שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

תאי גנגליון ברשתית או RG cs הם נוירונים של מערכת העצבים המרכזית המעבירים מידע חזותי מהרשתית למוח דרך עצב הראייה. בסרטון הנלווה, הודגמה שיטה לביצוע מעשה סדום או חיתוך האקסונים של כל אוכלוסיית ה-RGC כמודל למוות של תאי עצב אפופטוטיים במערכת העצבים המרכזית הבוגרת. כאן שיטה זו משולבת עם הליכים המכוונים ישירות לגורמים נוירוטרופיים, RNA מפריעים קצרים, פלסמידים או וקטורים נגיפיים המקודדים חלבונים נגד ATO לתאי גנגליון רשתית פצועים או לרשתית כדי למקד את הרשתית באופן גלובלי.

מכשיר הזרקה תוך עיני מורכב ומשמש להזרקת חומרים לתוך תא הזגוגית של העין כדי למקד ספציפית לתאי גנגליון ברשתית. או שמניחים קצף ג'ל או מזרקי המילטון המשמשים להזרקת חומרים לעצב הראייה. תוצאות הדמיית גדם מצביעות על כך שניתן להגביר את הישרדות תאי הגנגליון ברשתית על ידי מתן גורמים אנטי-אפופטוטיים.

באמצעות טכניקות אלה, ניתן להשתמש בשיטה זו לזיהוי חלבונים המעורבים באפופטוזיס של נוירונים בוגרים במערכת העצבים המרכזית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של מחלת מערכת העצבים המרכזית מכיוון שחתך עצב הראייה הוא מודל הניתן לשחזור לאפופטוזיס עצבי במערכת העצבים המרכזית הבוגרת בדרך כלל, אלה החדשים בטכניקה זו נאבקים מכיוון שהם פוגעים בעדשה בעת החדרת פיפטת הזכוכית לחדר הזגוגית של העין. כדי להכין את מערכת המזרקים לזריקות תוך עיניות, התחל בהסרת כל מחט או אגוז RN.

קיים על מזרק 10 מיקרוליטר rn הדוק 1701 המילטון. הכנס את ה-PFA feral לתוך השיא של אביזר הדחיסה. לאחר מכן הכנס את ההתאמה השלמה לקצה המזרק והברג באופן רופף את אגוז ה- RN מעל החלק העליון.

הכנס קצה אחד של צינור שיא אחד בגודל 16 אינץ' לתוך אביזר הדחיסה דרך הפתח באום ה-RN. ודא שצינור השיא יושב במלואו. הדק את אגוז ה-RN כדי לדחוס את הפרא, שיאטום את צינור השיא.

חזור על תהליך זה בשני הקצוות של מצמד זכוכית RN כפול. חבר את הקצה החופשי של צינור השיא לקצה אחד של מצמד זכוכית ה-RN הכפול על ידי הידוק תומך אום ה-RN. פיפטת המיקרו מזכוכית תהווה את המחט והקנה למערכת ההזרקה.

הכנס את פיפטת הזכוכית לקצה החופשי של מצמד הזכוכית הכפול RN. הדק את אגוז ה-RN כדי לקבע את הפיפטה במקומה. תחת מיקרוסקופ מנתח, צור קצה בקוטר המתאים על ידי החזקת מיקרו פיפטה משוכה בזווית ושפשוף הקצה לאורך ציפוי הזכוכית של מגלשת זכוכית כדי ליצור הפסקה.

באופן אידיאלי, הקצה הסופי צריך להיות משופע מעט. לאחר מכן, באמצעות ערכת תחול של חברת המזרקים המילטון מלאה במזרק, מקשר צינורות שיא, מצמד זכוכית RN כפול ומיקרו פיפטה מזכוכית עם שמן מינרלי לשימוש. עם מערכת ההזרקה ההידראולית, החלף את המחט במחט המילטון 9 0 0 3 0.

לאחר מכן, הנח מחיצת גומי מעל מחט המילטון 9 0 0 3 0 כדי לספק אטימה בזמן הזרקת השמן המינרלי. הכנס את מחט המילטון 9 0 0 3 0 של מזרק ההתחלה לחלק האחורי של הקנה של מזרק המילטון בנפח 10 מיקרוליטר של מערכת ההזרקה. לחץ את המחיצה בחוזקה על קצה המזרק כדי ליצור חותם.

לחץ לאט על הבוכנה שמן מינרלי יעבור דרך אלמנטים הזכוכית של מערכת ההזרקה. מילוי פיפטת הזכוכית. דחוף את כל השמן דרך מערכת ההזרקה על מנת להסיר בועות אוויר לאורך המסלול.

אם נגמר השמן המינרלי במזרק המילוי, משוך לאט את המחט תוך כדי חלוקת שמן כל הזמן. כדי למנוע היווצרות בועות אוויר, מלאו מחדש את מזרק ההתחלה והזריקו שוב. כאשר המערכת כולה מתמלאת בשמן מינרלי, הכנס את הבוכנה המקורית של 10 מיקרוליטר.

מזרק המילטון לחץ לחלוטין על הבוכנה כדי להסיר שמן מינרלי נוסף מהמערכת. נגב את המיקרו פיפטה מזכוכית ואת קצה המזרק נקי. עם 70% אתנול, משוך את הבוכנה לסימון שני מיקרוליטר על הקנה.

קצה המיקרו פיפטה מזכוכית יתמלא באוויר, ויספק אזור חיץ בין השמן המינרלי לנוזל שיש להזריק. מלאו את חבית הפיפטה על ידי הנחת קצה המיקרו פיפטה בתמיסה הרצויה ומשיכת הבוכנה של מזרק המילטון. לא יותר מארבעה עד חמישה מיקרוליטרים של תמיסה יוזרקו לעין חולדה בוגרת כדי לבצע את ההזרקה התוך עינית.

התחל בהעברת זרימת הגז לחיבור מסכת הגז למסגרת הסטריאוטקסית. לאחר מכן הניחו חולדה מורדמת פלואור במנגנון הסטריאוטקסי. הורד את ריכוז הפלואור של האיזו ל-2% ופקח על ההרדמה.

כסו את החיה בשמיכה כירורגית. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאורך כל הניתוח, פתחו את העפעפיים והניחו טיפה אחת של תמיסת הרדמה אקנית. על פני הקרנית הזרקת הקרנית דורשת שני אנשים, אחד להכניס את פיפטת הזכוכית לתא הזגוגית ולשמור על מיקום הפיפטה.

ועוד אחד ללחוץ על הבוכנה על המזרק, המספק את הפתרון הרצוי. תחת מיקרוסקופ כירורגי, אחזו במיקרו פיפטה מזכוכית ובמצמד זכוכית RN כפול, פרשו את העפעפיים ויוצרים צורת V מול אתר ההזרקה בעזרת האצבעות, העין תתרומם מחוץ למסלול. הכנס בעדינות את קצה המיקרו פיפטה מזכוכית דרך אזור נטול כלי דם ודרך הסקלרה בזווית כלפי מטה.

כאשר הפיפטה חודרת לסקלרה, יורגש פופ קטן. האדם המחזיק את המזרק צריך כעת להזריק ארבעה מיקרוליטר של תמיסה על ידי לחיצה על הבוכנה לסימן שני המיקרוליטרים על המזרק. ההזרקה אמורה להימשך כשנייה עד שתיים.

התמיסה שהוזרקה בהצלחה תשטוף דרך תא הזגוגית, תחזיק את המיקרו פיפטה יציבה למשך כחמש שניות, ולאחר מכן תיסוג באותו כיוון עם החדרת המחט, הלחמית תתעופף בחזרה מעל הפתח הקטן, ותעזור לאטום את הניקוב הסקלרלי. לאחר השלמת הניתוח, כבו את איזוף הפלואור ואפשרו לבעל החיים לנשום חמצן למשך מספר דקות. מכסים את פני הקרנית במשחת עיניים עיניים על מנת למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההחלמה, לאחר מכן הוציאו את החיה מהמכשיר הסטריאוטקסי והחזירו אותה לכלוב ההתאוששות.

לתפעל תאי גנגליון ברשתית באמצעות הובלה לאחור לאחר אוטומיה לשעבר. ראשית בצע חתך עצב הראייה על פי ההוראות בפרוטוקול החתך של עצב הראייה בווידאו הנלווה, 2, 2, 4, 1 תרופות עוקבות. ניתן ליישם פלסמידים, siRNAs או וקטורים נגיפיים על גדם עצב הראייה.

ישנן שתי שיטות עיקריות לביצוע הליך זה באמצעות קצף ג'ל או הזרקה ישירה לעצב הראייה. אם נעשה שימוש בשיטת קצף הג'ל, ודא שתאי הגנגליון ברשתית סומנו מראש על ידי הזרקת עוקבים לאחור לקוליקולוס העליון שבוע לפני הטקסונומיה. מיד לאחר חיתוך עצב הראייה, מניחים חתיכה קטנה של קצף ג'ל ספוג בתמיסת הניסוי מעל גדם עצב הראייה העובר, ואז מוחזר תוכן המסלול למיקום הקודם.

כאשר העין מוחזרת למצב ניטרלי, השתמש במלקחיים כדי לדחוף את פיסת קצף הג'ל כלפי מטה לתוך המסלול, ולהבטיח שהיא תישאר מעל קצה עצב הראייה. טכניקת ההזרקה יעילה יותר להעברת חומרים שחייבים לקבל גישה לציטופלזמה של האקסון על מנת להיות מועברים רטרו מאוד על ידי זרימה פלזמית אופ, מזרק המילטון הדוק של 10 מיקרוליטר משמש להזרקת התמיסה הרצויה לעצב הראייה העובר. רצוי מחט עם שיפוע קצר.

טען את המזרק עם 10 מיקרוליטר מהתמיסה שיש להזריק. בדרך כלל פלסמידים אירנה או וקטורים ויראליים להזרקת אחיזה בקצה עצב הראייה עם מלקחיים דומונט עדינים בקצה הראיה. הכנס את קצה המחט לעצב הראייה, במקביל לעצב.

עד שהשיפוע כבר לא נראה לעין, המחט המוחדרת תהיה עטופה מכל הצדדים על ידי העצב. לאחר החדרת המחט, סחטו בעדינות את דפנות העצב בעזרת מלקחיים בקצה העדין והזריקו רבע מהתמיסה תוך כדי סיבוב המזרק. רבע סיבוב עם כיוון השעון או נגד כיוון השעון.

המשך לחזור על שלבים אלה עד להשלמת סיבוב מלא של המחט והזרקת כל תכולת המזרק. הסר את קצה המזרק מהעצב. השאירו כל נוזל מוזרק שיש לו ריפלוקס מהעצב בתוך המסלול מכיוון שזה ייצור מאגר נוסף לספיגה בקצות האקסונים.

החזר את תוכן המסלול למקומו המקורי, סגור את הפצע ואפשר לבעל החיים להתאושש. יש לשכן בעלי חיים באופן עצמאי לאחר הניתוח. משככי כאבים לאחר הניתוח צריכים להינתן בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים שלך.

יש לעקוב בקפידה אחר הרשויות ובעלי החיים לאחר הניתוח. כפי שמודגם בסרטון זה, ניתן למקד RGC ישירות על ידי העברת פפטידים, תרופות, וקטורים, פלסמידים או siRNAs לגדם עצב הראייה הטרנסקט. בדוגמה מייצגת זו, בוצע תיוג רטרוגרדי של פלואורו זהב ושלושה פפטידים מסומנים SI הוזרקו מיד לעצב הראייה.

לאחר מכן בוצעה הדמיה חיה של הרשתית על מנת למנוע מהפפטידים לשטוף החוצה מהרקמה במהלך הקיבוע, כפי שניתן לראות כאן, שלושה פפטידים מסומנים SI שהוזרקו לעצב הראייה היו רטרו, הועברו מאוד בחזרה ל-RGC somato ברשתית. בדוגמה זו, SI שלושה siRNAs מסומנים הוזרקו לגדם עצב הראייה. מיד לאחר ביצוע טקסוטומיה והדמיה חיה של הרשתית שוב, SI שלושה siRNAs מסומנים שהוזרקו לעצב הראייה היו נסיגה, והועברו על ידי RG CS כפי שמצוין על ידי הקולוקליזציה שלהם.

עם תיוג לאחור פלואורגולד לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שניות אם היא נעשית כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד להימנע מפגיעה בעדשה. אל תשכח שעבודה עם חלקיקים נגיפיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לעקוב אחר הנחיות מוסדיות לעבודה עם מפגעים ביולוגיים בעת ביצוע הליך זה.