטופלזמה של האקסון כדי לעבור transport רטרוגרדי באמצעות זרימה ציטופלזמית. מזריק Hamilton בנפח 10 µL בעל אטימה הדוקה משמש להזרקת התמיסה הרצויה לתוך העצב האופטי החתוך. מומלץ להשתמש במחט בעלת שיפוע קצר.

טענו את המזרק עם 10 µL מהתמיס להזרקה. בדרך כלל פלסמידי irna או וקטורים ויראליים להזרקה. אחזו את קצה העצב האופטי באמצעות פינצטת Dumont בעלת חוד דק. הכניסו את קצה המחט אל תוך העצב האופטי, במקביל לעצב.

עד שהשפשוף (bevel) לא יהיה נראה יותר, המחט המוחדרת תהיה עטופה מכל הצדדים על ידי העצב. לאחר השחלת המחט, לחצו בעדינות על דפנות העצב באמצעות פינצטה בעלת קצה דק והזריקו רבע מהתמיסה תוך כדי סיבוב המזרק. סיבוב של רבע סיבוב עם כיוון השעון או נגד כיוון השעון.

המשיכו לחזור על שלבים אלו עד להשלמת סיבוב מלא של המחט והזרקה של כל תוכן המזרק. הוציאו את קצה המזרק מהעצב. השאירו בתוך המסלול (orbit) כל נוזל שהוזרק וחזר מהעצב, שכן הוא יהווה מאגר נוסף לספיגה על ידי קצות האקסונים.

החזירו את תכולת העין למקומה המקורי, סגרו את הפצע ואפשרו לבעל החיים להתאושש. יש לשכן את בעלי החיים באופן נפרד לאחר הניתוח. יש לתת משככי כאבים לאחר הניתוח בהתאם להנחיות של ועדת רعاية בבעלי החיים שלכם.

יש לעקוב בקפידה אחר בעלי החיים לאחר הניתוח. כפי שמוצג בסרטון זה, ניתן לכוון באופן ישיר לתאי RGC על ידי הובלת פפטידים, תרופות, וקטורים, פלסמידים או siRNAs לבב השארית של העצב האופטי לאחר הכריתה. בדוגמה מייצגת זו, בוצע סימון רטרוגרדי באמצעות fluoro gold ופפטידים מסומנים ב-SI three הוזרקו באופן מיידי לעצב האופטי.

ביצוע דימות חי של הרשתית בוצע לאחר מכן כדי למנוע מהפפטידים לדלוף מהרקמה במהלך הקיבוע; כפי שניתן לראות כאן, פפטידים מסומנים ב-SI three שהוזרקו לעצב האופטי הועברו באופן רטרוגרדי חזרה לגופי התאים של ה-RGC ברשתית. בדוגמה זו, siRNAs מסומנים ב-SI three הוזרקו לשארית העצב האופטי. מיד לאחר ביצוע טקסוטומיה ודימות חי חוזר של הרשתית, נראה כי ה-siRNAs המסומנים ב-SI three שהוזרקו לעצב האופטי הועברו באופן רטרוגרדי על ידי ה-RG CS, כפי שמעיד הקולוקליזציה שלהם.

עם סימון רטרוגרדי באמצעות fluorgold, ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך שניות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד להימנע מפגיעה בעדשה. אין לשכוח שעבודה עם חלקיקים ויראליים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להישמע תמיד להנחיות המוסדיות לעבודה עם סיכונים ביולוגיים בעת ביצוע הליך זה.