פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)
4 ביולי 2007
גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.
אני לינדסיי גרבר, דוקטורנטה במעבדה של ד"ר ג'ורג' דימיפולוס בבית הספר לבריאות הציבור של ג'ונס הופקינס. אני אראה לכם כיצד לבצע השתקה של גנים באמצעות RNAi באמצעות טכניקת הזרקה. השלב הראשון הוא איסוף היתושים שבהם נשתמש להזרקה.
אלו הם פשוט זבובים מסוג Gabi. זהו תערובת של זכרים ונקבות. וזהו השואב שלנו המופעל על ידי סוללה.
בתוכו מותקן מאוורר, אשר יוצר יניקה השואבת את היתושים למעלה דרך פיה זו אל תוך מיכל זה. לכן אנו מנתקים מהחשמל. יש לנו דלת גישה קטנה, שבדרך כלל סגורה בסרט דביק כדי להחזיק את היתושים בפנים, אך אנו פותחים אותה ומכניסים את הפיה, מפעילים את המכשיר ומשתמשים בו לאיסוף.
לאחר שהיתקינו את היתושים בפנים, אנו חוסמים את חלקו העליון של הפיה ורואים את היתושים שם במיכל. לאחר מכן, עלינו להרדימ את היתושים הללו. לשם כך, נטמיע את המיכל בדלי קרח, נכסה אותו בקרח ונמתין עד שהיתושים יירגעו.
בשלב הבא נזריק למשקים, ולשם כך נשתמש במכשיר NanoJet II. המכשיר מורכב מחלק של מוט, שאותו אחזיק, ובתוכו תהיה המחט שתחלק את הנוזל אל תוך היתוש.
לוח הבקרה, שבו נמצאים כפתורי המילוי והריקון, האחראי על שאיבת נוזל אל תוך המחט וממנה. וזהו הדום. הוא יונח על הרצפה.
דחיפה של המכשיר בעזרת הרגל תטמיע טיפה אחת בנפח המתאים לתוך היתוש. בזמן שהיתושים נמצאים על קרח, אנו מכינים את תחנת העבודה על ידי הגדרת בלוק קירור לטמפרטורה של 0°C עד 2°C. לבלוק קירור זה יש אביזר הצמדה שטוח, שעליו מורכבת זכוכית מיקרוסקופ.
וזה ימנע מהיתושים לזוז בזמן שאנו מנסים לתפעל אותם. אקח גם אחת ממחטי הנימיות מזכוכית הללו. זוהי פשוטה צינור נימה רגיל מזכוכית שחומם ונמשך במרכזו כדי ליצור מחט.
וכאן יישמר הנוזל שלנו. ואז זהו הכלי שבו נשתמש כדי להזריק ליתוש ולהוציא את הנוזל. לכן, הדבר הבא שעלינו לעשות הוא להניח את מחט הנימי על מוט ההזרקה שלנו.
אנו מסירים את ראש המיקרוסקופ (nose piece). ודאו כי הטבעות הפנימיות ממוקמות בהתאם להוראות היצרן. החליקו את מחט הזכוכית מטה לתוך ראש המיקרוסקופ, תוך זהירות עם הקצה כדי למנוע את שבירו.
לאחר שהקיבוע מאובטח, החליקו את מחט המוט (wand) אל תוך מחט הנימיה והבריגו את חלק האף בחוזקה. השלב הבא הוא לוודא שרוחב המחט של צינור הנימיה מתאים להזרקות. זוהי נקודה חשובה מאוד, שכן מחט דקה מדי לא תוציא את כמות הנוזל הנכונה, ונקודת מחט עבה מדי תפגע ביתוש ועלולה לגרום למותו.
זהו תהליך שדורש תרגול רב, אך רוחב מתאים הוא למעשה קריטי להזרקה תקינה ולהישרדות של היתושים. מה שאני עושה הוא להשתמש בפינצטה בעלת חוד דק כדי לשבור את קצה המחט, כך שהמחט תישאר גמישה אך יציבה. אנו זקוקים לדגימת ה-RNA דו-גדילי שלנו.
דגימה זו הוכנה באמצעות ערכה. קיימות בשוק ערכות מגוונות שיכולות להפיק RNA דו-גדילי סטנדרטי ספציפי לגן המבוקש. אנו משתמשים ב-RNAs שלנו בריכוז של שלושה מיקרוגרם למיקרוליטר, והגדרנו את המזרק הננו-מטרי (nano inject) כך שהזרקה אחת תפלוט 69 ננוליטרים.
החדירו את המחט אל תוך הנוזל והשתמשו בכפתור המילוי (fill) ולאחר מכן בכפתור הפליטה (eject) כדי לשאוב נוזל אל תוך המחט. כמות הנוזל הדרושה במחט פרופורציונלית למספר היתושים שיוחלקו. בסדר? וכעת עלינו להכין את היתושים.
כעת ניקח את צלחת הפלסטיק בגודל P2 ונניח אותה בתוך דלי קרח. נוודא שהיתושים אינם זזים ונפרוס אותם בשכבה דקה על גבי פטריית השקירה הקרה. פעולה זו מבטיחה שבמהלך העבודה היתושים לא יזוזו ולא יעופו מסביב.
לאחר מכן נמקם את היתושים על גבי שקופית הזכוכית שלנו, שנמצאת כעת בטמפרטורה של 0 °C. מיקום היתושים הוא קריטי עבור אופן ההזרקה. לכן, יש לסדר את היתושים בשורה מסודרת, כדי שתוכלו לדעת אילו מהם הוזרקו ואילו לא.
כמו כן, יש להבטיח שיהיה מרווח מספיק בין היתושים כדי שתוכלו להגיע אליהם עם המזרק. לכן, אנו מעבירים יתושים בודדים מכלית הפטרי (peewee dish) לעלית הזכוכית, תוך הקפדה על טיפול בהם באמצעות הרגליים. פעולה זו מונעת מעיכה של הגוף ומובילה לשיעור הישרדות גבוה יותר.
כעת אנו מוכנים להזרקה. אנו משתמשים בפינצטה בעלת קצה עדין כדי לתמוך ביתוש מצד אחד; אני ימני, לכן אני מחזיק אותה ביד שמאל. לאחר מכן אנו מזריקים מהצד השני, תוך החדרת קצה המחט לצד החזה (thorax), כך שחזהו של היתוש לחוץ בין קצות הפינצטה לבין חוד המחט בעת חדירתו.
ברגע שחוד חוד המחט נמצא בתוך החזה, לחצו על דוושת הרגל; תשמעו צפצוף ונוזל יוזרק לחזה היתוש. לאחר מכן, עברו ליתוש הבא וחזרו על הפעולה. מדי פעם, בעת משיכת המחט, תראו טיפה של נוזל שיצא מאתר ההזרקה.
ובמידה וזה קורה, ניתן להמתין עד שהנוזל ייספג בחזרה לאתר החדירה. אם זה קורה, הדבר תקין. אם הטיפה אינה נספגת חזרה, ואם הטיפה נשארת על החלק החיצוני של הטורקס (thorax), יש להשליך את היתוש הזה ולהזריק במקומו יתוש אחר.
חשוב גם לוודא שהמחט חודרת לחזה רק עד המרחק הדרוש. אין לדקור עד לצד השני או לאפשר לחלק רחב מדי מהמחט לעבור דרך הרקמה. הדבר יפגע בחזה או בהישרדות היתוש.
נמשיך בביצוע ההליך עבור כל היתושים כפי שנדרש. לאחסון היתושים המוזרקים, השתמשנו בכוס קרטון עם ציפוי שעווה בנפח פיינט אחת, שכוסיסה ברשת דקה והודקה באמצעות גומייה ומכסה קרטון. פתחנו את פתח הגישה המכוסה בסרט דביק והוספנו בזהירות את היתושים שלנו כדי לסייע להישרדותם.
יש להוסיף פתיל צמר שספג תמיסת סוכרוז 10% המשמשת כמקור מזון עבור היתושים בזמן שהם נמצאים בפנים, וכן נייר סופג מקופל ולח. מכיוון שליתושים פגועים יש נטייה להתייבש, הדבר יעזור לשמור על הלחות ויסייע להישרדות היתושים שהוזרקו.
נכסה זאת במכסה של פטרי כדי למנוע אידוי ולהבטיח שהנייר הסופג וכדורי הצמר יישארו רטובים. לאחר מכן, נדגרי את הדגימה בתנאים סביבתיים מבוקרים. הקינטיקה המולקולרית של השתקת גנים המתווכת על ידי RNAi משתנה במידה ניכרת מגן לגן.
לפיכך, עבור גנים מסוימים, השתיקה יכולה להתרחש בתוך יום אחד, ועבור גנים אחרים, שתיקה יעילה לא תתרחש במשך מספר ימים. ניתן למדוד את ההבדלים בין כל גן באמצעות quantitative real-time PCR, שיבצע ניטור של רמות התמלילים בתוך היתושים שלכם ויגלה לכם מתי השגתם שתיקה יעילה. לכן, אני ממליץ להפריש מספר יתושים מוזרקים למטרה זו.
פעולה זו תסייע לכם לקבוע באופן כללי עד כמה ה-RNAs דו-גדיליים שלכם יעילים, והאם ה-RNAs דו-גדיליים הספציפיים שלכם יכולים להשיג השתקה יעילה. ואם אתם אכן משפיעים על רמות התמלל, הראיתי לכם כעת את הפרוצדורה להשתקת גנים באמצעות RNAi ביתושי *Anopheles gambiae*. פרוצדורה זו כוללת הזרקה מיקרוסקופית של RNAs דו-גדיליים לחזה של יתושי *Anopheles gambiae*.
הליך זה חשוב מכיוון שהוא אחת הדרכים הקלות והיעילות ביותר למניפולציה של גנים בודדים ביתושים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מדגים שיטה להשתקה גנטית באמצעות RNAi ביתושי Anopheles gambiae, המשמשים כווקטורים למלריה. הטכניקה כוללת הזרקת dsRNA לחזה היתושים כדי לחקור תפקוד גנים הקשור לעמידות לנשאי מחלות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה של וקטורים
רקע
- גישות גנטיות הפוכות הן חיוניות להבנת תפקודי גנים.
- עמידות למפתחים של פתוגנים היא קריטית לבקרת המלריה.
- Anopheles gambiae הוא וקטור מרכזי להעברת המלריה.
- הפרעת RNA (RNAi) היא כלי רב עוצמה להשתקת גנים.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטה להזרקת dsRNA לתוך יתושים.
- לבחינת הבסיס הגנטי של עמידות לפתוגנים של מלריה.
- לספק פרוטוקול לחוקרים הבוחנים ביולוגיה של וקטורים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף של יתוש Anopheles gambiae.
- הכנת dsRNA להזרקה.
- שימוש במשאב (aspirator) המופעל על ידי סוללה לטיפול ביתושים.
- הזרקת dsRNA לחזה של היתושים.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של טכניקת הזרקה מוצלחת.
- פוטנציאל להשתקת גנים ביתושים המטרה.
- ניתן להשתמש בשיטה כדי לחקור תפקוד גנים הקשורים לעמידות למלריה.
- הפרוטוקול מספק בסיס למחקרים עתידיים בבקרה על וקטורים.
מסקנות
- שיטת ההזרקה יעילה למחקרי RNAi ביתושים.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של הביולוגיה של וקטורי המלריה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה כדי לחקור תפקודי גנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
פרוטוקול זה מאפשר בחינה תפקודית של גנים ב-Anopheles gambiae, וקטור מרכזי של המלריה, ובכך תומך בתיקוף מטרות במחקרי מחלות המועברות על ידי וקטורים. באמצעות ייזום knockdown באמצעות RNAi, הוא מסייע בהפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות הקשורות למנגנוני עמידות של פתוגנים. השיטה מספקת גישה ניתנת להרחבה לסריקה פנוטיפית במודלים של חרקים הרלוונטיים למסלולי מו"פ של בריאות עולמית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השתקה של גנים ספציפיים כדי להעריך את תפקידם במסלולי עמידות לנפתוגנים.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הניתנת לשחזור לתיקוף פונקציונלי של מטרות במודלים של יתושים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור תפקוד הגן לפנוטיפים של כשירות וקטורית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצרי ביטוי גנים כמותיים באמצעות qPCR למדידת יעילות השתיקה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הולכת dsRNA באמצעות נפחי הזרקה מדויקים בננו-ליטרים.
- יכולת הרחבה: מאפשר הכנה של קבוצות יתושים מוזרקים לסריקות גנטיות או של תרכובות בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מקשר בין תוצאות השתקת גנים לבין פנוטיפים של אינטראקציה עם טפיל המלריה.
- המשכיות מודל המחלה: תומך בהערכה פרה-קלינית של מטרות במערכת חרקים הרלוונטית לפתוגן.
- קידום מותאם סיכונים: מספק מידע לתיעדוף מטרות בהתבסס על השפעה תפקודית על קיבולת הווקטור (vectorial capacity).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ומאפשרת תיקוף של מטרה טרם פיתוח הבדיקה והערכה פרה-קלינית במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות השתקה ספציפית של גנים ביתושים בוגרים.
- מוכנות לסריקה: מספקת תוצאים כמותיים וסטנדרטיים (למשל, הפחתת תמלול) להערכת מווסתים גנטיים או כימיים.
- אנליטיקה: מייצרת משתנים תלויים מדידים (רמות ביטוי גנים) באמצעות qPCR להשוואת תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: שומרת על רצף בין תפקוד גנתי לתוצאות פנוטיפיות במודלים של וקטורים הרלוונטיים למלריה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת הזרקת RNAi הניתנת לשימוש חוזר לצורך בחינה איטרטיבית של מטרות בפרויקטים של ביולוגיה של וקטורים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתפקוד הגן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של הרדמה, הזרקה והחלמה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת ראיות תפקודיות לרלוונטיות של המטרה לעמידות נגד פתוגנים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס השפעה פנוטיפית במודלים מאושרים של מחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ביתושיות, במיקרו-הזרקה ובהכנת ריאגנטים ל-RNAi.
- תלוי בציוד של ננו-מזרק, בהכנת קפילריות זכוכית ובשמירה על שרשרת קירור להבטחת חיויות היתושיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של ריכוז ה-dsRNA, נפח ההזרקה ותנאי הדגירה לאחר ההזרקה.
- כולל שיקולי התאמה בין מיני יתושים, זנים ושלבי התפתחות שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון קינטיקת השתקה משתנה ותמותה הקשורה להזרקה המשפיעים על התפוקה.
