פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנטר באופן לא פולשני שינויים מטבוליים בזמן אמת ברמת החיה כולה בתוך הגליקוליזה, מטבוליזם של פירובט ומעגל חומצה הטריקרבלית, הנגרמים על ידי מסלול מטבולי בודד, שינויים גנטיים ו/או טיפולים פרמקולוגיים. דבר זה מושג על ידי הזנה של איזוטופים יציבים לנמטודות חיות כדי לספק העשרה איזוטופית מספקת במטבוליטים רבים יותר, המאפשרת כימות של שינויים גנטיים ו/או פרמקולוגיים במסלולים מטבוליים ביניים. כשלב שני, נמדדת השילוב האיזוטופי בפחמן דו-חמצני אטמוספירי ומומס באמצעות ספקטרומטריית מסות של יחסי גזים, המספקת הערכה ישירה יותר של שטף מטבולי של ביניים לאורך פרקי זמן קצרים.

הדגימות הבאות מעובדות לניתוח חומצות אמינו חופשיות בתולעת שלמה באמצעות HPLC, וכן להעשרה איזוטופית בחומצות אמינו ובחומצות אורגניות באמצעות GCMS, וזאת על מנת לכמת שינויים בשטף המטבולי בנמטודות. בעקבות חשיפה לאיזוטופים יציבים, מתקבלות תוצאות המראות השפעות של משכי חשיפה משתנים לאיזוטופים, פינוי בקטריאלי ושיטות חלופיות לפירוק התולעת בתולעים מסוג בר (wild type), כדי לבחון את השפעות האיזוטופית במטבוליטים ביניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המטבוליזם של תוצרי הביניים.

ניתן ליישם זאת גם במערכות שלנו, כגון תאי יונקים ורקמות. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר הבחנו בחריגות עקביות בניתוח חומצות amin acids חופשיות בתולעים באמצעות HPLC, שהצביעו על פגיעה בזרימה המטבולית של תוצרי ביניים בתפקוד של שינויים נשימתיים ראשוניים. כדי להתחיל בהליך זה.

תולעים שנחשפו למבשר מטבולי המסומן באיזוטופ יציב, בין אם במהלך ההתפתחות ובין אם בבגרות, נאספות לשפופרת צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 1.5 milliliter. בדרך כלל אנו מדללים את התולעים לריכוז של 1000 תולעים ל-one milliliter. יש להוסיף לתולעים חומצה פרכלורית 60% המכילה epsilon aminocaproic acid כתקן פנימי, עד לריכוז סופי של 4% חומצה פרכלורית ו-20 nanomolar של תקן פנימי.

הניחו לתולעת לשקוע בכבידה במשך חמש דקות, לאחר מכן הסירו ושמרו את הנוזל העליון (supernatant) במבחנה אחרת. השלב הבא הוא אחד ההיבטים הקריטיים ביותר בפרוצדורה זו. יש לפרק את התולעים לחלוטין באמצעות סינון לפני ניתוח מטאבוליטים חופשיים. השתמשו בהומוגניזטור פלסטיק ובמקדחה ממונעת כדי לטחון את דגימות התולעים למשך 15 שניות.

אששו באופן חזותי את פירוק התולעים באמצעות מיקרוסקופיה של אור וחזרו על הגריסה במידת הצורך. בתמונה זו, פאנלים A ו-B מציגים את התולעים לפני הגריסה. בניגוד לפאנלים C ו-D המציגים את התולעים לאחר הגריסה, העבירו את העילאי השמור קודם לכן לתוך מבחנות צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 1.5 מיליליטר עם הומוגנאט התולעים לצנטריפוגה.

סובבו את הדגימות במהירות של 2,250 RPM ובכוח צנטריפוגי של 1300 Gs למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה זכוכית נקייה בנפח של שבעה מיליליטר. שמרו את המשקע (pellet) לשימוש מאוחר יותר בבדיקה של ריכוז חלבונים.

כעת הוסיפו ארבעה נורמליים של פוטסיום הידרוקסיד ל-SUPERNAT עד שטווח ה-pH של הדגימות יהיה בין שבע לשמונה. סנטריגו את הדגימות המנוטרלות במבחנות זכוכית של 7 ml במהירות של 2,250 RPM (1300 Gs) למשך חמש דקות. כדי להסיר מלחים, העבירו את העלייה מכל דגימה למבחנת זכוכית חדשה של 7 ml. כעת ניתן להכין את הדגימות המנוטרלות לכימות מטאבוליטים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC) וכרומטוגרפיה גזית בשילוב ספקטרומטריית מסות (GCMS). עבור HPLC.

הפרידו 50 µL מכל דגימה מנוטרלת להזרקה ישירה ל-HPLC. כימות חומצות שומשם חופשיות מבוצע באמצעות דריבטיזציה מוקדמת עם אלדהיד וגילוי פלואורסצנטי. כפי שתואר בעבר, שאר הדגימות המנוטרלות יעברו מיצוי באמצעות שרף חילוף יונים עבור GCMS כדי לקבוע העשרה איזוטופית בחומצות אמינו ובחומצות אורגניות, כפי שמוצג בסעיף הבא.

להכנת החרוזיים, הוסיפו חומצה קלוסירית רגילה אחת לחרוזי G1 ולחרוזי G50 בנפרד. בכוסי כימיים של 1L, ערבבו כל בקריקה למשך 30 דקות באמצעות מערבל מגנטי. לאחר מכן, שטפו את החרוזיים במים דה-יוניים 10 פעמים, עד שה-pH של מי השטיפה יהיה שווה ל-pH של המים.

בשלב הבא, נציג את השיטה שלנו להכנת עמודות מותאמות אישית בעלות נמוכה באמצעות פיפטים מזכוכית. עמודות מוכנות זמינות גם לרכישה מסחרית. כדי להכין עמודה, השתמשו בפינצטה להחדרת פקק צמר ממש מעל החלק הצר ביותר של קצה פיפטת פסטור; השתמשו בخرזי G 1 למיצוי חומצות אורגניות ובخرזי G 50.

עבור מיצוי חומצות אמינו, מלאו כל עמודה עד לכשליש מגובה העמודה. אם הדגימה כבר נמצאת ב-pH ניטרלי, אין להוסיף דבר לדגימה לפני יישCומה על עמודת AG 1. כדי למצות חומצות אורגניות לצורך מיצוי חומצות אמינו, הוסיפו מיליליטר אחד של חומצה כלורית 0.1 normal לדגימה לפני יישומה על עמודת AG 50.

כעת יש להעביר את הדגימות המנוטרלות שהוכנו קודם לכן לכל עמודה. שטפו כל עמודה 10 פעמים במים עד שהשטיפות יהיו ניטרליות. לאחר סיום השטיפה, בצעו אלוציה מכל עמודה אל תוך מבחנות דגימה זכוכיתיות נקיות ומסומנות בנפח ארבעה מיליליטר. לצורך מיצוי חומצות אורגניות, הוסיפו שלושה מיליליטר של חומצה כלורית בריכוז 3N לעמודת AG 1.

דבר זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופית במספר הכולל של פחמנים מסומנים בין מיני פחמן בעלי שלושה פחמנים, ארבעה פחמנים, חמישה פחמנים וששה פחמנים. לצורך מיצוי חומצות אמינו, הוסף שלושה מיליליטרים של ammonium hydroxide בריכוז 4N לעמודת G 50. דבר זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופית במספר הכולל של פחמנים מסומנים בין מיני פחמן בעלי שלושה פחמנים וחמישה פחמנים.

עם השלמת מיצויי החומצות האורגניות וחומצות האמינו, העבירו את מבחנות הדגימות למאיץ אידוי (evaporator) למשך לילה עד שיהיו יבשות. לאחר מכן, הדגימות מנחזות ומנותחות באמצעות GCMS כמפורט בטקסט הפרוטוקול. התחילו הליך זה על ידי העברת אלף תולעים צעירות בוגרות לצלחת NGM בקוטר 35 מילימטר המכילה גלוקוז מסומן באופן אוניברסלי ב-carbon 13 וחיידקי e coli.

לאחר מכן, הניחו את פיתח ה-NGM הניסויי ללא המכסה שלו, בתוך תא זכוכית בהתאמה אישית המצויד עם ברז תלת-כיווני אטום היטב, כדי לאפשר דגימה והחלפה מדויקת של האטמוספירה. כסו את האטם שבו מונחת דיסקיות הזכוכית השקופה אופטית על הפיתח בעזרת גריז לוואקום גבוה.

אטמו את התא באמצעות דיסקית הזכוכית. רשמו את הזמן. כנקודת זמן אפס, לאחר 30 דקות, השתמשו במזרק של 20 milliliter כדי לדגום 10 milliliter של האטמוספירה מתא הזכוכית באמצעות ברז התthree-way stop cock.

סגור את הברז למסוף של התא. לאחר הדגימה, העבר את הדגימה למבחנה מזכוכית בואקום עם פקק אדום המכילה מיליליטר אחד של sodium bicarbonate ב-0.1 molar sodium hydroxide. לאחר מכן, הזרק 10 milliliters של אוויר לתוך תא הזכוכית דרך הברז התלת-כיווני. באמצעות מזרק של 20 milliliter, סגור את הברז למסוף של התא. לאחר הזרקת האוויר מחדש ולפני חידוש הדגירה, חזור על דגימת האטמוספירה מתא הזכוכית בדקות 60, 90 ו-120.

נתחו דגימות אלו של פחמן דו-חמצני אטמוספרי כדי לבדוק העשרה של פחמן מסומן באמצעות ספקטרומטר מסות של יחס גזים כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. איזוטופים יציבים נספגו היטב לאחר שעתיים בתולעים בוגרות צעירות, כפי שמעיד כאן הפחמן המסומן שנמדד בפחמן דו-חמצני אטמוספרי ובפחמן דו-חמצני מומס בתולעים שהוזנו ב-OP 50 e coli חיים או כאלה שהורגו על ידי קרינת UV. היחס בין פחמן דו-חמצני עם carbon 13 לפחמן דו-חמצני עם carbon 12 היה גבוה יותר בפרקציית הפחמן דו-חמצני המומס של התולעים ביחס לפחמן דו-חמצני האטמוספרי ששוחרר. נצפה כי חשיפה ממושכת לאיזוטופ יציב החל מהשלב הזחלי, ולאחר מכן ניקוי של התולעים על NGM Aate ללא חיידקים, הגבירו את ההעשרה האיזוטופית של גלוטמט חופשי בתולעים בוגרות צעירות.

בגרף זה, L1 מייצג תולעים שהוזנו בגלוקוז מסומן אוניברסלית ב-carbon 13 ובחיידקי OP 50 משלב הלרוקה L1 ועד לשלב הבוגר הצעיר 959 cell. YA מייצג תולעים שהוזנו בגלוקוז מסומן ב-carbon 13 ובחיידקי OP 50 למשך 48 שעות, החל מהרגע שהגיעו ליום הראשון של השבצת ביצים בשלב הבוגר הצעיר. ציר ה-x מציין את המספר הכולל של אטומי פחמן מסומנים בכל סוג של גלוטמט, וציר ה-y מציין את אחוז ההעשרה. כל החיות נוקו מתג סימון איזוטופי עודף לפני הכנת הדגימות להמשך התהליך.

בניתוחי GCMS, הפסים הירוקים מצביעים על תולעים שנוקו לאחר חשיפה איזוטופית באמצעות האכלה עם OP 50 E coli על מצעי NGM למשך שעתיים לפני מיצוי PCA. הפסים הכחולים והאפורים מצביעים על תולעים שנוקו לאחר חשיפה איזוטופית על מצעי NGM ללא בקטריות למשך שתי שעות או שש שעות, בהתאמה, לפני מיצוי PCA, ללא קשר למשך זמן החשיפה האיזוטופית. לא נצפה הבדל משמעותי בהעשרה האיזוטופית של מטבוליטים ביניים כאשר בעלי החיים נוקו על מצעים למשך שעתיים או שש שעות.

בשני מסלולי החשיפה האיזוטופית, נצפתה העשרה איזוטופית מועטה יותר במטבוליטים ביניים כאשר בעלי החיים ננקו על ידי האכלת חיידקים לא מסומנים למשך שעתיים. לפיכך, נקבע כי פרוטוקול הניקוי האופטימלי עבור תולעים שגודלו על פלטות NGM עם פריסת חיידקים ואיזוטופ הוא ניקוי למשך שעתיים על פלטות NGM ללא פריסה, כדי למקסם את אחוז ההעשרה במטבוליטים ביניים. זאת לאחר טיפול של 24 שעות בתרבית נוזלית עם גלוקוז סימון פחמן 13 במיקום שש, ללא חיידקים.

בוצעה השוואה בין דגימות תולעים שהופרסו באמצעות סוניקציה בלבד לבין דגימות שהופרסו באמצעות סוניקציה בתוספת גריסה, כפי שמוצג בדמות זו. לתולעים שהופרסו באמצעות סוניקציה בתוספת גריסה היה העשרה איזוטופית גבוהה יותר מאשר לדגימות שהופרסו באמצעות סוניקציה בלבד. לבסוף, הזנת תולעים חיות עם קדם-חומר איזוטופי יציב, או במהלך התפתחות משלב L1 על צלחות או החל מהיום הראשון של הנחת ביצים כבוגרים צעירים למשך 24 שעות בתרבית נוזלית, אפשרה ניתוח רגיש של העשרה איזוטופית בקרב מטבוליטים המעידים על שטף דרך גליקוליזה ומטבוליזם של פירוביה במחזור חומצה טריקרבוקסילית לאחר התפתחותם.

טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים על מחלות מיטוכונדריאליות כדי לבחון זרימה מטבולית של תוצרי ביניים ב-*C. elegans*. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע פרופיל איזוטופי יציב של חילוף חומרים של תוצרי ביניים וזרימה מטבולית בנמטודות, ה-*C. elegans*.