פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- _L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין מתילטרנספראזים (methyl transferases) מתערובות חלבונים מורכבות באמצעות ספקטרומטריית מסות של תרכובות לכידה, או CCMS. המתילטרנספראזים מבודלים באופן פונקציונלי על ידי תרכובות לכידה טרי-פונקציונליות הנושאות את מעכב תוצר המתילטרנספראז הכללי, S adenyl, L homocystine short, SAH כפונקציית הסלקטיביות; בזרימת העבודה המוצגת כאן, הבידוד הפונקציונלי מושג על ידי דגירה של ליזט תאים עם תרכובת הלכידה כדי ליצור שיווי משקל של קישור הפיך בין פונקציית הסלקטיביות של תרכובת הלכידה לבין חלבוני המטרה. כשלב שני, התערובת מקבלת קרינה של אור UV בתוך ה-capra box.

ההקרנה פוטו-מפעילה את פונקציית התגובתיות של תרכובת הלכידה. דבר זה משרה היווצרות של קשר קוולנטי חוצה בלתי הפיך בין תרכובת הלכידה לבין חלבוני המטרה. לאחר מכן, תצמידי החלבון של תרכובת הלכידה מופרדים מהליזט, נשטפים ביסודיות, משוחררים מהתמיכה המוצקה ועוברים עיכול בטריפסין על מנת לזהות את החלבונים שנלכדו באמצעות ניתוח ספקטרומטרי של פפטידי טריפסין. התוצאות המתקבלות מראות בידוד וזיהוי ישירים של מתילטרנספראזות מליזט תאים של esia coli בהתבסס על ספקטרומטריית מסות של תרכובת לכידה.

שלום, אני תומס לנטץ (Thomas Lentz) ממעבדת CaTECH במחלקה לביוכימיה. אני מתיאס רגא (Mathias Rega), גם אני ממעבדת הביוכימיה של CapTech. אני מר לינסקי (Mer Linsky) ממחלקת האנליטיקה.

היום נדגים את הפרוצדורה ללכידה על גבי חרוזים (on-bead capturing) של מתילטרנספראזות מתוך ליזאט תאים מנורמל. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציות בין חלקיקים קטנים לחלבונים. הפרוצדורה מאפשרת בידוד וזיהוי של סב-פרוטאומיים פונקציונליים, כגון kinase, metalloproteinase ו-gtpa, כדי להזכיר רק כמה מהם.

אנו משתמשים בגישה זו גם לגילוי מטרות תרופתיות. לכן, בואו נתחיל. עבור ניסויי הלכידה, נעשה שימוש בערכה ללכידת L homocystine של snail, ערכת short SAH caper.

ערכה זו כוללת את תרכובת הלכידה של SAH ו-SAH חופשי כמתחרה. כמו כן, כלולות חרוזיים מגנטיים מצופים בסטרפטאווידין בקוטר מיקרון אחד, באפר לכידה בריכוז פי חמישה, ובאפר שטיפה בריכוז פי חמישה. באמצעות שורת מבחנות PCR של 200 microliter, הכין חרוזיים מגנטיים מצופים בסטרפטאווידין הטעונים בתרכובת לכידת SAH על ידי ערבוב של 50 microliters של 10 milligrams per milliliter של חרוזיים מגנטיים מצופים בסטרפטאווידין עם 25 microliters של 100 micromolar של תרכובת לכידת SAH עבור כל מבחנה, וערבב בנערה חזקה.

נער את התרחיפים שהתקבלו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות כדי לאפשר קישור של מוטיבי הביוטין של תרכובת הלכידה לסטראפטאבידין שעל פני השטח של החרוז המגנטי. לאחר מכן, אסוף מגנטית את חרוזי ה-capra למכסי מבחנות ה-PCR באמצעות ה-capra mag, השלך את העליון (supernatant) ותלה באופן חוזר את חרוזי ה-capra שהתקבלו ב-200 µL של תמיסת שטיפה בריכוז 1×. שוב, אסוף מגנטית את חרוזי ה-capra למכסי רצועות מבחנות ה-PCR והשלך את העליון.

לאחר מכן, סגרו את המבחנות כדי למנוע את התייבשות החרוזים. בשלב הבא, סמנו מבחנות חדשות עבור בדיקת הלכידה (capture assay) ובקרות נחוצות, כולל בקרת התחרות (competition control). סמנו את בקרת התחרות של ה-pull down ואת השילוב של capture assay ו-pull down, והניחו את המבחנות המסומנות בתיבת ה-capra כדי לווסת את הטמפרטורה ב-0 עד 4 °C.

לאחר מכן, פפייט נפח של מי milli Q שחושב לנפח תגובה סופי של 100 µL ו-20 µL של capture buffer בריכוז פי חמישה. עבור כל תגובה, הוסף 0.26 mg של ליזאט תאים שלים של e coli dh5α לכל מבחנה וערבב בעדינות על ידי היפוך. עבור בקרת התחרות ובקרת התחרות של ה-pull down, הוסף 20 µL של תמיסת מתחרה SAH בריכוז 10 mM.

עבור בדיקת הלכידה (capture assay), ובדיקת הלכידה המשולבת עם השקיעה (pull down), הוסיפו 20 µL של מי milli Q במקום תמיסת ה-SAH, ערבבו בעדינות את כל המבחנות על ידי היפוך וסובבו קצרות בצנטריפוגה. לאחר מכן, השעו את חרוזי ה-capra בליזאט המתאים והדגירו למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 4 °C. שמרו על החרוזים בתגסוס באמצעות סיבוב כדי לאפשר קישור הפיך של חלבוני הקישור ל-SAH לתפקוד הסלקטיביות של תרכובת הלכידה של ה-SAH.

לאחר הדגירה, סבבו קצרה בצנטריפוגה והעבירו את התו கரைசות לקופסת ה-capra. הפרידו את המבחנות והוציאו אל קרח את התו கரைசות המיועדות ל-pull down ולבקרת התחרות של ה-pull down. השאירו את שאר התו கரைசות עבור בקרת התחרות של בדיקת הלכידה (capture assay) ובדיקת הלכידה המשולבת.

בנוסף, משוך מטה את תא הקאפרא (capra box) כדי להקרין את הדגימות באור UV תוך קירור סימולטני. הקרן את הדגימות למשך זמן כולל של 30 דקות, במרווחי הקרנה של 2.5 דקות, בתוך המבחנות הסגורות בטמפרטורה שבין 0 ל-4 מעלות צלזיוס. תהליך זה יצור קשר קוולנטי בין תפקיד התגובה של תרכובת הלכידה של SAH לבין החלבונים הקושרים SAH.

הוצא את התרחיפים מתיבת ה-Capra לאחר מרווח הקרנה של 2.5 דקות. קורר במי קרח למשך כ-15 שניות וערבב מספר פעמים על ידי היפוך. לאחר מכן, צנטריפוג את הדגימות לזמן קצר כדי להסיר שאריות תרחיף מהמכסים, והחזר אותן לתיבת ה-Capra למרווח ההקרנה הבא.

בשלב הבא, כלול את התרחיפים עבור pull down ובקרת תחרות ל-pull down, והוסף 20 µL של תמיסת SAH בריכוז 10 mM לבדיקת הלכידה עבור בקרת התחרות; עבור בקרת תחרות ה-pull down, ה-pull down ובדיקת הלכידה המשולבת עם pull down, הוסף 20 µL של מילי-Q. דגור את התרחיפים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, תוך שמירה על החרוזים בתרחיף באמצעות סיבוב בבדיקת הלכידה. חלבוני קישור ל-SAH שאינם מקושרים לצלבית למתרכבת לכידת ה-SAH יודחו.

לאחר הדגירה, אספו את חרוזי ה-capra מהתמיסות באמצעות ה-capra mag והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, שטפו את החרוזים על ידי השהייה מחדש, תליה ב-200 µL של תמיסת שטיפה בריכוז 1x ואיסוף החרוזים באמצעות הפרדה מגנטית. חזרו על שטיפה זו חמש פעמים, ולאחר מכן תלו אותם מחדש ב-200 µL של מי milli Q ואספו את החרוזים באמצעות הפרדה מגנטית.

יש להשעות מחדש את החרו지를 ב-200 microliters של 60% aceto nitrile ולאסוף אותם באמצעות ה-capri mag. חזור על שטיפה זו ב-acetyl nitrile פעמיים. ניתן להשתמש באולטרסאונד במידה והחרוזים אינם מושעים מחדש בקלות.

בשלב הבא, שחררו את החלבונים שנלכדו מהחרוזים על ידי הוספת 200 µL של תמיסה שהוכנה טרי של 60% acetyl nitrile ו-0.2% Tri Fluor acetic acid, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת ניעור חזק. שוב, השתמשו באולטרסאונד אם לא ניתן להחזיר את החרוזים למצב של סספנזיה בקלות.

לבסוף, אספו את החרו지를 באופן מגנטי והשליכ אותם. חיתכו את רצועת המבחנות למבחנות בודדות, נקבו את המכסים והמריאו את הנוזל שמעל המשקע עד לייבוש. בשימוש במאדה צנטריפוגלי בשלב זה, ניתן להעביר את החלבונים שנלכדו ל-SDS page או לעבד אותם למספקטרומטריית מסות כפי שמתואר בסעיף הבא; המיסו את החלבונים שנלכדו ושוחררו מהחרו지를 המגנטיים ב-10 µL של 50 mM ammonium bicarbonate.

הנח את הדגימות במכשיר אולטרסאונד (ultrasound bath), ולאחר מכן ערבב אותן במערבל וורטקס (vortex). בשלב הבא, הוסף מיקרוליטר אחד של trypsin בריכוז 0.5 micrograms per microliter ב-1 millimolar HCL, סבב קצר בצנטריפוגה והדגר את התמיסה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה. לאחר ההדגרה בלילה, בצע התפסלה (desalting) של תמיסה המכילה את פפטידי ה-triptych של החלבונים שנלכדו באמצעות חומר C 18, כגון stage tips בנפח 20 microliters מבית proxy on biosystems, לפי הוראות היצרן; אלוט את הפפטידים פעמיים עם 10 microliter של 50%methanol ו-5%formic acid.

לאחר מכן, יש לאדות את הממס באמצעות מאדה צנטריפוגלי, כך שיישארו הפפטידים המנוקים מינם למלח במצב יבש. המיסו את הפפטידים ב-5.5 µL של 0.1% formic acid תוך הפעלת אולטרסאונד באמבט אולטרסאונד וערבוב ב-vortex. לבסוף, נתחו את הדגימה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בזרם ננו (nano flow liquid chromatography) המשולבת עם ספקטרומטריית מסה בטור (tandem mass spectrometry) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לניתוח נתוני ה-MS/MS, השתמשו באלגוריתם לזיהוי חלבונים כגון seaquest המיושם ב-bioworks browser גרסה 3.3 0.1, SP one ו-X tandem המיושם בתוכנת scaffold three.

חיפוש אוטומטי במסד נתונים מבוצע מול בסיס הידע העדכני ביותר של משאב החלבונים העולמי. מסד הנתונים Swiss Pro שפורסם ב-www x pai. org של האורגניזם הנחקר.

בסיס הנתונים ששימש למחקר הנוכחי הוא זן coli. K12 release 57 dash 11 בתוך Seaquest; הוגדרה חיפוש אוטומטי בבסיס הנתונים עם סובלנות של 5 ppm עבור הפרוקורסור, סובלנות של 1 amu עבור יוני הפגמנט, וספציפיות מלאה לטריפסין המאפשרת עד שני שבירות חסרות.

הגדירו את שינויי המשתנים כך שיאפשרו פוספורילציה בסרין, תרנין וטירוזין; חמצון של מתיונין; דהימידציה באספראגין וגלוטמין; אצטילציה בליזין וסרין; פורמילציה בליזין; ומתיליציה בארגנין, ליזין, סרין, תרנין ואספראגין. אין להשתמש בשינויים קבועים בחיפוש במאגר הנתונים. טענו קבצי DTA או SRF שהופקו על ידי Seaquest לתוך תוכנת Scaffold 3, המבצעת הערכת הסתברות של השמות פפטידים וזיהויי חלבונים על ידי שילוב חיפושים במאגרי נתונים של Seaquest ו-X Tandem. Scaffold שימושית להשוואה, תיקוף והדמיה קלה של רשימות חלבונים ממספר דגימות.

הגדירו את הפרמטרים בתוכנת scaffold three כך שיקבלו רק זיהוי חלבונים וידווחו כפגיעות (hits) נפרדות. הגדירו את הפגיעות כך שיכילו לפחות פפטיד מבדיל אחד שעבר תיקוף הסתברותי. בהתאם לניתוח ב-scaffold three, התחשבו רק בפפטידים עם הסתברות של 95% ומעלה, כפי שנקבע על ידי אלגוריתם ה-peptide profit בתוך ה-scaffold.

שלוש תוכנות קבעו את הסתברויות זיהוי החלבונים עבור השמות פפטידים מרובים לערך הגבוה או השווה ל-95% בהתאם לאלגוריתם protein profit. עבור זיהויי חלבונים המבוססים על פפטיד בודד, נקבעה באופן שרירותי הסתברויות החלבון לגבוה או שווה ל-50% ובוצעה בדיקה ידנית של הפפטיד התואם. חלבונים בעלי ספקטרום Ms ms המורכבים מפפטידים דומים ולא ניתן להבדיל ביניהם על סמך ניתוח Ms MS בלבד, מקובצים על ידי התוכנה כדי לעמוד בעקרונות החסכנות (parsimony).

ניתן לקבוע את שיעור התגליות השגויות (false discovery rate) המשוער של זיהויי הפפטידים באמצעות גישת מאגר החלבונים ההפוך, וערך זה צריך להיות נמוך מ-1%כאן. ניתוח SDS page וצביעת כסף של החלבונים השלמים שנלכדו מוצג במבחן הלכידה. SAH חופשי בעודף הוסף לאחר שלב הקרינה ב-UV כדי להבטיח שרק חלבונים שהתרכבו קוולנטית עם תרכובת הלכידה באמצעות פונקציית הפוטו-ריאקטיביות יבודדו.

חלבונים זוהו באמצעות MS מרצועות ג'ל של חלבונים שנחתכו לאחר ביצוע Ingel Triptych Digest. לצורך השוואה, הנתיב השמאלי ביותר מציג 0.25% מליזאט של תאים שלמים של e coli DH five alpha, ממנו בודדו חלבונים בניסוי הלכידה. השוואה זו מדגישה את ההפחתה הדרמטית במורכבות הדגימה שהושגה באמצעות טכנולוגיית תרכובת הלכידה.

הביקרים הריצו במרכז הג'ל וכוללים את בקרת התחרות של הבדיקה. בקרה זו מכילה עודף של SAH חופשי כתחרות לפני שלב הקרינה ב-UVI כדי למנוע קישור של חלבונים לתרכובת הלכידה של SAH באמצעות פונקציית הסלקטיביות של SAH. בקרת התחרות חיונית לקביעת חלבונים שנלכדו באופן לא ספציפי שאינם נקשרים ל-SAH.

לפיכך, חלבונים שזוהו בבדיקת הלכידה (capture assay), אך לא בבקרת התחרות (competition control), הם חלבונים ספציפיים הקושרים SAH. כמו כן, נכלל ניסוי pull down ללא הקרנת UV וללא הוספה של SAH חופשי.

ביקרת התחרות של ה-pull down אינה מקרינה גם היא, אך היא מכילה SAH כמתחרה. לבסוף, בדיקת הלכידה המשולבת עם pull down מקרינה ב-UV, ולא הוסף SAH חופשי במהלך תהליך העבודה. ניכר כי קשירה צולבת פוטו-כימית (photo cross linking) משפרת את התנובה ואת הרגישות של הניסוי, וניתן לבחון בקלות את הספציפיות בניסויי תחרות באמצעות עודף של SAH חופשי, במקום לנתח את החלבונים השלמים שנלכדו באמצעות SDS page.

ניתן לנתח את כל תערובת החלבונים שנלכדו בבת אחת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בננו-זרימה המחוברת לספקטרומטריית מסה בטור (tandem mass spectrometry) לאחר עיכול בשיטת Triptych. זוהי גישת ה-CCMS האמיתית, והיא רגישה הרבה יותר מניתוח באמצעות SDS page. METHYLTRANSFERASES וחלבונים נבחרים אחרים שזוהו בניסויי CCMS מוצגים בטבלה זו.

המספרים המופיעים מציינים את ספירת הספקטרום של הפפטידים לכל חלבון ללא שקלול; מספר רב הרבה יותר של מתילטרנספראזים וחלבונים אחרים הנקשרים ל-SAH זוהו בבדיקת הלכידה (capture assay) בהשוואה לשיטת ה-pull down. הספציפיות ל-SAH מודגמת על ידי ההיעדר הכמעט מוחלט של חלבונים אלו בביקורת התחרות (competition control). המספר הכולל של החלבונים שזוהו בריצות ה-CCMS והחפיפה בין החלבונים בריצות השונות סוכמו בטבלה.

מספר החלבונים שזוהו עם לפחות שני פפטידים מופיע בסוגריים. ניתן להסיק על רמת השחזור הגבוהה של השיטה מהחפיפה הגבוהה של חלבונים, בעיקר חלבונים לא ספציפיים, בין ניסויים ברי השוואה, ובמיוחד בחלבונים שזוהו באופן חסון עם לפחות שני פפטידים כאן. דיאגרמות וון מתארות את החפיפה של החלבונים שזוהו בבדיקת הלכידה (capture assay), בביקורת התחרות (competition control) ובשליפה (pull down), בעוד שמספר כל החלבונים שזוהו מופיע מימין עם מספר החלבונים שזוהו עם לפחות שני פפטידים בסוגריים; מספרי המתיל-טרנספראזות וה-SAH nuclease מוצגים משמאל.

הדגמנו כעת כיצד לבודד ולזהות מתילטרנספראזים או סב-פרוטאומיים תפקודיים אחרים מליזאט של תאי e coli או מליזאט של רקמות או תאים אחרים באמצעות ספקטרומטריית מסות של תרכובת לכידה (CCMS). בעת ביצוע נוהל זה, חשוב לזכור להימנע מחשיפה ממושכת של תרכובת הלכידה לאור נראה, לשמור על הדגימות קרירות, להכין טרי את תמיסת ה-TFA Aceto Nitrile המשמשת לשחרור החלבונים הנלכדים מחרוזי המגנט, ולמנוע זיהום של הניסויים ממקורות חלבון חיצוניים, כגון קרטין המגיע מאבק או מהנסיין.

בנוסף, גילינו שזה תלוי בהגדרה הספציפית, האם התצורה שאינה סטנדרטית (offbeat), כלומר התצורה שבה קישור צולב פוטו-כימי מתרחש בין התרכובת שלפני הלכידה לבין החלבונים והתמיסה, או התצורה הסטנדרטית (on beat) המתוארת כעת, מביאה לתוצאות טובות יותר. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.