אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי
3 בנובמבר 2010
עמותות גנטית לעתים קרובות להישאר בלתי מוסבר ברמה התפקודית. שיטה זו נועדה להעריך את ההשפעה של פנוטיפ הקשורים סמנים גנטיים על ידי ניתוח ביטוי גנים בתאים הטרוזיגוטיים SNPs עיבד. הטכנולוגיה מאפשרת מדידה מדויקת של MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה לכמת ספציפי אלל פריימר המוצרים הרחבה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון האם לווריאנט DNA מסוים, כגון זה הקשור למחלה, יש השפעה על הביטוי של גן מסוים. זאת מושג על ידי בחירת שורות תאים ההן הן הטרוזיגוטיות הן לווריאנט זה והן ל-snip מקודד בגן הנחקר. כשלב שני, DNA ו-RNA מופקים מהתאים ומשמשים לאחר מכן כתבנית לתגובת extension ראשונית ספציפית לאלל.
לאחר מכן, מוצרי ההארכה הראשוניים מנותחים באמצעות ספקטרומטריית מסות כדי לכמת את השכיחות היחסית של שני האללים. התוצאות המתקבלות מראות האם הווריאנט המקורי של ה-DNA הקשור למחלה קשור גם להבדל בביטוי הגנים, בהתבסס על מדידות כמותיות ספציפיות לאלל באמצעות ספקטרומטריית מסות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שבניגוד לבדיקה המבוססת על גן דחף של לוסיפראז, היא אינה דורשת מניפולציה מולקולרית ומודדת רמות אנדוגניות של ביטוי גנים.
יתרה מכך, אנו יכולים להשוות את רמות הביטוי בין שני האללים באופן מבוקר פנימית, דבר המסיר חלק מהשונות הניסוית. שיטה זו מסייעת לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הגנטיקה האנושית, כגון המכניזמים המולקולריים העומדים בבסיס קשרי גנטיקה. גיבשנו תחילה את הרעיון לשיטה זו כאשר זיהינו קשר גנטי המקיף שלושה גנים ולא הצלחנו למקד אות אחד לגן בודד.
באמצעות מיפוי גנטי נוסף. התאים המשמשים לבדיקה זו צריכים לבטא את הגן המדובר וכן לעמוד בשתי דרישות גנוטיפיות בסיסיות. עליהם להיות הרטרוזיגוטים הן לרצפי ה-DNA הקשורים למחלה והן לסמני DNA, שיכולים להבחין בין תמלילים על סמך מקורם הכרומוזומלי. באסטרטגיית הבחירה של שורת התאים המוצגת כאן, שורות תאים A ו-B, כאשר A היא הרטרוזיגוטית לסמן מקודד המעותק, המיוצג על ידי משולשים.
עם זאת, שורת התאים Omnicell A היא הטרוזיגוטית לרצף ה-DNA הקשור למחלה, הנקרא וריאנט DNA של סיכון ומיוצג על ידי עיגולים. האלל הכחול של וריאנט הסיכון קשור לרמה נמוכה יותר של שעתוק. לאחר בחירת תרבית שורת התאים בבקבוק בהתאם למפרטי הספק (בהדגמה זו נשתמש בפיברובלסטים), הכינו שתי צלחות פטרי בנפח 10 סנטימטר להפקות DNA ו-RNA בהתאמה, למרות שבדיקה זו ישימה באותה מידה גם לסוגי תאים אחרים, כולל תאים ראשוניים.
כאשר התאים מגיעים ל-80% confluence, ניתן לאסוף אותם לצורך מיצוי DNA ו-RNA בשיטות סטנדרטיות, כולל שימוש בערכות זמינות מסחרית המתאימות לסוג התאים שנבחר. לפני ביצוע בדיקה זו, תכננו שני זוגות של פריימרים ל-PCR עבור כל סמן DNA: זוג אחד להגברה של DNA גנומי והשני להגברה של cDNA. מקמו את הפריימרים הקדמיים והאחוריים להגברת cDNA באקסונים שונים כדי למנוע זיהום גנומי. תכננו את הפריימרים כך שיתקבל תוצר PCR באורך של 100 עד 500 base pairs עבור כל השורה התאית. הכינו תגובות PCR בנפח של 80 µL. בכל פעם, הכינו ארבע תגובות עצמאיות להגברת DNA גנומי וארבע תגובות עצמאיות להגברת cDNA.
תערובת ה-PCR מכילה DNA תבנית, NTPs, פריימרים, מגנזיום כלוריד, ו-genomic DNA או cDNA. יש להריץ את תגובות ה-PCR תחת התנאים שעברו אופטימיזציה עבור כל זוג פריימרים, תוך שמירה על מספר מחזורים הנמצא בשלב הלינארי של ההגברה. עם השלמת תגובות ה-PCR, יש להסיר את פריימרים של ה-PCR ואת ה-dNTPs העודפים על ידי הוספת exonuclease one ו-shrimp alkaline phosphatase (SAP) לכל תוצר PCR ודגירה ב-37 °C למשך 20 דקות, ולאחר מכן 15 דקות ב-85 °C.
הטביעו כל תוצר PCR פעמיים על פלטה של 384 בארות, כך שיהיו שמונה מדידות זמינות עבור כל דגימה. סה"כ 16 נקודות עבור בדיקת ההארכה הראשונית. תכננו את הפריימר להארכה באמצעות התוכנה לעיצוב הבדיקה, כך שניתן יהיה להשתמש באותו פריימר הן עבור תוצרי DNA גנומי והן עבור תוצרי cDNA-PCR.
קבע את אורך הפריימר בטווח של 14 עד 18 זוגות בסיסים. בצע את תגובת ההארכה הראשונית עם התערובת המתאימה של שלושה מסיימי דאוקסי-נוקלאוטידים ודאוקסי-נוקלאוטיד אחד. תגובת הארכה ראשונית טיפוסית כוללת שלב התחלה ב-94 °C למשך שתי דקות, ולאחריו 40 מחזורים של 94 °C למשך חמש שניות, 52 °C למשך חמש שניות ו-72 °C למשך חמש שניות.
לבסוף, את האוליגונוקלאוטידים המוארכים מכמתים באמצעות ספקטרומטריית מסות מסוג matrix assisted laser desorption ionization time of flight באמצעות ספקטרומטר מסות עם Spectro reader. נקודה מרכזית בפרוטוקול זה היא שימוש במספר אסטרטגיות לבקרת רעש ניסויי כדי למנוע הופעת ארטיפקטים. חשוב מאוד לחזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.
הביקורת הטובה ביותר עבור הניסוי היא שימוש בשורת תאים ההטרוזיגוטית עבור בדיקת ה-snip לציפוי עבור ההארכה הראשונית, אך אינה נושאת את האלל הקשור למחלה. בנוסף, תכננו בדיקות עבור סמני קידוד חלופיים של DNA מתומלל. אם אלה אינם זמינים, ניתן לספק ביקורת נוספת באמצעות זוגות פריימרים חלופיים ל-PCR המתמקד באקסונים שונים עבור בדיקת ההארכה הראשונית.
ניתן לספק בקרה פנימית על ידי תכנון פריימרים להארכה הנשחבים הן לגדיל הקדמי והן לגדיל ההפוך. כאן מוצגת דוגמה לניתוח ביטוי ספציפי לאלל עם דוגמאות של עקומות ספקטרומטריית מסות. איור זה מציג את תוצאות הניתוח של ארבעה תוצרי הארכה ראשוניים ספציפיים לאלל שבוצעו על ארבעה תבניות שונות.
שני הגרפים העליונים מייצגים את התוצאות שהתקבלו מניתוח של DNA גנומי משני קווי תאים שונים, שניהם הומוזיגוטים לפולימורפיזם מקודד שעבר טרנסקריפציה. עם זאת, רק קו תאים A הוא הומוזיגוט לווריאנט ה-DNA של הסיכון. שני הגרפים התחתונים מייצגים את התוצאות שהתקבלו מניתוח של cDNA שהופק מאותם קווי תאים כתוצאה מארטיפקט ניסיוני.
השיא הראשון תמיד גבוה יותר מהשיא השני, גם בניתוח הגנומי. לפיכך, התוצאות מהניתוח הגנומי משמשות לנורמליזציה של נתוני ה-CDNA. ניתוח סטטיסטי מבוצע על ידי הפקת דוח טיפוס ELO מלא בתוך תוכנת ה-mass array.
דו"ח זה מספק נתונים לגבי שטח הפסגה, וכאן אנו מציגים דוגמה ביחס לשתי שורות תאים, תא A ותא B, שהם הטרוזיגוטים עבור snip מקודד, אך רק תא A הוא הטרוזיגוט עבור סמן הקשור למחלה. העמודות המוצגות באפור נוצרו ישירות על ידי התוכנה, בעוד שהעמודות המוצגות בירוק הופקו ידנית עבור כל תא. ישנן שמונה מדידות הן עבור ה-CDNA והן עבור ה-DNA הגנומי.
התוכנה תחשב את השטח תחת כל שיא בספקטרום, המייצג את השכיחות של כל אחד משני האללים. יחס האללים מחושב על ידי חלוקת השטח של אלל אחד בשטח של אלל שני עבור כל דגימת CDNA ודגימה גנומית. ממוצע וטעות תקנית מחושבים על פני שמונה המדידות.
שגיאת תקן גבוהה הגדולה מ-0.1 מעידה על כך שהמדידות אינן עקביות ויש להתעלם מהן. לבסוף, יחס הממוצע של ה-CDNA מנורמל באמצעות יחס הממוצע של ה-DNA הגנומי כדי להעריך את הסטייה מיחס של אחת, המצופה כאשר אין הבדל בביטוי ספציפי לאלל. היחס המנורמל שונה מאחד בתא A, אך קרוב לאחד בתא B; נתונים אלו מרמזים שקו התאים A נושא וריאנט DNA השכיח עם האלל שנמדד על ידי הפסגה השנייה, מה שמפחית את הביטוי של הגן הנבדק.
קו התאים B מספק ביקורת שלילית נוחה מאוד. בעוד שניסיונו של הליך זה חשוב מאוד להגדרה של וריאנטים גנטיים בעלי ערך מידע ולהגדרת ביקורות ניסיוניות מתאימות בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) ספציפי להפלוטיפ, אשר מסייעות במתן מענה לשאלות כגון מקומם של וריאנטים גנטיים שאין עבורם סממנים מתועקים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח ביטוי גני ספציפי לאלל.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנתח RNA באופן ספציפי לאלל, וכיצד להשתמש בכך כדי להבין וריאנטים פונקציונליים בעלי חשיבות גנטית.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את ההשפעה של סמנים גנטיים הקשורים לפנוטיפ על ביטוי גנים, באמצעות ניתוח של תאים הטרוזיגוטים עבור SNP-ים ששוכפלו בתמלול. השיטה עושה שימוש בספקטרומטריית מסות מסוג MALDI-TOF כדי לכמת במדויק תוצרי הארכת פריימר ספציפיים לאלל.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדעי
- גנטיקה
- ביטוי גנים
- ספקטרומטריה של מסות
רקע
- לקשרי גנטיקה חסרים לעיתים קרובות הסברים פונקציונליים.
- הבנת הקשר בין וריאנטים של DNA לבין ביטוי גנים היא חיונית.
- שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של רמות ביטוי גנים.
- היא מטפלת בשונות של תוצאות ניסיוניות באמצעות שימוש בגישה עם בקרה פנימית.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של וריאנטים ספציפיים ב-DNA על ביטוי גנים.
- לדיוק של קשרים גנטיים לגנים ספציפיים.
- לספק תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס קשרים גנטיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירה של שורות תאים הטרוזיגוטיות הן עבור וריאנטים הקשורים למחלה והן עבור SNPs מקודדים.
- מיצוי DNA ו-RNA מתאים תאים תרביתיים.
- תגובות הארכת פריימר ספציפיות לאלל, ולאחריהן ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות.
- אסטרטגיות בקרה לצמצום רעשים ניסיוניים וארטיפקטים.
תוצאות עיקריות
- התקבלו מדידות כמותיות של ביטוי ספציפי לאלל.
- התוצאות הצביעו על מתאם בין הווריאנט של הסיכון לבין רמות ביטוי הגנים.
- הוכשחה יעילות השיטה בהפחתת השונות הניסויית.
- סופקו ראיות למנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הקשרים הגנטיים.
מסקנות
- שיטה זו מציעה גישה מהימנה לחקר ביטוי גנים הקשור לווריאנטים גנטיים.
- היא משפרת את ההבנה של ההשלכות התפקודיות של קשרים גנטיים.
- ניתן ליישם את הטכניקה על סוגי תאים שונים מעבר לפיברובלסטים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות ביטוי גנים ספציפיות לאלל מספקות גישה כמותית וישירה לבחינת ההשפעה התפקודית של וריאנטים גנטיים על בקרה גנטית בהקשרים תאיים הרלוונטיים למחלה. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים באימות מטרות (target validation) ולהבהרת הבסיס המולקולרי של קשרי גנטיקה, ובכך היא מאפשרת קידום בטוח יותר של מטרות דרך נקודות ההכרעה המוקדמות של תהליך הגילוי. שילוב של בדיקות אלו בקווי הייצור הביופארמצבטיים תומך בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו על ידי קישור הגנוטיפ לתוצאה התפקודית בעלת ערך ניבוי גבוה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של השאלה האם וריאנטים של DNA הקשורים למחלה משנים את ביטוי הגנים במערכות אנדוגניות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות שפע של תמלילים ספציפיים לאלל בקווי תאים הטרוזיגוטיים.
- מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת תוצאות כמותיות עם בקרה פנימית להשפעות הווריאנטים.
- מסייע בתיעדוף של קשרים גנטיים לצורך פיתוח טיפולי בהמשך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות תאיים שעברו ולידציה לסריקות המשך על ידי אישור הבדלי ביטוי התלויים בגנוטיפ.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות זיהוי של תמלילים ספציפיים לאלל המבוסס על ספקטרומטריית מסות.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת הרחבה (scalability) על פני סוגי תאים ורקעים גנטיים מרובים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על ביטוי גנים במערכות מוגדרות גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם נתונים של גנומיקה פונקציונלית עם סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה על ידי קישור וריאנטי סיכון לשינויים בביטוי.
- מספק רצף ממחקרי אסוציאציה גנטית לוולידציה במודלים פרה-קליניים.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס סיכון באמצעות הבהרת המנגנון המולקולרי של מטרות מועמדות.
- משפר את הביטחון החזוי במחקר תרגומי באמצעות שימוש בהקשרי בקרה גנטית אנדוגנית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
בדיקה זו משתלבת בנקודת המפגש שבין תגליות ראשוניות, תיקוף מטרות ומחקר פרה-קליני, ומגשרת בין ממצאים של קשר גנטי לבין ראיות מולקולריות פונקציונליות.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות על ידי כימות ההשפעה של וריאנטים ספציפיים על ביטוי גנים בסוגי תאים רלוונטיים.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים וסטנדרטיים של ביטוי ספציפי לאלל לצורך מוכנות ושחזור של הבדיקה.
- אנליטיקה: מייצרת יחסי אללים מנורמלים ופלטים סטטיסטיים להשוואה בין תנאי וריאנט לתנאי ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין סממני סיכון גנטיים לבקרה תפקודית של גנים, ובכך תומכת בהתאמת סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי גנומיקה תפקודית על פני מטרות ומערכות תאים מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית אי-ודאות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה לניתוח ביטוי ספציפי לאלל.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון על ידי הבהרת תפקוד הווריאנט.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות מאוששות גנטית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה מולקולרית, עיצוב פריימרים ואנליזה של ספקטרומטריית מסות.
- נדרשת גישה לספקטרומטריית מסות MALDI-TOF ותוכנה ייעודית לכימות אללי.
- נדרשים בקרות ניסיוניות קפדניות וחזרות להבטחת מהימנות הנתונים.
- יש לבחור שורות תאים ההטרוזיגוטיות הן לווריאנטים של סיכון והן לסמנים מקודדים, עם ביטוי גני מתאים.
- התאמה לסוגי תאים אחרים או לרקעים גנטיים שונים עשויה לדרוש זיהוי ותיקוף של סמנים נוספים.
