פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנטר באופן לא פולשני שינויים מטבוליים בזמן אמת ברמת בעלי החיים כולה בתוך גליקוליזה, מטבוליזם פירובט ומחזור החומצה הטריקרבוקסילית הנגרמים על ידי מסלול מטבולי אינדיבידואלי, שינויים גנטיים ו/או טיפולים תרופתיים. זה מושג על ידי הזנת איזוטופים יציבים לנמטודות חיות כדי לספק העשרה איזוטופית מספקת במטבוליטים נוספים כדי לאפשר כימות של שינויים גנטיים ו/או פרמקולוגיים במסלולים מטבוליים מתווכים. כשלב שני, שילוב איזוטופי בפחמן דו חמצני אטמוספרי ומומס נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה של יחס גזים, המספקת הערכה ישירה יותר של שטף מטבולי מתווך על פני פרקי זמן קצרים.

הדגימות הבאות מעובדות לניתוח חומצות אמינו ללא תולעים שלמות באמצעות HPLC וכן על ידי העשרה איזוטופית בחומצות אמינו וחומצות אורגניות על ידי GCMS על מנת לכמת את שינוי השטף המטבולי בנמטודות. לאחר חשיפה יציבה לאיזוטופים, מתקבלות תוצאות המראות השפעות של משכי זמן משתנים של חשיפה לאיזוטופים, פינוי חיידקים והפרעה חלופית של תולעים בתולעים מסוג בר כדי לחקור שפע איזוטופי במטבוליטים מתווכים. מלחמה עם שיטה יכולה לספק תובנה לגבי מפרש נגד חילוף חומרים מתווך.

ניתן ליישם אותו גם על המערכות שלנו, כגון קווי תאים ורקמות של יונקים. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ראינו חריגות עקביות בניתוח חומצות אמינו של תולעים חופשיות על ידי HPLC שהציעו על פגיעה בשטף מטבולי מתווך בתפקוד שינויים נשימתיים ראשוניים. כדי להתחיל בהליך זה.

תולעים שנחשפו לאיזוטופ יציב המסומן כמבשר מטבולי במהלך ההתפתחות או בבגרות, נאספות בצינור צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 1.5 מיליליטר. בדרך כלל אנו מדללים את התולעים לריכוז של 1000 תולעים למיליליטר אחד. הוסף 60% לכל חומצה כלורית המכילה חומצה אמינוקפרואית אפסילון כתקן פנימי לתולעים לריכוז סופי של 4% לכל חומצה כלורית ו-20 ננו-מולר של תקן פנימי.

הניחו לתולעת להתיישב בכוח הכבידה למשך חמש דקות, ואז הוציאו את הסופרנטנט ושמרו אותו בצינור אחר. השלב הבא הוא אחד ההיבטים הקריטיים ביותר בהליך זה. יש לשבש את התולעים לחלוטין על ידי סינון לפני ניתוח מטבוליט חופשי באמצעות הומוגנייזר פלסטיק ומקדחה ממונעת, טוחנים את דגימות התולעת למשך 15 שניות.

אשר חזותית את שיבוש התולעת על ידי מיקרוסקופ אור וחזור על הטחינה במידת הצורך. בתמונה זו, לוחות A ו-B מציגים תולעים לפני הטחינה. בניגוד לפאנלים C ו-D המראים תולעים לאחר הטחינה מעבירות את הסופרנטנט שנשמר קודם לכן לצינורות צנטריפוגה מפלסטיק של 1.5 מיליליטר עם צנטריפוגת התולעת Homogenate.

הדגימות ב-2,250 סל"ד 1300 Gs למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור זכוכית טרי של שבעה מיליליטר. שמור את הגלולה לשימוש מאוחר יותר בבדיקת ריכוז חלבון.

כעת הוסיפו ארבעה אשלגן הידרוקסיד רגיל ל-SUPERNAT עד שטווח ה-pH של הדגימות יהיה שבע עד שמונה צנטריפוגות. הדגימות המנוטרלות בשבעת צינורות הזכוכית של מיליליטר ב-2,250 סל"ד 1300 Gs למשך חמש דקות כדי להסיר מלחים, העבירו את הסופרנטנט מכל דגימה לצינור זכוכית טרי של שבעה מיליליטר. כעת ניתן להכין את הדגימות המנוטרלות לכימות מטבוליט על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או HPLC וכרומטוגרפיה של גז, ספקטרומטריית מסה או GCMS עבור HPLC.

הפרד 50 מיקרוליטר מכל דגימה מנוטרלת להזרקה ישירה ל-HPLC. כימות חומצות אמינו חופשיות מתבצע באמצעות נגזרת פרקלית עם אלדהיד וזיהוי פלואורסצנטי. כפי שתואר קודם לכן, הדגימות המנוטרלות הנותרות יעברו מיצוי באמצעות שרף חילופי יונים עבור GCMS כדי לקבוע העשרה איזוטופית בחומצות אמינו וחומצות אורגניות כפי שמוצג בסעיף הבא.

להכנת החרוזים, הוסף חומצה הידרוכלורית רגילה אחת לחרוזי G אחד ו- G 50 בנפרד. בכוסות ליטר אחד, מערבבים כל בקבוק במשך 30 דקות תוך ערבוב מגנטי. לאחר מכן יש לשטוף את החרוזים במים נטולי יונים 10 פעמים עד שה- pH של הכביסה שווה ל- pH של המים.

בשלב הבא נציג את השיטה שלנו להכנת עמודים בעלות נמוכה בהתאמה אישית באמצעות פיפטות זכוכית. עמודים מוכנים מראש זמינים גם מסחרית. כדי להכין עמוד, השתמש במלקחיים כדי להכניס פקק כותנה ממש מעל החלק הצר ביותר של קצה פיפטה מרעה, השתמש בחרוזי G one למיצוי חומצה אורגנית וחרוזי G 50.

למיצוי חומצות אמינו, מלא כל עמודה עד כשליש מגובה העמודה. אם דגימה כבר נמצאת ב-pH ניטרלי, שום דבר לא מתווסף לדגימה לפני החלתה על העמודה AG one. כדי לחלץ חומצות אורגניות להפקת חומצות אמינו, הוסף לדגימה מיליליטר אחד של 0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה לפני החלתה על עמודת AG 50.

כעת החל את הדגימות המנוטרלות שהוכנו בעבר על כל עמודה. שוטפים כל עמוד 10 פעמים במים עד שהכביסה ניטרלית. לאחר השלמת הכביסה, הסר כל עמודה לבקבוקוני דגימת זכוכית טריים עם תווית של ארבעה מיליליטר למיצוי חומצה אורגנית, הוסף שלושה מיליליטר של שלוש חומצה הידרוכלורית רגילה לעמודה אחת של AG.

זה מאפשר ניתוח של העשרת איזוטופים במספר הכולל של פחמנים מסומנים בין שלושה מיני פחמן, ארבעה מיני פחמן, חמישה מיני פחמן ושישה מיני פחמן. למיצוי חומצות אמינו, הוסף שלושה מיליליטר של ארבעה אמוניום הידרוקסיד רגיל לעמודה A G 50. זה מאפשר ניתוח של העשרת איזוטופים במספר הכולל של פחמנים מסומנים בין שלושה מיני פחמן וחמישה מיני פחמן.

בסיום מיצוי החומצה האורגנית וחומצות האמינו, הנח את בקבוקוני הדגימה במאייד תגובתי שלוש למשך הלילה עד שהם יבשים. לאחר מכן הדגימות עוברות ניתוח על ידי GCMS כמפורט בטקסט הפרוטוקול. התחל הליך זה על ידי העברת אלף תולעים בוגרות צעירות לצלחת ניסיונית של 35 מילימטר NGM agri המכילה פחמן 13 גלוקוז ואי קולי עם תווית אוניברסלית.

לאחר מכן הניחו את לוחית ה-NGM הניסיונית ללא הכיסוי שלה. בתא זכוכית מותאם אישית המצויד בזין עצירה תלת כיווני אטום היטב כדי לאפשר דגימה והחלפה מדויקת של האווירה. כסו את החותם במקום שבו דיסק הזכוכית השקוף אופטית יושב על הצלחת בשומן ואקום גבוה.

אטום את החדר עם דיסק הזכוכית. רשום את השעה. כזמן אפס, 30 דקות לאחר מכן, השתמש במזרק של 20 מיליליטר כדי לדגום 10 מיליליטר מהאטמוספירה מתא הזכוכית על ידי זין העצירה התלת-כיווני.

סגור את זין העצירה לתא לאחר הדגימה, העבירו את הדגימה לצינור זכוכית שואב אבק באמבטיה אדומה המכיל מיליליטר אחד של נתרן ביקרבונט ב-0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי. לאחר מכן, הזרקו 10 מיליליטר אוויר לתא הזכוכית דרך זין העצירה התלת-כיווני. בעזרת מזרק של 20 מיליליטר, סגור את זין העצירה לתא לאחר הזרקה חוזרת של אטמוספירה ולפני חידוש הדגירה, חזור על דגימה של האטמוספירה מתא הזכוכית ב-60, 90 ו-120 דקות.

נתח את דגימות הפחמן הדו חמצני האטמוספרי הללו להעשרת פחמן מסומנת באמצעות ספקטרומטר מסה ביחס גז כמתואר בטקסט הפרוטוקול, איזוטופים יציבים משולבים היטב לאחר שעתיים בתולעים בוגרות צעירות כפי שמעידים כאן פחמן מתויג שנמדד בפחמן דו חמצני אטמוספרי ופחמן דו חמצני תולעת מומס בתולעים שניזונו מחיים או מוקרנים UV הרגו OP 50 e coli. היחס בין פחמן 13 פחמן דו חמצני לפחמן 12 פחמן דו חמצני היה גדול יותר בחלק הפחמן הדו חמצני של התולעת המומסת ביחס לפחמן הדו חמצני האטמוספרי המשוחרר. נצפה כי חשיפה ממושכת לאיזוטופ יציב מתקופת הזחל ולאחר מכן ניקוי תולעים על NGM Aate ללא חיידקים הגבירה את ההעשרה האיזוטופית של גלוטמט חופשי בתולעים בוגרות צעירות.

בגרף זה, L one מייצג תולעים שניזונו מפחמן 13 גלוקוז וחיידקי OP 50 מסומנים באופן אוניברסלי משלב הזחל L אחד דרך שלב הבוגר הצעיר של 959 תאים YA מייצג תולעים שניזונו מפחמן 13 גלוקוז וחיידקי OP 50 במשך 48 שעות החל מהיום הראשון של שלב הטלת הביצים הצעיר. ציר ה-x מציין את המספר הכולל של אטומי הפחמן המסומנים בכל מין גלוטמט, וציר ה-Y מציין אחוז העשרה. כל בעלי החיים נוקו מעודפי תווית איזוטופית לפני הכנת הדגימה במורד הזרם.

עבור ניתוחי GCMS, הפסים הירוקים מצביעים על תולעים שנוקו בעקבות חשיפה איזוטופית על ידי הזנה ב-OP 50 E coli על לוחות NGM במשך שעתיים לפני מיצוי PCA. הפסים הכחולים והאפורים מצביעים על תולעים שנוקו בעקבות חשיפה איזוטופית על לוחות NGM ללא חיידקים במשך שעתיים או שש בהתאמה לפני מיצוי PCA ללא קשר למהלך זמן החשיפה האיזוטופי. לא נצפה הבדל משמעותי בהעשרה איזוטופית במטבוליטים מתווכים כאשר בעלי חיים נוקו על צלחות למשך שעתיים או שש שעות.

בשני קורסי החשיפה לאיזוטופים, נצפתה פחות העשרה איזוטופית במטבוליטים מתווכים כאשר בעלי חיים נוקו על ידי האכלת חיידקים ללא תווית במשך שעתיים. לכן, פרוטוקול הניקוי האופטימלי עבור תולעים הגדלות על לוחות N GM עם איזוטופ נקבע כניקוי במשך שעתיים על לוחות NGM לא מפוזרים כדי לייעל את אחוז ההעשרה במטבוליטים מתווכים. לאחר טיפול במשך 24 שעות בתרבית נוזלית עם גלוקוז אחד שש פחמן 13 ללא חיידקים.

נעשתה השוואה של דגימות תולעים שהופרעו על ידי סוניקציה בלבד או סוניקציה בתוספת שחיקה כפי שמוצג באיור זה. לתולעים שהופרעו על ידי סוניקציה בתוספת טחינה הייתה העשרה איזוטופית גדולה יותר מאשר דגימות שהופרעו רק על ידי סוניקציה שהאכילו לבסוף תולעים חיות עם מבשר איזוטופי יציב במהלך ההתפתחות משלב L אחד על צלחות או החל מהיום הראשון של הביצה, המטילות כבוגרים צעירים במשך 24 שעות בתרבית נוזלית. לאפשר ניתוח רגיש של העשרה איזוטופית בין מטבוליטים המעידים על שטף באמצעות גליקוליזה, מטבוליזם פירובט במחזור החומצה הטריקרבוקסילית לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך למחלות מיטוכונדריאליות, מחקרים לחקור שטף מטבולי ביניים באלגנטיות הים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע איזוטופים יציבים, פרופיל של חילוף חומרים מתווך ושטף מטבולי בנמטודות, האלגנטיות.