Name: פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: למד שתיקת גנים מבוססת RNAi ביתושים Anopheles gambiae באמצעות הזרקת dsRNA לחזה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את הבסיס הגנטי של עמידות למלריה ולפתח אסטרטגיות לבקרת וקטורים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RNAi בתיווך להשתקת גנים ב יתושים דורש הכנה מוקדמת של טיהור dsRNAs ספציפי כי היעד הגן של עניין. לסינתזה dsRNA, אנו ממליצים על ערכת Megascript Ambion אשר עושה שימוש T7-RNA פולימראז בתיווך בתגובה שעתוק במבחנה. עבור טיהור dsRNA, אנו ממליצים על ערכת RNeasy Qiagen. דוגמאות dsRNA יש לכמת והותאמו 3 מיקרוגרם / μL במים. חומרים אחרים תצטרך לכלול: קנס שקצהו מלקחיים, שקופיות זכוכית, מחטים זכוכית microcapillary, microinjector (אנו משתמשים Nanoject דראמונד השני), מיקרוסקופ אור רכוב מעל גוש קר, צלחת מכוסה פטרי מזכוכית, מגבות נייר דלי קרח . אתה גם צריך דרך לאסוף יתושים מיכל מתאים להם יחד עם מקור מזון כמו כדור צמר גפן טבול סוכרוז 10%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף יתושים שלך. שימוש aspirator סוללות, לאסוף את היתושים אתה רוצה להזריק. חברו את הפייה עם מגבת נייר או כותנה כך היתושים לא יכולים לברוח ולהסיר את המאגר. מאז בטמפרטורות קרות להרדים יתושים, לקבור את המאגר בתוך דלי של קרח לחכות 5-10 דקות עבור היתושים להפסיק לזוז. הרדמה יכול גם להיות מושגת על ידי הצבת המאגר בחדר מקרר או קר או באמצעות ה-CO 2. במהלך אלה 5-10 דקות, המשך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת אזור העבודה שלך. הגדר בלוק משטח שטוח קר 2 ° C ו במקום שקופיות הזכוכית על זה. זה המקום שבו היתושים ינוחו כמו שאתה להזריק אותם. צרף מחט זכוכית אל microinjector ולהשתמש מלקחיים שלך לשבור את קצה המחט לרוחב הרצוי. חשוב הרוחב הוא גדול מספיק כדי לאפשר מספיק מקום נוזל לזרום בקצב סביר אך צר מספיק כדי לפצוע מינימלי במהלך ההזרקה. חוד המחט טוב יהיה צר מספיק כדי לכופף מעט אך לא להישבר. סט ציוד הזרקה שלך נפח את הפלט הרצוי (עבור RNAi, אנו משתמשים 69 NL). להטביע את קצה המחט לתוך המדגם שלך לצייר מדגם נוזל לתוך מחט באמצעות הוראות היצרן. דגימת נוזל יכול להיות פתרון dsRNA, השעיה חיידקי או אחרים; תהליך ההזרקה זהה עבור כל. הטמע צלחת פטרי זכוכית בדלי קרח כך התחתון של המנה לחלוטין פנייה קרח. זה המקום שבו תוכלו לשים יתושים עד שאתה מוכן להזרים אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יתושים שלך. 50-100 יתושים העברה מן המאגר כדי בצלחת פטרי מזכוכית. שימוש במלקחיים שלך דק אותם בשכבה אחת, מוודא ביותר במגע עם תחתית קר המנה לשמור אותם בהרדמה. מכסים אלה יתושים עם צלחת מכסה כאשר אינו בשימוש. חזור אל המאגר דלי הקרח כדי לשמור את שאר היתושים בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר יתושים על גוש קר. השתמש מלקחיים קנס שקצהו שלך להעביר את היתושים אחד בכל פעם מצלחת לשקופית זכוכית רכוב על לחסום את הקור תחת מיקרוסקופ אור. גע בעדינות יתושים, רצוי על ידי הרגליים. הקו עד כ -30 יתושים Side-by-הצד בשקופית, כדי לוודא שאתה יכול להגיע כל אחד עם microinjector ולוודא שכל אחד יוצר קשר עם השקופית הקרה. ודא יתושים שלך מסודרים מסודר כך כמו שאתה הולך יחד אתה יודע שיש להם ואשר לא היה מוזרק. השאירו יתושים אחרים מכוסה בצלחת פטרי צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הקבוצה הראשונה שלך של יתושים. החזק מלקחיים קנס שקצהו שלך היטה ביד אחת להחזיק את microinjector ביד אחרים כמו עיפרון. השתמש במלקחיים להעביר את יתוש כמו שאתה צריך (לטפל בהם על ידי הרגליים כדי למנוע פציעה) ולשמור היתוש יציב כמו שאתה מזריק. זה עובד הכי טוב אם משתמשים במלקחיים כדי לתמוך בצד אחד של יתוש כפי שאתה להזריק מהצד השני. בזהירות להכניס רק קצה מחט לתוך בית החזה של יתוש. עדיף להזריק לתוך חלק מתוח עדיין דקה של לציפורן כדי למזער את הפגיעה. כמו כן, להימנע הזרקת עמוק מדי, אתה רוצה רק קצה להיות בתוך בית החזה, זריקות לגרום לפצעים עמוקים יותר אשר תתפשר הישרדות. לאחר חוד המחט נמצאת בעמדה, לחץ ושחרר את דוושת הרגל של המנגנון microinjector אשר יספקו נפח שנקבע מראש שלך dsRNA. חכה שנייה או שתיים ומסירים את המחט מן היתוש. אם טיפה של נוזל מופיע מחוץ לאתר את הפצע, לחכות כמה שניות זה להיספג לתוך הפצע. אם זה לא לספוג תוך מספר שניות, להשליך כי יתושים ונסה שוב. המשך תהליך ההזרקה לכל יתושים בשקופית זכוכית שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות יתושים שלך. כשתסיים, מקום יתושים מוזרק שלך בתוך מכולות שכותרתו (אנו מעדיפים 1 ליטר מצופה שעווה כוסות קרטון מכוסה על ידירשת רשתות מאובטחות עם גומיות מכסה הקרטון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך זריקות עד המוגמר. המשך למקום יתושים בשקופית, להזריק ולהעביר כוסות עד שיש לך את גודל המדגם הרצוי לך. חשבון של כמה מקרי מוות, למתחילים יהיה יתושים רבים מתים הטראומה של הזרקה. זה ישפר עם התרגול עד כמעט 100% של יתושים שלך לשרוד זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, במקום מגבת מקופלת, נייר רטוב על כוס יחד עם מקור מזון לכסות את כוסות עם משהו כדי לשמור על לחות כגון בניילון נצמד או מכסה פלסטיק פטרי. יתושים מוזרק נוטים להתייבש כך את הלחות המסופקים על ידי מגבת רטובה שמורה בידי הפלסטיק יעזור למנוע זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום יתושים שלך בתא מבוקרת לסביבה הדגירה. </li></ol> הערה: יעילות של השתקת הגן משתנה מאוד ותלוי במספר גורמים, כולל תמליל וחלבון להתהפך שיעורי, יעילות ספיגת dsRNA על ידי תאים ואיברים. מצאנו כי ההשתקה מתחיל מוקדם ככל הזרקה 1 שלאחר יום, יכול להימשך עד 6 ימים שלאחר הזריקה. השתמש תמליל וחלבון שיטות זיהוי כגון PCR כמותי ומערב סופג כדי לאמת את ההשתקה. הערה: יש כמה וריאציות על מספר שלבים של הזריקה יתושים RNAi בתיווך השתקת הגן טכניקה. כמה וריאציות מתוארים על ידי: Boisson, et al (2006) ו Blandin, et al (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

יעילות של השתקת הגן משתנה מאוד ותלוי במספר גורמים, כולל תמליל וחלבון להתהפך שיעורי, יעילות ספיגת dsRNA על ידי תאים ואיברים. מצאנו כי ההשתקה מתחיל מוקדם ככל 1 שלאחר הזרקת יום והוא יכול להימשך עד 6 ימים שלאחר הזריקה. השתמש תמליל וחלבון שיטות זיהוי כגון PCR כמותי ומערב סופג כדי לאמת את ההשתקה.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>ערכה</td><td>Ambion</td><td></td><td>לסינתזת dsRNA; תגובת שעתוק in vitro בתיווך T7 RNA polymerase</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>לניקוי dsRNA</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>יש לכמת ולהתאים לריכוז של 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L במים</td></tr><tr><td>פינצטה בעלת קצה דק</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית עבור מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטי מיקרוקפילריה מזכוכית</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td></td><td></td><td></td><td>מותקן מעל בלוק קירור</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td></td><td></td><td></td><td>מכוסה, מזכוכית</td></tr><tr><td>נייר סופג</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% סוכרוז</td><td>מזון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>בעל חיים</td><td></td><td></td><td>יתושים</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול מבחני rnai ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

גישות של גנטיקה הפוכה הוכחו כמועילות ביותר לקביעת הגנים העומדים בבסיס העמידות לפני פתוגנים המועברים על ידי וקטורים בבזנזים. סרטון זה...

אני לינדסיי גרבר, דוקטורנטה במעבדה של ד"ר ג'ורג' דימיפולוס בבית הספר לבריאות הציבור של ג'ונס הופקינס. אני אראה לכם כיצד לבצע השתקה של גנים באמצעות RNAi באמצעות טכניקת הזרקה. השלב הראשון הוא איסוף היתושים שבהם נשתמש להזרקה.אלו הם פשוט זבובים מסוג Gabi. זהו תערובת של זכרים ונקבות. וזהו השואב שלנו המופעל על ידי סוללה.בתוכו מותקן מאוורר, אשר יוצר יניקה השואבת את היתושים למעלה דרך פיה זו אל תוך מיכל זה. לכן אנו מנתקים מהחשמל. יש לנו דלת גישה קטנה, שבדרך כלל סגורה בסרט דביק כדי להחזיק את היתושים בפנים, אך אנו פותחים אותה ומכניסים את הפיה, מפעילים את המכשיר ומשתמשים בו לאיסוף.לאחר שהיתקינו את היתושים בפנים, אנו חוסמים את חלקו העליון של הפיה ורואים את היתושים שם במיכל. לאחר מכן, עלינו להרדימ את היתושים הללו. לשם כך, נטמיע את המיכל בדלי קרח, נכסה אותו בקרח ונמתין עד שהיתושים יירגעו.בשלב הבא נזריק למשקים, ולשם כך נשתמש במכשיר NanoJet II. המכשיר מורכב מחלק של מוט, שאותו אחזיק, ובתוכו תהיה המחט שתחלק את הנוזל אל תוך היתוש.לוח הבקרה, שבו נמצאים כפתורי המילוי והריקון, האחראי על שאיבת נוזל אל תוך המחט וממנה. וזהו הדום. הוא יונח על הרצפה.דחיפה של המכשיר בעזרת הרגל תטמיע טיפה אחת בנפח המתאים לתוך היתוש. בזמן שהיתושים נמצאים על קרח, אנו מכינים את תחנת העבודה על ידי הגדרת בלוק קירור לטמפרטורה של 0°C

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הטכניקות כללי המשמש האחורי אנופלס gambiae במעבדה. שיטות עבור הטיפול יתושים מעבדה הם הפגינו לאורך כל שלבי מחזור החיים של האורגניזם מ זחלים וגלמים אל על דם האכלה מבוגרים.

פרוטוקול לגידול יתושים (א gambiae)

בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים...

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

ניתוחי RNA-Seq הופכים חשובים יותר ויותר לזיהוי היסודות המולקולריים של תכונות הסתגלות באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, מתואר פרוטוקול לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין יתושי Aedes albopictus שאינם דיאפאוזה, מגידול יתושים, ועד לריצוף RNA וניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני RNA-Seq.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, אדס המפוספס

ליתושים המעבירים מלריה יש מספר מאפיינים חשובים מבחינה אפידמיולוגית שניתן לזהות רק באמצעות טכניקות מולקולריות. תוך שימוש בפלטפורמת גנוטיפ SNP מבוססת MALDI-TOF, פיתחנו בדיקה לזיהוי בו-זמנית של תכונות מפתח מרובות (מינים, עמידות לקוטלי חרקים, זיהום טפילים ובחירת מארח) של וקטורים למלריה.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית היא כלי רב-תכליתי לשינוי ביטוי גנים באופן ספתיוטמפורלי מבוקר המאפשר ניתוח גנטי תפקודי בגמביה אנופלס. ההליכים המתוארים לשימוש במערכת זו הם אסטרטגיית שיבוט סטנדרטית למחצה, סקס וסינון של גלמים עבור סמני חלבון פלואורסצנטיים קיבעון עובר.

שימוש במערכת GAL4-UAS לגנטיקה תפקודית בגמביה אנופלס

פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.

PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית

מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

למד שתיקת גנים מבוססת RNAi ביתושים Anopheles gambiae באמצעות הזרקת dsRNA לחזה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את הבסיס הגנטי של עמידות למלריה ולפתח אסטרטגיות לבקרת וקטורים.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

גלה סרטונים נוספים